吳尚蓉，鄭勇，卓儒紅，何柳，胡成俊*

（1武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系；2武漢大學(xué)中南醫(yī)院綜合醫(yī)療科，武漢，430071）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)（Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）具有自我更新和分化成多種細(xì)胞譜系的特性[1-3]，并且具有來(lái)源廣泛、易于分離培養(yǎng)和免疫調(diào)節(jié)作用等特點(diǎn)[4]，這些特性使其成為組織工程和再生醫(yī)學(xué)中的種子細(xì)胞。然而，BMSCs像其它正常體細(xì)胞一樣體外壽命有限，在經(jīng)過(guò)一定數(shù)量的細(xì)胞分裂后，BMSCs進(jìn)入生長(zhǎng)停滯的復(fù)制性衰老狀態(tài)[5]。隨著B(niǎo)MSCs進(jìn)入衰老的狀態(tài)，BMSCs逐漸喪失多向分化的能力，這既不利于組織的更新和修復(fù)，也是阻礙BMSCs臨床應(yīng)用的重要瓶頸[6,7]。因此，需要進(jìn)一步闡明BMSCs的衰老機(jī)制，探討延緩BMSCs衰老的可能的方法，這對(duì)基于BMSCs的治療和組織工程的應(yīng)用具有重要的價(jià)值。

細(xì)胞衰老是一個(gè)包括氧化應(yīng)激、端粒異常、染色體損傷和細(xì)胞自噬等多種細(xì)胞分子事件共同參與的復(fù)雜生物現(xiàn)象[7,8]，根據(jù)衰老的發(fā)生是否與端?？s短有關(guān)，可以分為復(fù)制性衰老和應(yīng)激性衰老兩種類型。衰老的細(xì)胞雖然出現(xiàn)細(xì)胞周期的停滯，但是細(xì)胞的新陳代謝還在繼續(xù)[8]。以往對(duì)應(yīng)激性衰老的研究發(fā)現(xiàn)，衰老細(xì)胞中自噬活性的增強(qiáng)起到穩(wěn)定衰老狀態(tài)的作用[9]。然而，自噬對(duì)復(fù)制性衰老的影響和具體調(diào)控機(jī)制仍然不甚明確。

自噬能夠清除異常的蛋白質(zhì)和受損的細(xì)胞器，從而維持細(xì)胞的能量代謝以利于細(xì)胞的存活[10]。異常的蛋白質(zhì)和損傷的線粒體主要由活性氧（reactive oxygen species, ROS）的積累引起[11,12]。ROS是氧化應(yīng)激反應(yīng)中的重要誘導(dǎo)因子，過(guò)度積累的ROS會(huì)破壞細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，引起多種氧化應(yīng)激損傷和線粒體的功能障礙[13]。有報(bào)道指出，衰老BMSCs中ROS含量增加[14]。自噬可以通過(guò)清除ROS損傷的線粒體和蛋白質(zhì)，減輕ROS導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷[15]。本研究旨在探討自噬對(duì)BMSCs復(fù)制性衰老的調(diào)控作用，分析自噬對(duì)ROS的調(diào)控與BMSCs復(fù)制性衰老的關(guān)系。

材料和方法

1 材料

雄性Sprague-Dawley大鼠，110～150g，購(gòu)自武漢大學(xué)動(dòng)物中心。5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu）、雷帕霉素（rapamycin, Rap）購(gòu)自Selleck公司；巴佛洛霉素A1（ba fi lomycin A1, BaF1)購(gòu)自Cayman Chemical公司；細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；RT-PCR試劑盒購(gòu)自Bimake公司；LC3I/II一抗購(gòu)自CST公司；Brdu一抗、Cy3標(biāo)記的羊抗小鼠IgG二抗均購(gòu)自武漢博士德生物公司；活性氧檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗購(gòu)自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司；引物均由武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成。

2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)以及體外衰老模型的建立

參照本實(shí)驗(yàn)室已有的方法[16]，全骨髓貼壁法獲得大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，標(biāo)記為P0，置于37℃，5%的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3d后首次換液，后期每2～3d換一次液以去除未貼壁的雜細(xì)胞，細(xì)胞70%～80%融合后用含有EDTA的0.25%胰蛋白酶消化傳代。待細(xì)胞傳到第6代時(shí)，分別以400nmol/L BaF1和400nmol/L Rap處理24h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3 細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)細(xì)胞衰老情況

六孔板中細(xì)胞長(zhǎng)到70%～80%融合時(shí)，按照衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行染色，在37℃孵育過(guò)夜，光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野計(jì)數(shù)半乳糖苷酶陽(yáng)性細(xì)胞的比率。

4 5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu）摻入法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

將細(xì)胞接種到24孔板，待細(xì)胞達(dá)到70%融合時(shí)，加入Brdu（終濃度10mmol/L）孵育24h后，棄掉培養(yǎng)基，PBS洗3次，加入固定液（甲醇：乙酸=3：1）后于-20℃固定20min，PBS洗3次，1mol/L HCl冰上變性30min，2mol/L HCl 37℃變性30min。Brdu一抗（1:150）室溫孵育2h，PBST洗3次，Cy3標(biāo)記的羊抗小鼠IgG二抗（1:800）孵育1h，PBST洗3次后DAPI（1:1000）染核5min，在熒光顯微鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞的比率。

5 Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況

待細(xì)胞長(zhǎng)到80%融合時(shí)，將細(xì)胞用胰酶消化下來(lái)后，用含有PMSF的RIPA裂解液于冰上裂解30mim。樣品的蛋白濃度用BCA試劑盒測(cè)定。樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上后，5%脫脂牛奶封閉1h，分別加入一抗LC3I/II（1:1000），GAPDH（1:5000），4℃孵育過(guò)夜，TBST洗3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1:5000），室溫孵育1h，TBST洗3次后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影蛋白條帶。

6 實(shí)時(shí)熒光定量qPCR檢測(cè)衰老和自噬相關(guān)基因的表達(dá)情況

用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，按照說(shuō)明書的操作方法用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。各引物序列見(jiàn)表1。qPCR反應(yīng)條件：預(yù)變性：95℃ 5min，變性：95℃ 5s，退火：56℃ 30s，延伸：72℃ 20s，40個(gè)循環(huán)。采用2－ΔΔCt法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

7 DCFH-DA染色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）

表1 定量引物序列Tab. 1 Primer sequence

待細(xì)胞70%～80%融合時(shí)，用胰酶將細(xì)胞消化下來(lái)，PBS洗一遍后離心，加入1ml稀釋的DCFH-DA染液，37℃培養(yǎng)箱中孵育20min，使探針與細(xì)胞充分接觸。PBS洗3次后，用PBS重懸，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)DCFH-DA熒光，其熒光強(qiáng)度反映胞內(nèi)活性氧（ROS）的水平。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Prism5軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05時(shí)表示具有顯著性差異。

結(jié) 果

1 第6代BMSCs進(jìn)入復(fù)制性衰老狀態(tài)

通過(guò)分析BrdU摻入率，SA-β-gal染色陽(yáng)性率和衰老相關(guān)基因（p21Waf1和p16ink4a）的表達(dá)確定BMSCs的衰老狀態(tài)。與第二代（passage 2, P2）的BMSCs比較，P6細(xì)胞大多扁平寬厚，形態(tài)不規(guī)則；細(xì)胞增殖停滯，Brdu摻入率由P2細(xì)胞的80%降低到10%（圖1A）。通過(guò)SA-β-gal染色，發(fā)現(xiàn)在P6 BMSCs有90%的細(xì)胞的核周呈現(xiàn)藍(lán)色（SA-β-gal染色陽(yáng)性）染色（圖1B）。在P6 BMSCs，衰老相關(guān)基因p21Waf1和p16ink4amRNA表達(dá)水平較在P2 BMSCs明顯升高（圖1C）。這些結(jié)果說(shuō)明BMSCs在培養(yǎng)至P6時(shí)即進(jìn)入了復(fù)制性衰老的狀態(tài)。

2 衰老BMSCs自噬活性增強(qiáng)

為了觀察體外連續(xù)傳代培養(yǎng)BMSCs自噬活性的變化，利用qPCR和Western blot檢測(cè)自噬基因的表達(dá)情況。與P2 BMSCs比較，P6 BMSCs自噬相關(guān)基因ATG12 mRNA的表達(dá)水平明顯升高（圖2A），自噬特征性蛋白LC3II/LC3I比值也明顯升高(圖2B)。這些結(jié)果說(shuō)明體外連續(xù)培養(yǎng)BMSCs發(fā)生復(fù)制性衰老時(shí)伴隨著自噬活性增強(qiáng)。

3 衰老BMSCs氧化應(yīng)激增強(qiáng)

應(yīng)用DCFH-DA染色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的含量，觀察細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的改變。DCFH-DA染色結(jié)果顯示，與P2 BMSCs比較，P6 BMSCs的熒光強(qiáng)度較P2細(xì)胞明顯增強(qiáng)（圖3）。由此提示，體外連續(xù)培養(yǎng)BMSCs發(fā)生復(fù)制性衰老時(shí)，伴隨著氧化應(yīng)激水平增強(qiáng)。

4 衰老BMSCs自噬活性的增強(qiáng)可促進(jìn)衰老相關(guān)基因表達(dá)

為了分析復(fù)制性衰老的BMSCs自噬活性的改變與衰老基因表達(dá)的關(guān)系，我們使用自噬抑制劑巴佛洛霉素A1（BaF1)和自噬激活劑雷帕霉素（Rap）處理P6 BMSCs。結(jié)果顯示，與未作處理的P6組相比，BaF1處理組的自噬流被阻斷（圖4A），自噬相關(guān)基因ATG12 mRNA和衰老相關(guān)基因p21Waf1、p16ink4amRNA表達(dá)水平降低（圖4B）；而Rap處理組ATG12 mRNA表達(dá)水平和LC3II/LC3I蛋白比值均明顯升高（圖4C, D），且衰老相關(guān)基因p21Waf1和p16ink4amRNA表達(dá)水平升高（圖4E）。由此提示，自噬活性的增強(qiáng)可促進(jìn)BMSCs復(fù)制性衰老的進(jìn)程。

5 衰老BMSCs自噬活性增強(qiáng)能降低細(xì)胞ROS含量

為了觀察復(fù)制性衰老BMSCs（P6 BMSCs）自噬活性的改變對(duì)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響，P6 BMSCs在分別經(jīng)過(guò)BaF1和Rap處理后，通過(guò)DCFHDA染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與未作處理的P6 BMSCs相比，BaF1處理組熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，ROS含量增加，而Rap處理組熒光強(qiáng)度減弱（圖5），ROS含量減低。由此提示，在復(fù)制性衰老BMSCs中自噬參與細(xì)胞中ROS含量的調(diào)節(jié)。

討 論

圖1 體外連續(xù)培養(yǎng)對(duì)BMSCs增殖能力及衰老的影響。 A，BrdU摻入法檢測(cè)P2和P6 BMSCs的增殖能力； B，SA-β-gal染色法檢測(cè)P2和P6 BMSCs的衰老情況；C，qPCR檢測(cè)p21Waf1和p16ink4a mRNA的表達(dá)水平； *，與P2 BMSCs比較，0.01＜P＜0.05；比例尺：A，100μm；B，250μmFig. 1 The proliferation and aging of BMSCs during continuous in vitro culture. A, Brdu incorporation assay was performed to compare the proliferative ability of BMSCs at P2 and P6; scale bar, 100μm; B, SA-β-gal staining comparison between passage 2 and 6; scale bar, 250μm; C, qPCR analysis of p21Waf1 and p16ink4a mRNA levels; *, 0.01＜P＜0.05, compared with P2 BMSCs

圖2 體外連續(xù)培養(yǎng)BMSCs時(shí)自噬相關(guān)蛋白和基因的變化。A，qPCR檢測(cè)ATG12 mRNA的表達(dá)水平；B， LC3I/II水平Western blot檢測(cè)（B1）及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（B2）；*，與P2 BMSCs比較，0.01＜P＜0.05Fig. 2 The changes of aging related gene and protein expressions in BMSCs during continuous in vitro culture. A, qPCR analysis of Atg12 mRNA levels;B, Western blot detection of LC3I/II and statistical analysis (B2); *, 0.01＜P ＜0.05, compared with P2 BMSCs

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在細(xì)胞治療和組織工程中有很大的應(yīng)用潛力[17,18]。但由于BMSCs會(huì)經(jīng)歷復(fù)制性衰老，這對(duì)BMSCs的廣泛使用是極其不利的。在本研究中，我們通過(guò)在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)BMSCs來(lái)獲取復(fù)制性衰老的BMSCs，在培養(yǎng)BMSCs至P6時(shí)，BMSCs增殖停滯，且呈現(xiàn)出寬大而扁平的細(xì)胞形態(tài)，SA-β-gal染色顯示P6染色陽(yáng)性率達(dá)到90%，并且在P6細(xì)胞中p21Waf1和p16ink4amRNA的表達(dá)水平也較P2 BMSCs明顯升高。按照以往衰老研究標(biāo)準(zhǔn)，在本研究中的P6 BMSCs已經(jīng)進(jìn)入復(fù)制性衰老的狀態(tài)。

圖3體外連續(xù)培養(yǎng)BMSCs時(shí) ROS含量的變化。A，流式細(xì)胞術(shù)分析DCF熒光強(qiáng)度；B， DCF熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*，與P2 BMSCs比較，0.01＜P＜0.05Fig. 3 The changes of intracellular ROS during continuous culture of BMSCs in vitro; A, flow cytometry analysis of DCF fl uorescence intensity; B,statistical analysis of DCF fl uorescence intensity; *, 0.01＜ P ＜0.05, compared with P2 BMSCs

圖4 自噬活性對(duì)P6 BMSCs衰老相關(guān)基因表達(dá)影響的檢測(cè)。 A，Western blot檢測(cè)BaF1組LC3I/II表達(dá)；B，qPCR檢測(cè) BaF1組p21Waf1和p16ink4a mRNA表達(dá)水平的變化；C，qPCR檢測(cè)Rap組ATG12 mRNA的表達(dá)；D，Western blot檢測(cè)Rap組LC3I/II表達(dá)； E，qPCR檢測(cè)Rap組p21Waf1和p16ink4a mRNA的表達(dá)情況；*，與P2 BMSCs比較，0.01＜P＜0.05Fig. 4 The effect of autophagy on aging-related gene expression in P6 BMSCs. A, Western blot analysis of LC3 in BMSCs treated with BaF1; B, qPCR analysis of p21Waf1 and p16ink4a mRNA level changes in response to BaF1 treatment; and C, ATG12 mRNA level changes after Rap treatment; D, Western blot analysis of LC3 in BMSCs treated with Rap; E, qPCR analysis of p21Waf1 and p16ink4a mRNA levels in BMSCs treated with Rap; *, 0.01＜ P ＜0.05,compared with P2 BMSCs

細(xì)胞在進(jìn)入衰老狀態(tài)后，雖然發(fā)生細(xì)胞周期的阻滯，但細(xì)胞代謝并沒(méi)有停止。其中自噬參與的代謝在細(xì)胞由增殖狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樗ダ蠣顟B(tài)時(shí)起重要作用[19,20]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)BMSCs至P6時(shí)，自噬相關(guān)基因ATG12 mRNA的表達(dá)水平升高，自噬特征性蛋白LC3II/LC3I比值也明顯升高，表明自噬機(jī)制也參與BMSCs復(fù)制性衰老的過(guò)程。以往的研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs自噬活性的降低能夠延緩細(xì)胞進(jìn)入衰老狀態(tài)[16]。為了進(jìn)一步分析自噬活性在BMSCs復(fù)制性衰老過(guò)程中的作用，我們采用自噬抑制劑BaF1和自噬激活劑Rap對(duì)P6 BMSCs進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)在BaF1處理后，自噬流發(fā)生阻斷，同時(shí)衰老相關(guān)基因p21Waf1和p16ink4amRNA的表達(dá)水平明顯降低；在Rap處理組，ATG12 mRNA的表達(dá)和LC3II/LC3I的比值增加，p21Waf1和p16ink4amRNA表達(dá)水平也增加。因此在復(fù)制性衰老的BMSCs中，自噬對(duì)其衰老狀態(tài)的建立起重要的調(diào)控作用，通過(guò)抑制自噬可以在一定程度上緩解BMSCs的衰老狀態(tài)。

圖5 自噬活性對(duì)衰老 BMSCs細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響。A，流式細(xì)胞術(shù)分析DCF熒光強(qiáng)度；B，DCF熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；*，與P2 BMSCs比較，0.01＜P＜0.05Fig. 5 Effect of autophagy on ROS accumulation in P6 BMSCs. A, flow cytometry analysis of DCF fl uorescence intensity; B, statistical analysis of DCF fl uorescence intensity in P2 and P6 BMSCs; *, 0.01＜ P＜0.05, compared with P2 BMSCs

細(xì)胞衰老的發(fā)生與ROS的關(guān)系密切，Banaban發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ROS含量的增加是BMSCs衰老的重要原因[21]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)BMSCs至P6時(shí)，伴隨BMSCs進(jìn)入復(fù)制性衰老狀態(tài)，細(xì)胞ROS的含量增加，說(shuō)明ROS很可能是BMSCs發(fā)生復(fù)制性衰老的一個(gè)重要原因。以往研究發(fā)現(xiàn)自噬能降解氧化損傷蛋白和降低ROS含量從而有利于氧化應(yīng)激條件下的細(xì)胞存活[22]，并且自噬缺陷時(shí)ROS產(chǎn)生增多導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生DNA損傷[23,24]。為了進(jìn)一步探討自噬對(duì)衰老的調(diào)控機(jī)制，在自噬抑制劑BaF1和自噬激活劑Rap對(duì)P6 BMSCs進(jìn)行處理后，我們觀察了ROS的改變。研究發(fā)現(xiàn)用BaF1處理后，ROS含量增加，這可能是由于抑制自噬活性影響異常蛋白質(zhì)和線粒體的清除的原因[25]。在Rap處理組，伴隨著激活自噬后對(duì)異常蛋白質(zhì)和損傷線粒體的清除能力增強(qiáng)[25]，ROS的積累減少。一般情況下，細(xì)胞內(nèi)ROS含量的降低能夠緩解細(xì)胞的衰老狀態(tài)，而在本研究中在對(duì)P6 BMSCs用Rap處理后，衰老相關(guān)基因的表達(dá)增加，但ROS含量反而減低；BaF1處理組BMSCs出現(xiàn)衰老相關(guān)基因表達(dá)降低，但ROS含量反而升高。這說(shuō)明在復(fù)制性衰老的過(guò)程中，自噬對(duì)復(fù)制性衰老具有一定調(diào)節(jié)作用，雖然復(fù)制性衰老伴有ROS含量的增加，但自噬活性對(duì)衰老的調(diào)控并不是完全通過(guò)ROS機(jī)制。

在本研究中，我們?cè)诮MSCs復(fù)制性衰老模型的基礎(chǔ)上，探討了自噬在BMSCs復(fù)制性衰老中的作用機(jī)制。伴隨BMSCs復(fù)制性衰老的進(jìn)程，細(xì)胞內(nèi)自噬活性增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)ROS的含量增加。在我們對(duì)自噬進(jìn)行抑制和促進(jìn)后發(fā)現(xiàn)復(fù)制性衰老的進(jìn)程和ROS的含量的變化并不一致，這說(shuō)明自噬活性對(duì)BMSCs復(fù)制性衰老有一定的調(diào)節(jié)作用，但是其調(diào)控并不是完全通過(guò)ROS機(jī)制。通過(guò)解釋BMSCs復(fù)制性衰老過(guò)程中自噬的具體作用機(jī)制能夠讓我們更好的認(rèn)識(shí)衰老的本質(zhì)，自噬對(duì)BMSCs復(fù)制性衰老的具體調(diào)控機(jī)制也是我們下一步深入研究的方向。

[1] Barry FP, Murphy JM. Mesenchymal stem cells: clinical applications and biological characterization. Int J Biochem Cell Biol, 2004, 36(4): 568-584.

[2] Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, et al. Minimal criteria for de fi ning multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.Cytotherapy, 2006, 8(4): 315-317.

[3] Paniushin OV, Domaratskaia EI, Starostin VI. Mesenchymal stem cells: sources, phenotype, and differentiation potential.Izv Akad Nauk Ser Biol, 2006, 33(1): 6-25.

[4] Mareschi K, Ferrero I, Rustichelli D, et al. Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow. J Cell Biochem, 2006, 97(4): 744-754.

[5] Wagner W, Horn P, Castoldi M, et al. Replicative senescence of mesenchymal stem cells: a continuous and organized process. PLoS One, 2008, 3(5): e2213.

[6] Bonab MM, Alimoghaddam K, Talebian F, et al. Aging of mesenchymal stem cell in vitro. BMC Cell Biol, 2006, 7(1):14.

[7] Baxter MA, Wynn RF, Jowitt SN, et al. Study of telomere length reveals rapid aging of human marrow stromal cells following in vitro expansion. Stem Cells, 2004, 22(5): 675-682.

[8] Campisi J, D’Adda DFF. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nat Rev Mol Cell Biol, 2007,8(9): 729-740.

[9] Narita M, Young AR, Narita M. Autophagy facilitates oncogene-induced senescence. Autophagy, 2009, 5(7): 1046-1047.

[10] Ureshino RP, Rocha KK, Lopes GS, et al. Calcium signaling alterations, oxidative stress, and autophagy in aging. Antioxid Redox Signal, 2014, 21(1): 123-137.

[11] Chakrabarti S, Jahandideh F,Wu J. Food-derived bioactive peptides on in fl ammation and oxidative stress. Biomed Res Int, 2014, 2014: 608979.

[12] Knight JA. Diseases related to oxygen-derived free radicals.Ann Clin Lab Sci, 1995, 25(2): 111-121.

[13] Li L, Tan J, Miao Y, et al. ROS and Autophagy: Interactions and Molecular Regulatory Mechanisms. Cell Mol Neurobiol, 2015, 35(5): 615-621.

[14] Ksiazek K. A comprehensive review on mesenchymal stem cell growth and senescence. Rejuvenation Res, 2009, 12(2):105-116.

[15] Li L, Tan J, Miao Y, et al. ROS and Autophagy: Interactions and Molecular Regulatory Mechanisms. Cell Mol Neurobiol, 2015, 35(5): 615-621.

[16] Zheng Y, Hu CJ, Zhuo RH, et al. Inhibition of autophagy alleviates the senescent state of rat mesenchymal stem cells during long-term culture. Mol Med Rep, 2014, 10(6): 3003-3008.

[17] Fukuda K, Sakamoto N, Narita T, et al. Application of effi-cient and speci fi c gene transfer systems and organ culture techniques for the elucidation of mechanisms of epithelial-mesenchymal interaction in the developing gut. Dev Growth Differ, 2000, 42(3): 207-211.

[18] Bruder SP, Kurth AA, Shea M, et al. Bone regeneration by implantation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells. J Orthop Res, 1998, 16(2): 155-162.

[19] Narita M, Narita M, Krizhanovsky V, et al. A novel role for high-mobility group a proteins in cellular senescence and heterochromatin formation. Cell, 2006, 126(3): 503-514.

[20] Young AR, Narita M, Ferreira M, et al. Autophagy mediates the mitotic senescence transition. Genes Dev, 2009, 23(7):798-803.

[21] Balaban RS, Nemoto S, Finkel T. Mitochondria, oxidants,and aging. Cell, 2005, 120(4): 483-495.

[22] Xiong Y, Contento AL, Nguyen PQ, et al. Degradation of oxidized proteins by autophagy during oxidative stress in Arabidopsis. Plant Physiol, 2007, 143(1): 291-299.

[23] Kodama R, Kato M, Furuta S, et al. ROS-generating oxidases Nox1 and Nox4 contribute to oncogenic Ras-induced premature senescence. Genes Cells, 2013, 18(1): 32-41.

[24] Ramsey MR, Sharpless NE. ROS as a tumour suppressor?Nat Cell Biol, 2006, 8(11): 1213-1215.

[25] Mizushima N, Levine B, Cuervo AM, et al. Autophagy fi ghts disease through cellular self-digestion. Nature, 2008,451(7182): 1069-1075.