潘靜嫻, 宋韻瓊, 崔麗潔*

(1.上海師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,上海200234;2.上海市閔行區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心,上海 201109)

不結(jié)球白菜(Brassicacampestrisssp.chinensisMakino)屬十字花科蕓薹屬蕓薹種白菜亞種,包括普通白菜、烏塌菜、菜薹、薹菜、分蘗菜和白菜型油菜6個變種[1],前5個變種為菜用種質(zhì),白菜型油菜為油用種質(zhì).不結(jié)球白菜在南方稱為青菜或菘,北方稱作油菜,是我國特有的、深受消費者喜愛的重要綠葉類蔬菜,有明顯的雜種優(yōu)勢.在長江中下游各城市,它的年均消費量都占到全年蔬菜消費總量的30%～40%,僅上海全年播種面積就達1×104hm2[2].此外,北方也大量引種,而且近年來,已逐漸成為了世界性的蔬菜[3].無論是在生產(chǎn)還是研究領(lǐng)域,不結(jié)球白菜都受到了廣泛關(guān)注,已在基因克隆、遺傳圖譜、DNA分子標(biāo)記輔助育種、抗性育種等種質(zhì)創(chuàng)新以及資源管理方面取得了很多進展[3-7].本文就不結(jié)球白菜在種質(zhì)創(chuàng)新中的成果、研究進展、研究動態(tài)以及存在的問題進行了總結(jié)和綜述,以期為不結(jié)球白菜種質(zhì)創(chuàng)新和科研方向的選擇提供一些參考和建議.

1 不結(jié)球白菜種質(zhì)資源創(chuàng)新研究

1.1 耐熱抗病蟲和晚抽薹育種

不結(jié)球白菜是喜冷涼的兩年生蔬菜,食用部位為營養(yǎng)體,但市場需求要求實現(xiàn)周年生產(chǎn).因此,快速生長、耐熱抗寒、耐抽薹、抗病蟲害是種質(zhì)創(chuàng)新的主要目標(biāo).耐熱不結(jié)球白菜在南方地區(qū)夏季栽培蔬菜中占有重要地位.該地區(qū)夏季高溫多雨時間長達3～4個月,極端高溫可達40 ℃,因此耐熱抗暑濕育種就成為重要的育種目標(biāo).通過誘變形成多倍體是獲得抗性材料的重要方式[8],早在2002年,王亦菲等[9]用Co-γ射線照射不結(jié)球白菜小葉青干種子,經(jīng)芽選獲得了耐熱突變體.而鄧云等[10],徐麗娟等[11],韓業(yè)飛等[12]則是采用秋水仙堿分別誘導(dǎo)上海青、不結(jié)球白菜依伶和六合矮腳黃,也獲得了耐熱性好的同源四倍體材料.受多基因控制的耐熱性狀目前更多采用雜交育種方式得到,如江蘇農(nóng)科院培育的“東方2號”和“ 熱矮001”,南京理想農(nóng)業(yè)科技有限公司的“烤青”和“ 青伏令”,南京農(nóng)業(yè)大學(xué)的“熱火1號”和“熱火2號”,南京綠領(lǐng)種業(yè)有限公司的“綠領(lǐng)1407”,上海市閔行區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心的“閔青101”[13],日本武藏野種苗園株式會社的“華王”“ 夏王”“ 華冠”和“金夏蒔”等.此外,利用不結(jié)球白菜和耐熱大白菜雜交選育抗熱的不結(jié)球白菜也是一種新方法[4].

耐抽薹性是不結(jié)球白菜,尤其是普通白菜和塌菜兩個變種的重要農(nóng)藝性狀.除制種外,抽薹越晚,生產(chǎn)性越好,食用價值也越高.利用雜交優(yōu)勢是選育晚抽薹品種的主要方法,如“京綠7號”是上海地方品種“五月慢”和北京地方品種“四月慢”的雜交后代[14],其農(nóng)藝性狀顯著優(yōu)于主栽品種“四月慢”和“五月慢”.此外,不少晚抽薹雜交品種相繼育成,如江蘇農(nóng)科院培育的“青優(yōu)”和“ 春佳”,北京京研益農(nóng)科技有限公司的“春油1號”和“春油2號”等.它們在生長過程中,始終不抽薹[15].今后,繼續(xù)選育適合冬春季栽培的晚抽薹品種仍是種質(zhì)創(chuàng)新研究的方向之一.

春末到初秋的病蟲害是不結(jié)球白菜生產(chǎn)中的主要難點.尤其是各種蟲害,如菜青蟲、甜菜夜蛾、斜紋夜蛾、黃曲條跳甲、小菜蛾和蚜蟲等,如果不使用農(nóng)藥,將導(dǎo)致幼苗無法存活,成株失去商品價值.而農(nóng)藥的使用會帶來食品安全問題,因此培育抗病蟲,尤其是抗蟲的不結(jié)球白菜,是育種研究的重要方向和難點.在抗蕪菁花葉病毒(TuMV)問題上,南京農(nóng)業(yè)大學(xué)早期利用系譜和母系選擇相結(jié)合的方法,育成了“矮抗I號”,后來利用雜交育種選育了“矮抗”IV～VI.針對十字花科根腫病這個世界性病害,目前主要是對根腫病基因分子標(biāo)記[5]、抗性生理及鑒定[16-17]和抗性誘導(dǎo)[18]的研究,抗性育種并不多見.抗蟲育種雖然也有一些品種面世,如上海不結(jié)球白菜的主栽品種,由閘北區(qū)彭浦鄉(xiāng)農(nóng)科站選育的“上海605”,以及上海農(nóng)科院選育的“新夏青”和“矮抗青”等,但采用常規(guī)種質(zhì)創(chuàng)新技術(shù)的進展總體不大,許多研究者轉(zhuǎn)而尋找轉(zhuǎn)基因手段.

1.2 胞質(zhì)雄性不育體系的研究

國外關(guān)于不結(jié)球白菜細胞質(zhì)雄性不育雜交種選育的報道很少[19],國內(nèi)的相關(guān)報道主要有隱性核不育兩用系[20]、蘿卜質(zhì)不育系[21]、波里馬油菜胞質(zhì)不育系[22]和自交不親和系[19]等,其中自交不親和系是蕓薹屬中運用較廣泛的雜交制種途徑.由于不結(jié)球白菜屬于常異花授粉作物,一般自交結(jié)實正常,因此在不結(jié)球白菜中很難獲得優(yōu)良的自交不親和系,而要通過蕾期剝蕾授粉才能獲得自交不親和系,制種成本很高.因而,借助胞質(zhì)雄性不育特性的種間轉(zhuǎn)移就成為低成本利用雜交優(yōu)勢育種的重要途徑,且目前取得了一定成果.莊靜等[23]于1989年,在甘藍型油菜中的細胞質(zhì)雄性不育系中,通過種間雜交和回交,將不育性轉(zhuǎn)入到普通白菜中,育成了普通白菜雄性不育系.后經(jīng)配制雜交組合,育成了雜交新組合“8008”,品種審定名為“滬青雜1號”.它是第一個利用普通白菜胞質(zhì)雄性不育系選育的雜交種.陳龍正等[24]利用1份胞質(zhì)雄性不育的“蘇州青”,轉(zhuǎn)入到江蘇農(nóng)科院核心材料“90”中,也獲得了不育系“90-2”,并進行了分子鑒定.沈火林等[25]將甘藍型油菜中的胞質(zhì)雄性不育特性轉(zhuǎn)育到11個不結(jié)球白菜品種中,獲得了3份異源胞質(zhì)雄性不育系和其保持系,不育率達到了100%.另外,用秋水仙堿誘導(dǎo)二倍體后,再與不育四倍體雜交創(chuàng)建四倍體不結(jié)球白菜雄性不育材料,再轉(zhuǎn)育也是獲得不育品種的方法,如不育系“署1”[26],不育率達95%以上.更多不結(jié)球白菜不育材料的出現(xiàn)為不結(jié)球白菜雜種優(yōu)勢的利用提供了便捷的途徑.

胞質(zhì)雄性不育有一定的生長缺陷,如苗期低溫黃化[27]、花器形態(tài)不正常[24]等,因此,通過進行不同水平的鑒定,篩選得到生長健壯、高不育性的不育系和保持系十分必要,前人也做了不少工作.鄧曉輝等[28]對不結(jié)球白菜Polima胞質(zhì)雄性不育系及其保持系的DNA基因組進行了random amplified polymorphism DNA (RAPD)分析,研究了兩系間的遺傳多樣性,并在不育系中獲得了一條穩(wěn)定的sequence-characterized amplified region(SCAR)標(biāo)記.周國林等[6]通過檢索美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)核苷酸數(shù)據(jù)庫,獲得orf138和orf224開放閱讀框序列,設(shè)計了兩對引物,對小白菜和菜薹胞質(zhì)雄性不育系和保持系進行了聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)擴增,鑒定了該雄性不育為甘藍型油菜不育類型.朱紅芳等[29]利用葉綠素?zé)晒饧夹g(shù),研究了不結(jié)球白菜雄性不育系和保持系不同時期的熒光參數(shù),證實了不育系和保持系的植物學(xué)性狀僅在生殖生長期存在差異.

1.3 特異性基因克隆和轉(zhuǎn)基因抗性育種

1.3.1 特異性基因分離、克隆和表達分析

尋找和鑒定功能性基因,并進行基因克隆和遺傳改良是分子育種的核心.國內(nèi)不少研究者在這方面做了大量工作,克隆了不少基因,并對這些基因的功能進行了深度挖掘.在抗病基因方面,陳曉峰等[30]利用 rapid-amplification of cDNA ends(RACE)技術(shù),克隆了不結(jié)球白菜防衛(wèi)素基因BcDF1.2的全長序列,經(jīng)序列分析,證實了其與其他植物的防衛(wèi)素基因和抗真菌基因有較高同源性.從被蕪菁花葉病毒感染的不結(jié)球白菜葉片中分離和克隆的BcLRK01基因,在TuMV和高鹽脅迫下,具有高表達特性[31].而從核盤菌感染的不結(jié)球白菜葉片中克隆的BcMPK4基因,在葉片中表達并參與了寄主對核盤菌的抗性[32].其后,更多抗病基因從不結(jié)球白菜中得到分離和克隆,功能也得到相應(yīng)驗證.耐熱基因的挖掘也是不結(jié)球白菜特異性基因研究的重要內(nèi)容.目前,研究者通過分離和克隆得到了不少與耐熱的相關(guān)基因,如熱激蛋白基因HSP家族中最保守的成員HSP70-1,已被從“抗熱蘇州青”中分離出來[33];而從3個耐熱品種“高華青”、“ 蘇州青”和“矮腳黃”中克隆得到了參與熱應(yīng)答的磷脂酶D(PLD)基因[34].除了抗性基因,其他特異性基因,如硝酸還原酶基因[35]、抗壞血酸基因[36]、鋅指類超家族基因[37]、花色苷合成負調(diào)控基因[38]、花粉粒發(fā)育外殼蛋白基因[39],以及晚抽薹基因[40]等,也從不結(jié)球白菜中不斷得到分離和克隆,并進行了基因特征的初步分析.綜上所述,從不結(jié)球白菜中獲得的特異性基因類型多樣,包含抗病、耐熱、品質(zhì)等基因,但未見從不結(jié)球白菜中分離和克隆出抗蟲基因的報道.

1.3.2 轉(zhuǎn)基因抗性育種

不結(jié)球白菜生產(chǎn)中的病蟲害,尤其是蟲害一直是困擾生產(chǎn)的一個難題.生產(chǎn)中主要依賴農(nóng)藥來防治蟲害,但也給食品安全帶來很大風(fēng)險,因此,研發(fā)抗病蟲的不結(jié)球白菜種質(zhì)是解決安全問題的根本途徑.但從傳統(tǒng)的抗性育種來看,并沒有分離和克隆出自身抗蟲的基因,因此,進行分子水平育種,如轉(zhuǎn)基因育種就成為不結(jié)球白菜抗病蟲種質(zhì)創(chuàng)新的關(guān)注焦點.

多年來,利用基因工程技術(shù)進行不結(jié)球白菜定向改良取得了一定成就.轉(zhuǎn)入的外源抗性基因主要有植物凝集素基因[41]、蛋白酶抑制劑基因[42-44]、芪合酶基因[45]、磷霉素和蛋白酶基因[46]和Bt基因[47-48],采用的方法有真空滲入、基因槍等,獲得了普通白菜、菜薹等的轉(zhuǎn)基因植株[49-50],也對轉(zhuǎn)基因材料進行了鑒定[44,47,51].王忠華等[47]對Bt轉(zhuǎn)基因抗蟲青菜株系T2、T4的分析表明,雖然轉(zhuǎn)基因株系的種子遠小于原種“上海青”,后期生長又明顯變慢,但具有發(fā)芽快和苗期生長快的優(yōu)勢,可見Bt基因的插入對萌芽和苗期性狀相關(guān)基因的表達有較大影響.秦新民等[48]將CryIB基因轉(zhuǎn)入白雪小白菜中,獲得了轉(zhuǎn)Bt基因小白菜,CryIB基因得到了表達.鄧智年等[41]利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,將豇豆蛋白酶抑制劑基因CPT1轉(zhuǎn)入中腳黑葉和矮腳黑葉中,獲得了轉(zhuǎn)CPT1的中腳黑葉和矮腳黑葉小白菜,經(jīng)分子鑒定,CPT1基因已整合到小白菜中,小菜蛾飼喂鑒定顯示轉(zhuǎn)化植株具有一定的抗蟲性.盡管在20年前就育成了一些來自遠源物種抗性基因的不結(jié)球白菜轉(zhuǎn)化植株,對蟲害和病害也有一定抗性,但始終還是停留在實驗室和田間鑒定階段,并沒有進行安全性評價和生產(chǎn).

1.4 遺傳圖譜和DNA分子標(biāo)記輔助育種

農(nóng)藝性狀的選擇是種質(zhì)創(chuàng)新的基礎(chǔ),但大多數(shù)農(nóng)藝性狀是數(shù)量性狀,它們不僅受多基因控制,而且還受環(huán)境影響[7].因此,通過表型來選擇優(yōu)良數(shù)量性狀的傳統(tǒng)育種方法存在很大不確定性.而分子標(biāo)記輔助育種(MAS)將這些集中在一條染色體或幾條染色體的某一段的多基因用DNA分子標(biāo)記出來,并確定與之連鎖的數(shù)量性狀在染色體上的位置,再標(biāo)記到遺傳連鎖圖譜上,不需要等待花期或某一特定生長期來進行優(yōu)良植株選擇,從而為實現(xiàn)育種早期定向改良種質(zhì)提供了途徑.

目前已針對許多農(nóng)作物構(gòu)建了以分子標(biāo)記為基礎(chǔ)的遺傳圖譜,通過建立分子遺傳圖譜,可同時對許多重要農(nóng)藝性狀基因進行標(biāo)記.在不結(jié)球白菜遺傳圖譜構(gòu)建中,選擇不結(jié)球白菜的作圖群體是關(guān)鍵,關(guān)系到作圖效率和時間長短.主要利用雙單倍體(DH)群體和F2群體為作圖群體[52-53],再將分子標(biāo)記與連鎖群以及遺傳圖譜匹配.目前,在不結(jié)球白菜遺傳圖譜的構(gòu)建上已獲得了不少成果,如GENG等[54]利用112個DH群體構(gòu)建了不結(jié)球白菜遺傳圖譜,圖譜覆蓋長度為1923.75 cM,包含了14條連鎖群和138個多態(tài)性分子標(biāo)記.CHEN等[55]利用來自雜交小白菜“含笑”的127個DH作圖群體構(gòu)建了不結(jié)球白菜的遺傳圖譜,圖譜覆蓋長度973.38 cM,含10條連鎖群和614個多態(tài)性分子標(biāo)記.RAHUL等[56]利用了48個F2群體構(gòu)建的不結(jié)球白菜遺傳圖譜,覆蓋長度354.6 cM,包含9條連鎖群和53個simple sequence repeats(SSR)標(biāo)記.另外,采用 restriction fragment length polymorphism(RFLP)技術(shù)和改良的SSR標(biāo)記技術(shù)來構(gòu)建連鎖群,并與模式植物擬南芥或者其他近緣種的遺傳圖譜進行比較,也是輔助不結(jié)球白菜遺傳圖譜構(gòu)建的重要手段[52-53].

在構(gòu)建遺傳圖譜的同時,利用分子標(biāo)記輔助育種選擇的親本以及育成的品種也不斷出現(xiàn),從而為不結(jié)球白菜抗性雜交育種如抗病、抗蟲、晚抽薹等創(chuàng)建了優(yōu)良的自交不親和系,也為大田生產(chǎn)提供了優(yōu)質(zhì)的品種資源.如GENG等[54]所用的DH作圖群體“暑綠”,其母本是用分子標(biāo)記技術(shù)從“矮腳黃”中選擇的自交不親和系.CHEN等[55]的研究材料雜交小白菜品種“含笑”,其母本“SW-13”是通過分子標(biāo)記技術(shù)從“矮腳黃”中選擇的自交不親和系.RAHUL等[56]的F2作圖群體,親本“Barharl mandi”就是利用分子標(biāo)記從“喜馬拉雅”中篩選的.因此,隨著對不結(jié)球白菜亞種的更多變種遺傳圖譜的構(gòu)建,分子標(biāo)記輔助育種將創(chuàng)建更多的新種質(zhì)和自交不親和系.

2 不結(jié)球白菜種質(zhì)資源信息管理

獲得優(yōu)良育種材料是種質(zhì)創(chuàng)新的基礎(chǔ)和前提.在不結(jié)球白菜5個菜用變種中,普通白菜、烏塌菜、菜薹、薹菜4個變種,尤其是普通白菜均有數(shù)量龐大的品種.而且市場上同名異種或異名同種的品種普遍存在,品種資源較為混亂,此外,種質(zhì)資源大多分散在全國各地的不同單位,或育種者,或生產(chǎn)者手中,要從中獲得需要的種質(zhì)資源或育種材料是比較困難的.因此有必要建立一個數(shù)據(jù)庫管理系統(tǒng),將不結(jié)球白菜種質(zhì)資源進行信息化管理,通過互聯(lián)網(wǎng)實現(xiàn)數(shù)據(jù)共享,而管理者也適時進行系統(tǒng)更新,就可以為育種工作者、生產(chǎn)者及其他專業(yè)人員提供一個不結(jié)球白菜的大數(shù)據(jù)平臺,有利于不結(jié)球白菜種質(zhì)資源的創(chuàng)新和利用.

不結(jié)球白菜種類繁多,資源的收集是建立數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ),各國都在致力于遺傳資源的收集與保護.中國是不結(jié)球白菜的原產(chǎn)國,在遺傳種質(zhì)保護上更具有重大的責(zé)任.王克娟等[57]對江蘇省的不結(jié)球白菜種質(zhì)進行了收集和整理,截止到1995年,全省的種質(zhì)有196份,包括了不結(jié)球白菜菜用的5個變種.袁華玲等[58]在安徽省收集的116份不結(jié)球白菜種質(zhì),只有普通白菜和塌菜2個變種.侯喜林等[3]在20世紀(jì)80年代收集了白菜類地方種質(zhì)200多份,并記錄了26個農(nóng)藝性狀.宋韻瓊等[59]在全國范圍內(nèi)收集了普通白菜品種資源600種,并進行了種質(zhì)鑒定和數(shù)據(jù)庫的創(chuàng)建.而建于1986年的中國國家種質(zhì)庫截止到2015年收集的不結(jié)球白菜種質(zhì)已達到1392個,占總種質(zhì)數(shù)據(jù)庫資源的4.25%,其中有1215個進入了國家種質(zhì)中期庫[60].針對不結(jié)球白菜中優(yōu)良品種的保護也取得了一定成果,如蘇州市蔬菜研究所收集的各種“蘇州青”就有80多份[61].隨著種質(zhì)的不斷創(chuàng)新以及地方種質(zhì)的不斷出現(xiàn),對不結(jié)球白菜種質(zhì)的收集和鑒定將持續(xù)開展,種質(zhì)的遺傳信息如遺傳圖譜等的收錄將是未來種質(zhì)信息采集的新方向.

借助于網(wǎng)絡(luò)技術(shù)將收集鑒定的種質(zhì)資源進行網(wǎng)絡(luò)化管理是現(xiàn)代種質(zhì)資源管理的發(fā)展趨勢.目前,建立數(shù)據(jù)庫的種質(zhì)主要是普通白菜、烏塌菜和菜薹3個變種,其數(shù)據(jù)庫或是變種的獨立數(shù)據(jù)庫,或是含在蔬菜數(shù)據(jù)庫中的一個子數(shù)據(jù)庫,如普通白菜數(shù)據(jù)庫就只有一個變種的品種資源,屬獨立數(shù)據(jù)庫[59],而在中國作物種質(zhì)信息網(wǎng)(CGRIS)、美國種質(zhì)中心網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)(GRIN)等大型數(shù)據(jù)庫中,不結(jié)球白菜只是園藝作物子數(shù)據(jù)庫的子數(shù)據(jù)庫[62].除種質(zhì)資源信息庫外,也建立了一些不結(jié)球白菜的專題數(shù)據(jù)庫,如病蟲害數(shù)據(jù)庫,LIU等[63]建立的白菜類蔬菜的害蟲綜合管理系統(tǒng)(IPM),就是一個包含白菜類蔬菜害蟲發(fā)生特點到綜合防治獨立模塊的主題數(shù)據(jù)庫.將來有可能建立一個包含不結(jié)球白菜所有種質(zhì)的數(shù)據(jù)庫,并實現(xiàn)真正的全網(wǎng)共享,為種質(zhì)創(chuàng)新、生產(chǎn)和科研教學(xué)提供一個快捷的資源信息平臺.

3 結(jié) 語

不結(jié)球白菜是中國特有的蔬菜種質(zhì)資源,不少種類已成為世界性的蔬菜,受到廣大消費者的喜愛.中國在不結(jié)球白菜種質(zhì)創(chuàng)新如細胞質(zhì)雄性不育、分子標(biāo)記育種以及抗病、晚抽薹育種等方面的研究取得了顯著的成果,育成的一些種質(zhì)在生產(chǎn)中成了主栽品種,但與一些進口種質(zhì)如“日本花王”“夏王”“華冠”等青梗菜相比,在抗病蟲、耐暑濕、生長整齊度、食用性方面還是存在一定差距.不結(jié)球白菜育種資源主要針對普通白菜、塌菜和薹菜,而在薹菜和分蘗菜上的利用相對較少.研究不結(jié)球白菜種質(zhì)創(chuàng)新的單位主要集中在國內(nèi),尤其是南京農(nóng)業(yè)大學(xué)和上海農(nóng)科院在不結(jié)球白菜種質(zhì)基因克隆和測序、分子標(biāo)記輔助技術(shù)等方面的工作遙遙領(lǐng)先[3,23,29-30],并利用細胞質(zhì)雄性不育和DNA分子標(biāo)記輔助技術(shù)育成了不少新種質(zhì),有些已成為生產(chǎn)中的常規(guī)栽培品種.抗蟲育種仍然是抗性育種中的難點,至今還沒有重大突破,未來的育種應(yīng)該以抗蟲為主攻方向,有效解決不結(jié)球白菜從春到秋高溫季節(jié)蟲害嚴(yán)重的問題,實現(xiàn)減農(nóng)藥的不結(jié)球白菜生產(chǎn)目標(biāo).對豐富的不結(jié)球白菜種質(zhì)資源的收集整理、鑒定和信息化管理應(yīng)該加強,廣泛收集農(nóng)家品種資源,挖掘優(yōu)良農(nóng)藝性狀,尤其是抗蟲特性,最終建立一個全球范圍內(nèi)共享的不結(jié)球白菜種質(zhì)數(shù)據(jù)庫.