劉帥 莫俊愷 潘丹陽(yáng) 劉高強(qiáng)，2

（1. 中南林業(yè)科技大學(xué)林業(yè)生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410004；2. 中南林業(yè)科技大學(xué)森林資源生物技術(shù)湖南省國(guó)際科技創(chuàng)新合作基地，長(zhǎng)沙 410004）

桑黃（Phellinus igniarius）屬于擔(dān)子菌亞門(mén)，層菌綱，多孔菌科，木層孔菌屬，又稱桑耳、桑黃菇，是一種珍貴的藥用真菌［1］。桑黃主要寄生于楊、柳、樺、櫟、松等樹(shù)木之上，一般生于桑屬植物上，偶爾也生長(zhǎng)在其他被子植物上，分布較廣泛。我國(guó)桑黃主要產(chǎn)地集中在東北的長(zhǎng)白山林區(qū)，黑龍江省東部烏蘇里江與興凱湖之間，西北地區(qū)陜西與甘肅交界的“子午嶺”自然保護(hù)區(qū)，國(guó)外主要有日本、澳大利亞、韓國(guó)、俄羅斯等國(guó)家。桑黃作為一種具有抗癌護(hù)肝等作用的真菌已經(jīng)引起了許多專家對(duì)其進(jìn)行研究［2-4］。

桑黃具有廣泛的藥理活性，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明桑黃多糖是桑黃主要功效成分。桑黃多糖具有抗腫瘤、抗衰老、抗發(fā)炎、提高免疫力和降血糖等活性［5-6］，尤其在抗腫瘤方面，已經(jīng)被證實(shí)了比靈芝、巴西蘑菇等藥用真菌還有效［7］，且與傳統(tǒng)抗腫瘤藥物聯(lián)用可起到協(xié)同效果［8］，因此得到廣泛關(guān)注。目前主要應(yīng)用于肝炎及癌癥的治療，因其效果顯著，已經(jīng)開(kāi)始人工栽培并批量生產(chǎn)。正因?yàn)樯｜S的藥用和保健功效，使得人們?cè)絹?lái)越重視，這也極大地推動(dòng)了相關(guān)研究和產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)［9］。

1 桑黃多糖的藥理作用研究

1.1 抗腫瘤作用

桑黃是目前國(guó)際上公認(rèn)的生物治癌領(lǐng)域中有效率排在首位的藥用真菌。溫克等［7］比較桑黃、靈芝、阿加里斯茸、PL-2，PL-5（MeSima）4種藥用真菌對(duì)小鼠S180肉瘤和胃癌的抑制作用，結(jié)果表明桑黃的抑癌率最高。桑黃的抗腫瘤作用與其多糖等物質(zhì)有關(guān)［8，10-11］。Li等［12］研究了用桑黃（P. igniarius）中活性多糖PIE對(duì)小鼠肉瘤細(xì)胞S180和肝癌細(xì)胞H22的抑制作用，結(jié)果表明，桑黃多糖PIE能夠顯著抑制S180和H22細(xì)胞的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)小鼠的生命周期，并可顯著提高小鼠體內(nèi)血清IL-2（白細(xì)胞介素-2，Interleukin-2）以及IL-18的水平。由此表明，多糖PIE通過(guò)依賴IL-2細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答以及刺激腫瘤壞死因子-α（TNF-α，Tumor necrosis factor alpha）相關(guān)的抗腫瘤活性來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)。Li等［13］用桑黃中蛋白多糖P1處理肝癌細(xì)胞，可以使細(xì)胞周期阻滯于S期，蛋白組學(xué)分析結(jié)果表明桑黃多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯由鈣網(wǎng)蛋白和p27-cyclin A/D1/ECDK2信號(hào)通路介導(dǎo)，這也是抗腫瘤的機(jī)制。

1.2 抗氧化作用

越來(lái)越多的研究表明抗氧化是預(yù)防衰老的重要步驟。閆景坤等［14］通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究桑黃的體外抗氧化活性發(fā)現(xiàn)桑黃胞內(nèi)多糖具有較好的清除羥基自由基（·OH）、超氧自由基（O2-·）和螯合Fe2+能力，且對(duì)O2-·具有明顯的清除作用。此外，桑黃多糖能保護(hù)線粒體DNA免受活性氧基團(tuán)造成的損傷，以保證線粒體功能正常完整，并對(duì)O2-·、·OH等表現(xiàn)出了很高的清除效率和還原能力［15-16］；王欽博和汪雯翰等［17-19］對(duì)桑黃子實(shí)體中的抗氧化成分進(jìn)行了分離純化，將得到的化合物進(jìn)行清除O2-·、DPPH·（1，1-二苯基-2-苦肼基（自由基），1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）、·OH、NO自由基等抗氧化實(shí)驗(yàn)，分離得到的一種吡喃酮類(lèi)化合物（C25H18O9）在清除自由基及其它抗氧化方面均有顯著活性，對(duì)損傷的PC12神經(jīng)細(xì)胞也有很好的修復(fù)能力，并能延緩其衰老。

1.3 免疫調(diào)節(jié)作用

魏靜等［20］分別給H22荷瘤小鼠高、中、低劑量桑黃多糖，除低劑量組中的TNF-α無(wú)顯著差異外，其他各個(gè)給藥組血清細(xì)胞因子IL-6、IL-2、TNF-α均顯著升高，與對(duì)照組比較，桑黃多糖各劑量組T、B淋巴細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)。結(jié)果表明桑黃多糖對(duì)H22荷瘤小鼠具有一定的抑制作用，其作用機(jī)制可能與免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。李金鳳等［21］研究結(jié)果表明桑黃胞外多糖對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠有一定的治療效果，其作用機(jī)理是桑黃多糖進(jìn)入人機(jī)體后抑制NF-κB（核轉(zhuǎn)錄因子κB）信號(hào)通路，降低TNF-α、IL-1β等基因的轉(zhuǎn)錄水平，并通過(guò)抑制TNF-α、IL-1β、IL-17的表達(dá)，降低輔助性T細(xì)胞（Th細(xì)胞）、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的免疫應(yīng)答能力。

1.4 其他作用

抗疲勞和耐缺氧。郭俊平等［22］進(jìn)行小鼠抗疲勞、耐缺氧能力實(shí)驗(yàn)，用桑黃多糖對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃，得到結(jié)果顯示灌胃桑黃多糖可以顯著延長(zhǎng)小鼠游泳時(shí)間，提高肝糖原儲(chǔ)備，延長(zhǎng)小鼠在缺氧環(huán)境下和亞硝酸中毒環(huán)境下的存活時(shí)間。

護(hù)肝作用。Wang等［4］用硫代乙酰胺（TAA，Thioacetamide）誘導(dǎo)大鼠肝纖維化，發(fā)現(xiàn)共13種蛋白質(zhì)的差異表達(dá)，其蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)表明桑黃多糖通過(guò)下調(diào)鐵相關(guān)自由基的產(chǎn)生來(lái)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、調(diào)節(jié)氨基酸和核酸代謝來(lái)增加谷胱甘肽（GSH）分泌，以達(dá)到抗肝纖維化作用。

2 桑黃多糖的提取方法

2.1 溶劑浸提法

桑黃多糖的浸提法包括熱水浸提法、稀酸提取法和稀堿提取法等。

水浸提法往往用水作為溶劑浸取多糖，將原料在恒溫水浴上回流浸提過(guò)濾后得濾液和濾渣，濾渣反復(fù)浸取幾次后合并濾液，并經(jīng)濃縮和乙醇沉淀及離心后干燥即得到粗多糖［23］。酸浸提取法主要適用于酸溶性多糖的浸提，其整個(gè)浸提過(guò)程都是在酸性條件下完成的，將原料和酸性溶液混合后在恒溫水浴中浸提一定時(shí)間，再用堿中和后進(jìn)行過(guò)濾，濾渣用酸液反復(fù)浸提后合并濾液濃縮，并經(jīng)醇沉和分離及洗滌脫水干燥后即得到粗多糖［24］。堿浸提取法主要適用于堿溶性多糖的浸提，其具體操作過(guò)程與酸浸提法類(lèi)似［25］。

這3種方法為桑黃多糖的傳統(tǒng)提取法，該法簡(jiǎn)單易行、設(shè)備要求低、適合大批量生產(chǎn)，但多糖得率低、提取溫度高、時(shí)間長(zhǎng)、易破壞多糖結(jié)構(gòu)、資源耗費(fèi)大［26-27］。

2.2 酶提取法

由于熱水浸提法比較費(fèi)時(shí)且效率低，而酸堿提取法又極易破壞多糖的空間結(jié)構(gòu)及其活性，因此目前多采用酶法進(jìn)行提取。

酶解法為加入一定量的蛋白酶、果膠酶和纖維素酶等，通常與超聲波法、微波法等結(jié)合，簡(jiǎn)稱“協(xié)同提取法”。此法是先通過(guò)超聲波或微波作用增加桑黃菌絲的破碎，之后加入酶將細(xì)胞壁進(jìn)一步酶解，從而提高多糖的溶出率，對(duì)桑黃胞內(nèi)多糖的提取效果較好［28］。張嵐等［29］采用復(fù)合酶法提取干巴菌多糖，并通過(guò)響應(yīng)面法分析得到最優(yōu)參數(shù)為酶解時(shí)間64 min，料液比1∶40（mg/L），復(fù)合酶濃度0.47%，在此條件下干巴菌多糖提取率為17.87%，提取效果最優(yōu)。程偉等［30］以桑黃（P. igniarius）子實(shí)體為材料，對(duì)超聲波協(xié)同纖維素酶法提取桑黃多糖工藝進(jìn)行了優(yōu)化研究。結(jié)果表明，較適宜提取工藝條件為纖維素酶1%，超聲溫度54℃，pH 5.1，超聲時(shí)間39 min，超聲功率240W，在此優(yōu)化條件下，桑黃多糖得率可達(dá)5.30%。酶解法的優(yōu)點(diǎn)在于條件溫和、無(wú)污染、提取率高、時(shí)間短、雜質(zhì)易去除、負(fù)化學(xué)反應(yīng)少，但易受價(jià)格和酶解時(shí)間的影響，降低成本是影響其工業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵［31］。

2.3 超聲波提取法

超聲波提取法是通過(guò)振蕩、空化，促進(jìn)細(xì)胞周?chē)纬晌⒘?，增加溶劑穿透力，破壞?xì)胞壁結(jié)構(gòu)，提高細(xì)胞膜及細(xì)胞壁的通透性以達(dá)到高效提取多糖的方法。此方法提取量大、快速高效、污染小、溫度低、成本低，能夠有效避免長(zhǎng)時(shí)間高溫對(duì)多糖引起降解和活性變化，而且超聲波儀自動(dòng)化程度高，適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)［30-32］。

徐海峰等［33］以靈芝子實(shí)體為原材料，采取溶劑浸提、超聲波法和微波法對(duì)靈芝多糖進(jìn)行提取，結(jié)果表明超聲波法提取效果最佳，當(dāng)料液比1∶20，提取時(shí)間30 min，提取溫度60℃，多糖提取率達(dá)1.714%。傅海慶等［34］以桑黃（P. igniarius）菌絲體為材料，采用超聲波細(xì)胞粉碎，得到多糖提取工藝的最優(yōu)參數(shù)為：超聲波功率210 W，超聲波處理時(shí)間60 min，料液比1∶50（g/mL），多糖提取率可達(dá)12.78%。上述研究結(jié)果表明超聲波法對(duì)真菌多糖的提取率較傳統(tǒng)熱水提取法明顯提高，且與熱水提取法相比具有省時(shí)、條件溫和、操作簡(jiǎn)便、提取率高、雜質(zhì)含量少等優(yōu)點(diǎn)。

2.4 微波提取法

微波提取法是利用微波能來(lái)提高萃取率的一種最新發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)。其具體原理是在微波場(chǎng)中吸收微波能力的差異使得基體物質(zhì)的某些區(qū)域或萃取體系中的某些組分被選擇性加熱，從而使得被萃取物質(zhì)從基體或體系中分離，進(jìn)入到介電常數(shù)較小且微波吸收能力相對(duì)較差的萃取劑中。

秦俊哲等［35］以桑黃（P. igniarius）子實(shí)體為原料，得出提取多糖最佳工藝條件為：微波處理時(shí)間5.1 min，微波功率540W，提取2次，多糖得率4.18%。還發(fā)現(xiàn)，影響多糖得率的因素按主次順序?yàn)槲⒉üβ剩疽毫媳龋咎崛r(shí)間。時(shí)東方等［36］以桑黃（P. igniarius）菌絲為原材料，確定了熱水浸提法、微波輔助提取法和超聲提取法的最佳工藝。結(jié)果表明，微波輔助法與熱水浸提法相比，時(shí)間縮短且提取率提高了近1倍；與超聲提取法相比，時(shí)間縮短了1/2，但提取率提高了40%。由此可見(jiàn)，微波輔助提取法優(yōu)于其它兩種方法。郭樹(shù)凡等［37］以桑黃（P.igniarius）子實(shí)體為原材料，研究了微波輔助提取和熱水浸提法提取桑黃子實(shí)體多糖的最佳提取工藝條件，結(jié)果表明，微波輔助提取法提取桑黃子實(shí)體多糖所需的時(shí)間較短，且多糖得率比熱水浸提法提高了20.5%。微波輔助提取真菌多糖優(yōu)點(diǎn)在于提取率高、提取時(shí)間短、高效節(jié)能、操作更簡(jiǎn)便，但仍存在局限性，目前僅適用于實(shí)驗(yàn)室，不宜大批量工業(yè)生產(chǎn)［31，36］。

2.5 鹽提取法

鹽析法是在中藥水提液中加入無(wú)機(jī)鹽至一定濃度或達(dá)飽和狀態(tài)，可使某些成分在水中溶解度降低，從而與水溶性大的雜質(zhì)分離的一種提取方法［38］。常作鹽析的無(wú)機(jī)鹽有氯化鈉、硫酸鈉、硫酸鎂和硫酸銨等。

3 展望

近年來(lái)，人們從香菇、銀耳、靈芝、云芝、灰樹(shù)花和姬松茸等真菌中分離出大量多糖和蛋白多糖，由于這些多糖具有較高的生物活性及較好的免疫調(diào)節(jié)和抗癌功效，愈來(lái)愈引起國(guó)內(nèi)外藥理學(xué)家、生物學(xué)家和化學(xué)家們的興趣，因此真菌多糖成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。桑黃具有多種藥用功效且毒副作用小，是目前真菌中抗癌效果非常好的藥用真菌，且桑黃的藥效成分、藥理作用及其機(jī)制通過(guò)研究也已被人們熟知［39］。因此桑黃多糖的提取顯得尤為重要，溶劑浸提法、超聲波提取法和鹽提取法都適用于批量工業(yè)生產(chǎn)，但溶劑浸提法資源耗費(fèi)較大；相比而言，微波提取法和酶提取法更適合少量提取用于試驗(yàn)研究，其優(yōu)點(diǎn)在于提取率高、操作便捷、雜質(zhì)較少。

日本及韓國(guó)開(kāi)發(fā)利用桑黃最早，并已開(kāi)始人工栽培，批量生產(chǎn)。在日本和韓國(guó)市場(chǎng)，桑黃被譽(yù)為名貴的中藥材，價(jià)格昂貴。目前國(guó)外主要用于制造防癌藥品，提高人體免疫力及養(yǎng)顏保健。由于需求量大、價(jià)格高，致使國(guó)內(nèi)各產(chǎn)地對(duì)桑黃進(jìn)行掠奪式開(kāi)采，導(dǎo)致其子實(shí)體孢子無(wú)法大量形成。結(jié)果造成該資源在東北地區(qū)已經(jīng)難覓蹤影，西北也即將枯竭。再加上我國(guó)天然的桑黃數(shù)量本來(lái)就非常稀少，子實(shí)體的人工栽培尚處于起步階段，所以要形成穩(wěn)定的醫(yī)藥工業(yè)產(chǎn)品來(lái)源，就必須充分挖掘桑黃的自然資源，深入開(kāi)展桑黃的人工栽培。另外，還要進(jìn)行菌種的分離培養(yǎng)，利用現(xiàn)代生物技術(shù)進(jìn)行深層發(fā)酵對(duì)多糖進(jìn)行高效提取純化。同時(shí)，應(yīng)進(jìn)一步測(cè)定桑黃提取物中的有效成分，探索其與菌種、菌齡以及培養(yǎng)條件的關(guān)系，特別是多糖的分子結(jié)構(gòu)、生物學(xué)活性、結(jié)構(gòu)修飾、構(gòu)效關(guān)系與臨床評(píng)價(jià)，藥效成分間的互用與協(xié)同效應(yīng)，桑黃菌種和培養(yǎng)條件對(duì)其藥效的影響，桑黃真?zhèn)螜z測(cè)標(biāo)準(zhǔn)、特征性成分與產(chǎn)品分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)等方面，確定桑黃有效成分在提高人體免疫機(jī)能、疾病預(yù)防和治療等方面的作用機(jī)制，使桑黃能夠早日廣泛應(yīng)用于人類(lèi)的醫(yī)療保健事業(yè)［40］。