王明珠，羅莉，邱卓琳，朱建斌，李昊，蔡祥勝

1.西安市第四醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心，陜西 西安 710004；2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院 生殖中心，廣東 廣州 510515；3.廣東唯泰生物科技有限公司 技術(shù)中心，廣東 佛山 528000；4.廣東藥科大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510080

勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）嚴(yán)重影響患者及其配偶的生活。ED是多種疾病的結(jié)果，被定義為陰莖持續(xù)不能達(dá)到和（或）維持足夠的勃起以獲得滿意的性生活。流行病學(xué)研究資料表明全球ED的高發(fā)病率。ED是由神經(jīng)源性引起的內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌功能障礙。例如，長(zhǎng)期糖尿病導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，減少氮能神經(jīng)信號(hào)，并增加了陰莖組織氧化應(yīng)激，這反過(guò)來(lái)又導(dǎo)致一氧化氮合成下降、平滑肌松弛及海綿體細(xì)胞凋亡和纖維化[1]。而前列腺切除術(shù)后，ED是神經(jīng)血管束直接受損的結(jié)果。前列腺切除術(shù)后，由于直接神經(jīng)損傷或間接神經(jīng)失用癥，導(dǎo)致陰莖組織缺氧、纖維化和細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致ED發(fā)生[2]。目前磷酸二酯酶5型抑制劑（phosphodiesterase type 5 inhibitor，PDE5-I）是 ED 患者的一線治療選擇[3]，其他方法如尿道內(nèi)栓劑、陰莖假體等也用于治療ED。多數(shù)情況下，PDE5-I治療ED有效，但是對(duì)糖尿病相關(guān)ED和根治性前列腺切除術(shù)后ED的治療效果差，因此，為這類患者提供有效的治療方案成為臨床難題。近10年來(lái)已經(jīng)建立了糖尿病ED、前列腺切除術(shù)后ED動(dòng)物模型，使得可以探討疾病的發(fā)展和治療方案，而其中一個(gè)令人欣喜的治療方案是干細(xì)胞的使用。過(guò)去的20年里，研究者們?cè)诟杉?xì)胞治療方面取得了重大成就。最近，干細(xì)胞的應(yīng)用已擴(kuò)展到ED治療。在此，我們簡(jiǎn)要綜述干細(xì)胞治療ED的相關(guān)研究進(jìn)展。

1 干細(xì)胞

1998年，美國(guó)威斯康星大學(xué)的Thomson等報(bào)道發(fā)現(xiàn)人類胚胎干細(xì)胞[4]。隨后，日本京都大學(xué)的山中伸彌發(fā)現(xiàn)了成體干細(xì)胞的再編程方法，可使分化的成體干細(xì)胞逆向分化為胚胎干細(xì)胞，被稱為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞[5]。該發(fā)現(xiàn)擴(kuò)大了干細(xì)胞研究領(lǐng)域，并為疾病提供了新的治療方案。

干細(xì)胞具有自我更新和分化潛能[6]?？傮w來(lái)說(shuō)，分化為早期胚胎的稱為胚胎干細(xì)胞，來(lái)自成熟組織的稱為成體干細(xì)胞。與成體干細(xì)胞相比，胚胎干細(xì)胞可以分化為更多種細(xì)胞，并且可供分化的時(shí)間長(zhǎng)。但是，考慮到胚胎干細(xì)胞研究的倫理爭(zhēng)議較多，其臨床研究受到很大限制，而成體干細(xì)胞則成為目前研究關(guān)注的熱點(diǎn)。

干細(xì)胞具有特定的細(xì)胞表面標(biāo)記物和轉(zhuǎn)錄因子。胚胎干細(xì)胞表面標(biāo)記包括階段特異性胚胎抗原（stage specific embryonic antigen，SSEA）3和4、腫瘤排斥抗原（tumor rejection antigen，TRA）1-60和1-81。首次發(fā)現(xiàn)的成體干細(xì)胞是源于骨髓的造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSC）[7]，其次是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）。MSC是脂肪組織、臍帶血、胎盤和牙齒中發(fā)現(xiàn)的成體干細(xì)胞，表達(dá)幾種細(xì)胞表面標(biāo)記物 ，包 括 CD105、CD73、CD44、CD166和 CD54/CD102，同時(shí)，其缺乏HSC特征性表面標(biāo)記物如CD14、CD34、CD45、CD11a及 CD31。人體內(nèi)很多器官都具有成體干細(xì)胞，如心臟組織、脂肪組織、骨骼肌、睪丸細(xì)胞、內(nèi)皮、腸和腦組織，有望用于修復(fù)受損組織[8]。

2 脂肪干細(xì)胞

脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）及其再生潛能于2001被發(fā)現(xiàn)[9]。通過(guò)全麻抽脂術(shù)（吸脂）分離脂肪干細(xì)胞，體外培養(yǎng)并加入適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)因子可分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和成肌細(xì)胞等。脂肪組織中的ADSCs比骨髓MSCs數(shù)量高出100～500倍[10]。因此，皮下脂肪和內(nèi)臟脂肪是獲得ADSCs最簡(jiǎn)單和最實(shí)用部位。皮下脂肪中ADSCs的提取安全、微創(chuàng)、得率高。

盡管脂肪干細(xì)胞的存在已被證實(shí)，但精確定位仍然存在困難。我們現(xiàn)在知道ADSCs存在于基質(zhì)干細(xì)胞龕中。更具體地說(shuō)，研究表明它們位于脂肪脈管系統(tǒng)的微環(huán)境中[11]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)ADSCs由于存在于脂肪組織中的不同血管干細(xì)胞群中，其分化潛能不同，取決于細(xì)胞所在環(huán)境[12]。

獲得脂肪組織后，須用膠原酶溶解基質(zhì)血管組分（stromal vascular fraction，SVF）[13]，分離出干細(xì)胞，然后根據(jù)特異性細(xì)胞標(biāo)記分類干細(xì)胞，而定義這些細(xì)胞的表面標(biāo)記物一直是很困難的事情。目前常用的特征標(biāo)記分類包括CD29、CD34、CD105、CD73、CD90和CD105[14]?？茖W(xué)家在各種不同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)ADSCs，并刺激其分化為軟骨細(xì)胞、平滑肌和神經(jīng)細(xì)胞[15-17]。

3 脂肪干細(xì)胞用于治療ED

ADSCs在臨床前期治療ED中顯示出巨大的再生潛能。研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs治療ED時(shí)可以改善海綿體神經(jīng)擠壓傷后勃起功能[18]。該研究可以作為前列腺切除術(shù)后的神經(jīng)失用癥模型。Albersen等在研究中使用這一模型，證明ADSCs和ADSCs衍生的細(xì)胞裂解物的識(shí)別機(jī)制和作用[19]。雙側(cè)海綿狀神經(jīng)損傷采用ADSCs、干細(xì)胞裂解物治療后4周做勃起功能及陰莖組織學(xué)評(píng)價(jià)，與對(duì)照組比較，治療后勃起功能顯著恢復(fù)[20]。且神經(jīng)型一氧化氮合酶（nNOS）顯著高表達(dá)、平滑肌含量升高、纖維化程度減輕。事實(shí)上，并不是把干細(xì)胞移入后生長(zhǎng)并分化，而是干細(xì)胞溶解物中可溶性因子的釋放發(fā)揮旁分泌效應(yīng)使勃起功能恢復(fù)[21]。

Fandel等研究自體脂肪組織來(lái)源SVF治療方案是否和ADSCs一樣，能夠改善海綿體神經(jīng)受損后勃起功能[22]。ADSCs和SVF治療的動(dòng)物nNOS陽(yáng)性率顯著大于對(duì)照組動(dòng)物，但ADSCs治療與SVF治療的動(dòng)物組中nNOS陽(yáng)性率或顱內(nèi)壓/平均動(dòng)脈壓（ICP/MAP）無(wú)顯著性差異。這些結(jié)果表明，神經(jīng)元陽(yáng)性反應(yīng)與含nNOS神經(jīng)纖維再生相關(guān)。為進(jìn)一步闡明ADSCs依賴的勃起功能恢復(fù)機(jī)制，研究人員使用了胸腺嘧啶核苷類似物（EdU）標(biāo)記的ADSCs，并在不同時(shí)間點(diǎn)追蹤這些細(xì)胞。他們觀察到在骨盆神經(jīng)節(jié)（MPG）基質(zhì)中細(xì)胞衍生因子1（SDF-1）的表達(dá)上調(diào)，這為向MPG募集ADSCs提供了信號(hào)。在募集到的ADSCs的組中觀察到海綿體中神經(jīng)再生和改善的平滑肌/膠原比。

Song等結(jié)合上述觀察的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，評(píng)價(jià)血管生成因子在海綿體神經(jīng)損傷后勃起功能恢復(fù)中的作用。神經(jīng)受損后采用海綿體內(nèi)注射SVF后2周，觀察到神經(jīng)刺激性勃起的劑量依賴性反應(yīng)。此外，他們發(fā)現(xiàn)血管生成因子，包括血管生成素1（Ang-1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的表達(dá)增加[23]。Castiglione等對(duì)陰莖硬結(jié)癥大鼠模型進(jìn)行被膜內(nèi)注射人ADSCs的治療，以評(píng)估ADSCs預(yù)防纖維化和改善勃起功能的效果[24]。對(duì)比之前更換不可逆損傷組織的研究，該小組評(píng)估了ADSCs預(yù)防急性炎癥期陰莖硬結(jié)癥的效果。治療后5周，評(píng)價(jià)勃起功能并取陰莖組織進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)分析。結(jié)果表明，和對(duì)照組相比，ADSCs治療組ΔICP、ICP/MAP顯著增加，腫大組織明顯減?。幻庖哂≯E顯示膠原蛋白Ⅲ和彈力蛋白增加。5周后檢測(cè)到小部分干細(xì)胞，這一發(fā)現(xiàn)支持了旁分泌機(jī)制導(dǎo)致上述結(jié)果的假設(shè)。進(jìn)一步的研究提供了更多對(duì)旁分泌機(jī)制的支持。例如，在體外培養(yǎng)時(shí)，干細(xì)胞釋放細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子進(jìn)入其環(huán)境，類似于體內(nèi)注射干細(xì)胞，提示干細(xì)胞可以作為一種治療方法。

Gokce等用相同的大鼠模型評(píng)估ADSCs作為預(yù)防ED的措施和治療方法[25]。結(jié)合已有研究，他們觀察的2種治療方法都有效增加了ICP和ICP/MAP值。為了解釋可能的分子機(jī)制，他們也發(fā)現(xiàn)抗肝纖維化的酶濃度、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）增加，金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP）減少。這一發(fā)現(xiàn)為Castiglione研究中膠原和彈性蛋白減少的機(jī)制提供了證據(jù)。最近，Gokce等報(bào)道基因編輯后ADSCs移植，具有或不具有干擾素α2b的ADSCs減弱了模型大鼠陰莖硬結(jié)癥樣改變并增強(qiáng)了勃起功能。這表明ADSCs具有臨床應(yīng)用的可能性，可阻止硬結(jié)癥斑塊的形成，或至少限制疾病的自然進(jìn)展[26]。另一項(xiàng)研究表明，豬小腸黏膜下同源ADSCs的移植可保留和維持正常的勃起功能[27]。ADSCs的小腸黏膜下移植可誘導(dǎo)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）轉(zhuǎn)錄上調(diào)及內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）、nNOS和VEGF下調(diào)。這一結(jié)果進(jìn)一步支持修復(fù)損傷白膜可作為治療陰莖硬結(jié)癥的選擇。

前列腺癌的放射治療是另一個(gè)導(dǎo)致ED原因，ADSCs可以改善這類患者的勃起功能障礙。Qui等研究了ADSCs改善放療誘導(dǎo)的ED大鼠勃起功能障礙[28]。接受放療的大鼠勃起功能明顯減弱，nNOS和海綿體平滑肌含量減少；而當(dāng)放療大鼠注射ADSCs后，勃起功能恢復(fù)，nNOS表達(dá)和平滑肌含量恢復(fù)。

Garcia等利用2型糖尿病大鼠模型研究ADSCs在治療2型糖尿病ED中的作用[29]。通過(guò)提取自體腺體周圍脂肪組織分離培養(yǎng)干細(xì)胞注入大鼠陰莖，并與對(duì)照組相比，觀察到大鼠勃起功能改善、細(xì)胞凋亡減少、nNOS水平升高。以往研究表明，治療第3周的組織內(nèi)只有少量干細(xì)胞可見(jiàn)，表明細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子通過(guò)旁分泌釋放。

脂肪源性SVF移植也有助于糖尿病患者勃起功能的恢復(fù)。研究證實(shí)SVF通過(guò)恢復(fù)內(nèi)皮、提高平滑肌含量、增加血管生成因子的釋放，促進(jìn)磷酸化eNOS產(chǎn)生和恢復(fù)陰莖神經(jīng)纖維，改善勃起功能[30]。有趣的是，與常氧環(huán)境下培養(yǎng)的ADSCs相比，低氧預(yù)處理的ADSCs可更高程度地誘導(dǎo)血管生成因子表達(dá)，從而改善大鼠勃起功能[31]。

研究者也采用其他策略提高ADSCs的有效性，其中之一是基因工程技術(shù)。Chen等將VEGF基因轉(zhuǎn)染ADSCs并將其移植到2型糖尿病大鼠ED模型中[32]，與單獨(dú)使用ADSCs和VEGF相比，用表達(dá)靶基因的ADSCs組大鼠勃起功能顯著改善。此外，還證明了VEGF轉(zhuǎn)染ADSCs組能更好地恢復(fù)VEGF信號(hào)通路、增加內(nèi)皮和平滑肌功能，這些都是恢復(fù)勃起功能的基礎(chǔ)。

另一種用于增強(qiáng)ADSCs的策略是用生長(zhǎng)因子包被的水凝膠和生物降解膜。Piao等研究了被聚乳酸-乙醇酸（PLGA）膜包被的ADSCs和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）對(duì)海綿體神經(jīng)損傷大鼠模型的療效[33]。與單獨(dú)使用ADSCs或BDNF/PLGA膜組相比，使用PLGA膜包被ADSCs的治療組更顯著地改善了神經(jīng)再生和勃起功能。隨后，他們觀察了BDNF/PLGA膜與含有堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）的ADSCs凝膠相結(jié)合的治療效果。這種治療策略與采用ADSCs+BDNF/PLGA膜或單獨(dú)使用bFGF相比，可以顯著改善勃起功能至接近正常水平。

目前，ADSCs是惟一可以分離并自體移植的細(xì)胞類型。此外，已有商業(yè)化的自動(dòng)ADSCs分離儀器。因此，就成本、風(fēng)險(xiǎn)、倫理和有效性而言，ADSCs在治療ED的應(yīng)用中有很大潛力[34]。

顯然，ADSCs為今后治療ED提供了一種有效的治療方法。臨床前各種ED動(dòng)物模型為ADSCs治療提供了證據(jù)，將會(huì)有更多支持干細(xì)胞安全性和有效性的研究。預(yù)計(jì)在不久的將來(lái)，醫(yī)生們將能夠采用ADSCs治療ED。