黃 潔，張 捷

(昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院肝膽胰外科三病區(qū)，昆明 650101)

本研究利用“下一代”測序技術(NGS)，首次針對不同膽囊結石類型患者的膽囊黏膜和微生物群落的16S rDNA進行Illumina Miseq檢測和分析,進一步探討膽囊結石發(fā)病機制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014年1-12月在本院肝膽胰外科三病區(qū)行膽囊切除術的60例膽囊結石患者為病例組，分膽固醇、膽色素和混合性結石組3組，每組各20例。選取肝右前葉血管瘤切除膽囊的11例患者為對照組。術后膽汁培養(yǎng)和厭氧菌培養(yǎng)陽性的病例不納入本次研究，所有樣本均經病理證實。所有患者均知情同意，本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1采集 完成膽囊切除術，切開并取出結石，對結石表面附著物用生理鹽水沖洗。用無菌組織剪剪取膽囊黏膜1塊，大小約2.0 cm×2.0 cm。無菌螺口離心管收集樣本，完成后立即放置于-80 ℃液氮瓶中儲存。

1.2.2DNA提取 從-80 ℃的冰箱中取出樣本并解凍，用無菌刀片將結石均分成4份。收集每份的核心部分，烘干至37 ℃后粉碎，取180～220 mg提取細菌DNA，余下的樣本用于膽固醇含量測定；稱取患者及對照者的黏膜各180～200 mg;分別放置于2 mL離心管(含200 μL 0.1 mm氧化鋯/硅珠)，加入2 mL 緩沖液ATL(由QIAamp?DNA Stool Mini Kit提供的細胞裂解液)，均質化后，首先20 ℃下物理破碎2 min，6 000 r/min離心1 min，95 ℃裂解5 min。DNA提取的試劑使用OMEGA E.Z.N.A.土壤DNA提取試劑盒進行微生物DNA的提取。

1.2.3PCR擴增 使用帶有樣本特異標簽序列(barcode)的PCR引物對(341F/805R)，對每個樣本進行16S rRNA基因V3～V4可變區(qū)進行擴增。341F引物：CCT ACA CGA CGC TCT TCC GAT CTN(barcode)CCT ACG GGN GGC WGC AG；805R引物：GAC TGG AGT TCC TTG GCA CCC GAG AAT TCC AGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C。其中barcode為各樣本的條形碼，用于后續(xù)Raw Data的分配。

1.2.4文庫構建及Miseq測序 使用Illumina自帶的Miseq Control Software (MCS)軟件進行監(jiān)控和原始數(shù)據(jù)的校檢。主要包含以下5個步驟：制作樣本數(shù)據(jù)表，解凍試劑盒，加載DNA文庫到試劑盒，上樣，設置程序參數(shù)并按照MCS的提示進行操作和監(jiān)控。

1.2.5細菌分類單元(Operational Taxonomic Units，OTU)的鑒定 采用QIIME1.9.1軟件進行分類單元的鑒定和生物多樣性的評估分析。

2 結 果

2.1研究樣本基本情況 3組膽囊結石患者性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，膽固醇含量比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同類型膽囊結石患者基本條件的比較

表2 樣本的測序情況匯總表

a:P<0.05

圖1 不同類型的膽結石、不同部位的屬的分布(顯示前11個屬和其他)

2.2膽囊結石和黏膜樣本的DNA提取結果 對照組中未檢測出細菌微生物群落DNA。病例組結石樣本中有6例未提取出微生物群落DNA，1例黏膜樣本未提取出微生物群落DNA，總微生物群落DNA提取率為94.2%。

2.3Miseq測序數(shù)據(jù)結果 各組樣本的測序情況，3組OTU數(shù)/樣本、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。豐度最高的為變形細菌門(Proteobacteria)，其余豐度最多的3個門分別為厚壁菌門(Firmicutes)，擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)。占比超過1%的其他稀有細菌門類群中，同一類型的結石患者的結石和黏膜成比較為一致，而不同類型的組成差異較大，見圖1、2。

圖2 不同類型的結石黏膜優(yōu)勢菌門的分布

所有的樣本進行熱圖分析，可看出樣本主要分兩類，結石和黏膜樣本分別聚集在不同支，且在不同細菌類群上有明顯差異分布。細菌分布較集中的是膽固醇結石，在大多數(shù)差異大的類群有較高的分布，而膽色素結石的細菌主要集中在Pseudomonas、stutzeri和Enterococcus類群，見圖3。

圖3 全部OTU水平進行熱圖分析

3 討 論

本研究通過Illumina Miseq測序對膽囊內微生物群落樣本進行分析，發(fā)現(xiàn)香農指數(shù)、Chaol指數(shù)和ACE指數(shù)在不同類型結石組間，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且同一類型結石組黏膜和微生物群落ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)差異也有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同一組內結石和黏膜樣本，微生物群落菌群多樣性都有明顯的個體差異?？傮w規(guī)律為，在膽固醇結石和膽色素結石組膽囊黏膜樣本的生物多樣性指數(shù)顯著高于其對應的結石樣本，而混合性結石組則相反。

同一類型患者的結石和黏膜膽囊微生物群落多樣性構成比較相似，而不同類型患者的結石和黏膜膽囊微生物群落多樣性構成比差異較大。在微生物門、綱、目這些較高分類水平上結石和黏膜微生物群落多樣性分布并不是很高，而在屬種水平則表現(xiàn)出了豐富的多樣性。筆者發(fā)現(xiàn)，由于稀有菌群比例較大，導致即使在膽固醇含量高于90%的膽固醇結石和黏膜中，膽囊微生物群落也顯示多樣性分布，且有極為復雜的群落分布。根據(jù)Illumina Miseq測序分析，由于個體變異性的存在可能導致膽囊微環(huán)境中的微生物群落有著極大的分散性和差異性。但由于樣本量較小，還需大樣本量去證實。而目前惟一能夠肯定的是由于膽囊對膽汁的濃縮功能，膽汁中含有一些物質，如膽汁酸鹽、膽固醇和微量元素，可作為電子受體或營養(yǎng)物質支持細菌生長代謝，并使結石細菌群落表現(xiàn)出多樣性[2-10]。

本研究尚有許多不足之處：(1)未將與膽囊微生物群落密切相關的腸道微生物群落納入研究，進行關聯(lián)分析。(2)未探討膽囊結石形成過程中膽囊微生物群落的動態(tài)變化過程。(3)未涉及膽囊微生物群落與宿主的相互關系。

低濃度的微生物群落通過局部免疫機制對膽囊黏膜微環(huán)境產生影響，可進一步研究結石形成及發(fā)生、發(fā)展過程中膽囊微生物群落的生態(tài)作用。

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