李曉靜 高 波 董 研* 茍中入 苗滪汶

1(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院口腔矯形科，杭州 310009) 2(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院口腔科，杭州 310006) 3(浙江大學(xué)浙江加州國際納米技術(shù)研究院，杭州 310029)

引言

骨組織工程中生物支架的性能至關(guān)重要。近年來納米材料的發(fā)展促進了納米結(jié)構(gòu)生物支架的研究，由于其類似天然細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，刺激組織細胞生長及促進組織細胞分化的效能較傳統(tǒng)支架優(yōu)越，因而廣受學(xué)者關(guān)注[1-2]。

靜電紡絲技術(shù)是將高分子材料或者少數(shù)無機材料在高壓靜電場中形成較細的表面帶電的噴射流，經(jīng)溶劑蒸發(fā)及熔體冷卻干燥后形成納米纖維[3-4]。膠原和殼聚糖都是天然生物聚合物，均具有良好的生物相容性、可降解性及優(yōu)良的生物學(xué)性能，在生物支架的制備中廣受關(guān)注；同時，聚環(huán)氧乙烯(PEO)是高分子的聚合物，能為膠原和殼聚糖分子鏈提供彼此纏繞的軸，可改善膠原和殼聚糖的紡絲性質(zhì)，已被廣泛用于臨床醫(yī)藥領(lǐng)域[5-6]。已有學(xué)者采用靜電紡絲技術(shù)將膠原和殼聚糖制備成納米纖維支架，用于皮膚、血管、神經(jīng)、骨和軟骨等組織工程領(lǐng)域的研究[7-9]。但這些研究中，膠原和殼聚糖的溶劑大多使用了一些生物相容性較差的有機溶劑，如六氟異丙醇、三氟乙酸或二氯甲烷等，已有研究發(fā)現(xiàn)，這些有機溶劑對于組織細胞的生長不利[10-12]。

因此，本研究擬采用水溶性的乙酸為溶劑，以PEO為增塑劑，通過靜電紡絲技術(shù)制備膠原/殼聚糖納米纖維膜，以研究其作為骨再生生物膜的細胞相容性及誘導(dǎo)成骨性。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

I型膠原，相對分子質(zhì)量0.8-1.0×105，四川銘讓生物科技有限公司；殼聚糖，中分子量(MW190 000-310 000)，Sigma； 聚環(huán)氧乙烯(PEO，分子量700 KDa)、2.5%戊二醛，國藥集團；冰醋酸，阿拉丁試劑有限公司；甘氨酸，上海生物工程技術(shù)有限公司；DMEM細胞培養(yǎng)基、2.5 g/L胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(PBS)、丙酮、無水乙醇，杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；胎牛血清(Gibco)，美國；堿性磷酸酶試劑盒，南京建成生物制劑有限公司；羥脯氨酸測試盒，南京建成生物制劑有限公司；羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽(Invitrogen)，美國；Alexa fluor 594標記的骨鈣素(Sigma)，美國；細胞核染色劑DAPI (Sigma)，美國；茜素紅S(Sigma),美國。

1.2 實驗方法

1.2.1靜電紡絲納米纖維膜的制備

靜電紡膠原/聚環(huán)氧乙烯納米纖維膜的制備：以45%乙酸溶液配制質(zhì)量分數(shù)7%的膠原溶液，以水為溶劑配置7%的PEO溶液，兩者以質(zhì)量比4∶1配置成混合溶液。電紡過程中采用鈍口22 G醫(yī)用針頭，溶液置于20 mL注射器中，采用醫(yī)用注射泵控制流速0.1 mL/h，電壓12 kV，接收裝置距離為12 cm，制備膠原納米纖維膜(COL)。

靜電紡膠原/殼聚糖/聚環(huán)氧乙烯復(fù)合納米纖維膜的制備：將上述膠原、PEO溶液及3%殼聚糖乙酸溶液按質(zhì)量比5∶1∶4、5∶2∶3、5∶4∶1混合，在相同的電紡條件下分別制備膠原/殼聚糖復(fù)合納米纖維膜-1(COL/CHI-1)，膠原/殼聚糖復(fù)合納米纖維膜-2(COL/CHI-2)，膠原/殼聚糖復(fù)合納米纖維膜-3(COL/CHI-3)。

將制備的四種納米纖維膜置于37℃恒溫箱內(nèi)干燥48 h取出，浸入75%乙醇溶液中，在密閉容器內(nèi)2.5%戊二醛溶液交聯(lián)4 h后，浸入0.2 M甘氨酸溶液中封閉醛基，去離子水漂洗后干燥備用。

1.2.2掃描電子顯微鏡觀察

將交聯(lián)前后的4種納米纖維膜裁剪出表面積5 mm×5 mm的測試樣本，固定樣本盤中，表面噴金后通過掃描電子顯微鏡觀察膜的表面形態(tài)。使用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics,Inc, USA)測量納米纖維的直徑，計算其平均值。將COL組及COL/CHI組中納米纖維表面光滑、無液滴狀的一組作為實驗組。

1.2.3細胞培養(yǎng)與接種

大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)購于上海妙通生物科技有限公司，采用含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)方法培養(yǎng)，每24 h更換培養(yǎng)液，分離傳代備用。2.5 g/L胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細胞，離心、懸浮、血細胞計數(shù)板計數(shù)，將細胞懸浮液接種至細胞培養(yǎng)板(空白對照組，TCP)及鋪有消毒過的COL納米纖維膜、COL/CHI復(fù)合納米纖維膜上繼續(xù)培養(yǎng)。細胞分化實驗在含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中加入了成骨細胞誘導(dǎo)劑，10 mM β-甘油磷酸酯，0.1 μM地塞米松和0.2 mM抗壞血酸溶液。

1.2.4MTT法檢測細胞黏附與增殖

將BMSCs單層細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板的膜材料上，以細胞培養(yǎng)板為空白對照組，每組設(shè)6個復(fù)孔，通過MTT法檢測BMSCs在兩組復(fù)合納米纖維膜上的黏附及增殖情況。每孔接種細胞5×104個，加入1 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于時間點1、4、7 d檢測細胞黏附和細胞增殖情況。在每個時間點將培養(yǎng)液吸出，PBS洗3遍，換用1 mL新鮮無血清培養(yǎng)基，加入100 μL MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄原培養(yǎng)液，每孔加入400 μL二甲基亞砜(DMSO)，震蕩10 min，吸取上清液在490 nm波長下用酶標儀測各孔的OD值，取平均值。

1.2.5堿性磷酸酶檢測誘導(dǎo)細胞成骨性

將BMSCs單層細胞接種于48孔細胞培養(yǎng)板的膜材料上，以細胞培養(yǎng)板為空白對照組，每組設(shè)6個復(fù)孔，細胞接種密度為1×104個/孔，第二天細胞培養(yǎng)液換成含成骨細胞誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)液，共培養(yǎng)7、14 d后，PBS沖洗三次，每孔加入200 μL的10% Triton-X100溶液裂解細胞，4 ℃條件下孵育12 h，用堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒測定裂解產(chǎn)物中酶的活性，選擇490 nm波長測定溶液的吸光度。用BCA方法測定每孔細胞的總蛋白量。ALP活性以總蛋白量標準化下的值來表示。

1.2.6細胞內(nèi)膠原蛋白檢測誘導(dǎo)細胞成骨性

將BMSCs單層細胞接種于48孔細胞培養(yǎng)板的膜材料上，以細胞培養(yǎng)板為空白對照組，每組設(shè)6個復(fù)孔，細胞接種密度為1×104個/孔，第2 d細胞培養(yǎng)液換成含成骨細胞誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)液，共培養(yǎng)7、14 d后，PBS沖洗3次，每孔加入200 μL的10% Triton-X100溶液裂解細胞，4 ℃條件下孵育12 h，將裂解液吸出，用羥脯氨酸試劑盒檢測膠原含量。

1.2.7細胞免疫熒光染色檢測誘導(dǎo)細胞成骨性

將BMSCs單層細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板的膜材料上，細胞接種密度為5×104個/孔，第2 d細胞培養(yǎng)液換成含成骨細胞誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)液，共培養(yǎng)14 d后，PBS沖洗3次，每次5 min，用-20℃甲醛溶液在-20℃冰箱固定材料上的細胞8 min，0.2% Triton-X100打孔0.5 h后，加入Alexa fluor 594標記骨鈣素(OCN)，羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽染細胞骨架，再用DAPI復(fù)染細胞核，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞在材料上的黏附及染色情況。以細胞培養(yǎng)板為空白對照組，每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.2.8茜素紅染色檢測細胞鈣化情況

將BMSCs單層細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板的膜材料上，以細胞培養(yǎng)板為空白對照組，每組設(shè)3個復(fù)孔。細胞接種密度為2×104個/孔，培養(yǎng)第2 d細胞培養(yǎng)液換成含成骨細胞誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)液，共培養(yǎng)14 d，PBS沖洗3次，每次5 min，用4%多聚甲醛溶液固定15 min，PBS沖洗3次，0.1%茜素紅-TrisHCl室溫下染30 min，PBS沖洗后光學(xué)顯微鏡下觀察細胞染色情況。

1.2.9統(tǒng)計學(xué)分析

試驗數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS10.0進行分析，結(jié)果以均數(shù)±標準差(Mean±S.D.)表示，對所得數(shù)據(jù)進行單因素的方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 掃描電子顯微鏡觀察

從靜電紡膠原納米纖維膜及各組膠原/殼聚糖復(fù)合納米纖維膜的掃描電鏡圖(見圖1)可見，COL組混合液電紡可得到表面光滑、連續(xù)均勻的納米纖維，經(jīng)測量直徑為66±10 nm。膠原、殼聚糖、PEO三者質(zhì)量比為5∶1∶4時，電紡可得到表面較光滑、連續(xù)均勻的納米纖維膜COL/CHI-1，經(jīng)測量纖維直徑為78±16 nm。三者質(zhì)量比是5∶2∶3時，可見COL/CHI-2膜中納米纖維絲，但同時可見有串珠狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)質(zhì)量比為5∶4∶1時，可見COL/CHI-3膜表面有大量的串珠，珠子體積變大，納米纖維狀結(jié)構(gòu)減少。

圖1 各組靜電紡絲納米纖維膜交聯(lián)前后掃描電鏡圖。 (a) 交聯(lián)前膠原納米纖維膜；(b) 交聯(lián)前膠原/殼聚糖納米纖維膜-1；(c) 交聯(lián)前膠原/殼聚糖納米纖維膜-2；(d) 交聯(lián)前膠原/殼聚糖納米纖維膜-3； (e) 交聯(lián)后膠原納米纖維膜；(f) 交聯(lián)后膠原/殼聚糖納米纖維膜-1Fig.1 Scanning electron microscopy micrographs of collagen and collagen/chitosan nanofibrous membranes before and after crosslinking. (a)Collagen nanofibrous membrane before crosslinking; (b)Collagen/chitosan nanofibrous membrane-1 before crosslinking; (c)Collagen/chitosan nanofibrous membrane-2 before crosslinking; (d) Collagen/chitosan nanofibrous membrane-3 before crosslinking；(e)Collagen nanofibrous membrane after crosslinking;(f) Collagen/chitosan nanofibrous membrane-1 after crosslinking

COL納米纖維及COL/CHI-1復(fù)合納米纖維經(jīng)戊二醛蒸汽交聯(lián)后掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，二者納米纖維膜的纖維直徑均有所增大。而COL/CHI-2和COL/CHI-3復(fù)合納米纖維膜在交聯(lián)過程中膜結(jié)構(gòu)破解，未觀察到兩組納米膜交聯(lián)后掃描電鏡圖。因此將COL/CHI-1組選為了實驗組，命名為膠原/殼聚糖復(fù)合納米纖維膜(COL/CHI)。

2.2 MTT法檢測細胞黏附與增殖

本實驗采用MTT法檢測骨髓間充質(zhì)干細胞在不同材料表面的增殖能力。在細胞接種薄膜后1、4和7 d后，細胞在3種不同材料表面均呈持續(xù)性增加(見圖2)。在培養(yǎng)7 d后，COL/CHI組OD值高于TCP組及COL組并具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，提示與TCP組及COL組相比，COL/CHI組更有利于細胞生長及增殖且無細胞毒性。

圖2 納米纖維膜表面骨髓間充質(zhì)干細胞增殖情況(*：P<0.05)Fig.2 Viability of BMSCs on the nanofibrous membranes(*：P<0.05)

2.3 堿性磷酸酶(ALP)檢測誘導(dǎo)細胞成骨性

本實驗采用堿性磷酸酶試劑盒檢測納米纖維膜對骨髓間充質(zhì)干細胞的誘導(dǎo)分化合成堿性磷酸酶的能力，結(jié)果顯示：隨著時間延長，3組中細胞ALP的含量均逐漸增高，細胞分別培養(yǎng)7和14 d后，COL/CHI組和COL組的ALP活性均高于空白對照TCP組，并具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，而COL/CHI組雖高于COL組，但不具有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05；見圖3)。

圖3 納米纖維膜表面骨髓間充質(zhì)干細胞ALP活性情況(*：P<0.05)Fig.3 The ALP activity of BMSCs on the nanofibrous membranes(*：P<0.05)

2.4 細胞內(nèi)膠原檢測誘導(dǎo)細胞成骨性

本實驗采用羥脯氨酸試劑盒檢測納米纖維膜對骨髓間充質(zhì)干細胞的誘導(dǎo)分化合成膠原的能力，結(jié)果顯示：隨著時間延長，3組中細胞膠原的含量均有所增高。細胞培養(yǎng)7 d后，COL/CHI組和COL組的膠原含量較TCP組高，并且COL/CHI組對于TCP組有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，在14 d時，COL/CHI組膠原含量均高于COL組和TCP組，且對于兩組均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)(見圖4)。

圖4 納米纖維膜表面骨髓間充質(zhì)干細胞內(nèi)膠原含量情況(*：P<0.05)Fig.4 The collagen content of BMSCs on the nanofibrous membranes(*：P<0.05)

2.5 細胞免疫熒光染色檢測誘導(dǎo)細胞成骨性

圖5顯示了在細胞培養(yǎng)14 d后免疫染色后熒光顯微鏡下的細胞形態(tài)圖，細胞核被染為藍色，細胞骨架被染成綠色，從細胞骨架染色可見空白對照組細胞形態(tài)為梭形，而COL/CHI組和COL組細胞伸出樹突狀結(jié)構(gòu)，并且細胞之間通過細胞突起相互連接。細胞內(nèi)骨鈣素(OCN)被染成紅色，圖中顯示COL/CHI組較COL組和TCP組染色均深。

2.6 茜素紅染色檢測細胞鈣化程度

圖6顯示了細胞在培養(yǎng)14 d后茜素紅染色情況，可見TCP組基本無礦化結(jié)節(jié)染色，而COL組和COL/CHI組礦化結(jié)節(jié)染色較多，且COL/CHI組的礦化結(jié)節(jié)染色面積最大。

圖5 納米纖維膜表面骨髓間充質(zhì)干細胞免疫熒光染色。(a)：TCP組；(b)：COL組；(c)：COL/CHI組Fig.5 Immunofluorescent staining of osteocalcin after BMSCs cultured on the nanofibrous membranes for 14 days. (a) Tissue culture plate; (b) Collagen nanofibrous membrane; (c) Collagen/chitosan nanofibrous membrane

圖6 納米纖維膜表面骨髓間充質(zhì)干細胞茜素紅染色。(a)：TCP組；(b)：COL組；(c)：COL/CHI組Fig.6 Alizarin red staining of BMSCs cultured on the nanofibrous membranes for 14 days. (a)Tissue culture plate; (b)Collagen nanofibrous membrane; (c)Collagen/chitosan nanofibrous membrane

3 討論

骨組織工程中生物支架需滿足能夠模擬天然細胞外基質(zhì)的成分、結(jié)構(gòu)特征及機械性能的要求[2, 13-14]。靜電紡絲技術(shù)制備的三維納米纖維支架可模擬天然細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，具有高表面積體積比、高機械強度及良好的生物學(xué)活性，因而在骨組織工程生物支架的研究中廣受關(guān)注[15-17]。

膠原是組成細胞外基質(zhì)的主要成分，殼聚糖是自然界第二豐富的天然生物聚合物，具有與天然細胞外基質(zhì)中糖胺聚糖類似的結(jié)構(gòu)，兩者混合可模擬天然細胞外基質(zhì)的主要有機成分[18-19]。本實驗中膠原、殼聚糖、PEO三者質(zhì)量比是5∶1∶4時，靜電紡薄膜的納米纖維表面光滑，無串珠樣結(jié)構(gòu)。說明三者以合適的比例混合時，PEO能夠打開膠原和殼聚糖分子內(nèi)的較強作用力，為兩者提供了相互纏繞拉伸的軸，從而制備了均一的納米纖維。研究發(fā)現(xiàn)，混有PEO的電紡薄膜經(jīng)過交聯(lián)及漂洗處理后經(jīng)紅外檢測不含或只有痕量PEO，這意味著PEO只是作為靜電紡絲的增塑劑，具有可去除的優(yōu)點[10]。

骨組織工程中生物支架的表面形態(tài)、結(jié)構(gòu)及孔隙等可影響基質(zhì)細胞的生物學(xué)反應(yīng)，從而影響基質(zhì)細胞的黏附、生長、增殖和分化[15]。多數(shù)研究表明，靜電紡絲納米纖維有利于各種干細胞的生長增殖和分化，如間充質(zhì)干細胞、成骨細胞、神經(jīng)干細胞及胚胎干細胞等[15, 20]。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，納米纖維表面的膠原支架與多孔表面的膠原支架相比，前者可更好地促進骨髓間充質(zhì)干細胞細胞的增殖和分化[15]。Dalby等研究發(fā)現(xiàn)，無序的三維納米纖維具有與地塞米松相類似的誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化的效應(yīng)[21]。Oh等在未采用骨誘導(dǎo)劑的二氧化鈦納米管上培養(yǎng)人類間充質(zhì)干細胞以研究其分化潛能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在直徑小于30 nm的納米管更有利于促進細胞的黏附增殖，而直徑在70～100 nm的大尺寸納米管則更有利于促進細胞分化為成骨樣細胞[22]。

關(guān)于納米纖維支架誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞分化的機制，Liu等研究發(fā)現(xiàn)，羥基磷灰石/殼聚糖納米纖維支架可激活骨髓間充質(zhì)干細胞的整合素-骨形態(tài)形成蛋白(BMP)/Smad信號通路誘導(dǎo)其分化[23]。 Xue等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，PCL納米纖維支架通過激活Wnt / β-catenin 和Smad3信號通路誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化，定量PCR檢測到基質(zhì)細胞表達ALP、骨形態(tài)形成蛋白-2(BMP-2)及膠原等的mRNA量顯著增加[20]。Lu等研究發(fā)現(xiàn)，聚β-羥基丁酸戊酸酯/納米羥基磷灰石(PHBV/nHA)納米纖維支架可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞表達或產(chǎn)生ALP、 OCN及礦化結(jié)節(jié)等成骨細胞分化成熟的標記物，將PHBV/nHA納米纖維支架植入新西蘭大白兔顱骨直徑為1.5 cm的骨缺損處，12周后發(fā)現(xiàn)，納米纖維支架組顱骨缺損處基本被新生骨覆蓋，而對照組的顱骨缺損處新生骨較少[24]。Shin等將殼聚糖納米纖維支架應(yīng)用于新西蘭大白兔顱骨直徑為10 mm圓形骨缺損處，4周后發(fā)現(xiàn)原骨缺損已完全愈合。因此可見，殼聚糖納米纖維支架有利于促進骨缺損的修復(fù)再生[17]。

本研究中免疫熒光染色實驗顯示骨髓間充質(zhì)干細胞在兩組納米纖維膜上伸出樹突狀的結(jié)構(gòu)鋪展黏附于納米纖維表面，具有良好的細胞生長形態(tài)。MTT實驗表明，COL組和COL/CHI組均可促進細胞的生長增殖，且COL/CHI組促進細胞增殖作用最好，說明殼聚糖與膠原的混合后可性能互補，分子間相互作用產(chǎn)生的聚合物更有利于細胞的生長，與王培偉等[25]的研究相一致。細胞分化實驗結(jié)果表明，COL組和COL/CHI組納米纖維膜上培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞可誘導(dǎo)其分化成熟并表達ALP、膠原、骨鈣素及生成礦化結(jié)節(jié)，且在細胞培養(yǎng)14 d時，COL/CHI組對骨髓間充質(zhì)干細胞的誘導(dǎo)分化作用優(yōu)于COL組。

本實驗對兩組納米纖維膜的降解未做研究，Chen等研究發(fā)現(xiàn)，膠原/殼聚糖納米纖維膜在體內(nèi)完全降解的時間在9～15周之間[10]。本實驗中觀察到兩組納米纖維膜在細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)兩周后，膜狀結(jié)構(gòu)未見分解，而關(guān)于其體內(nèi)降解時間還有待進一步研究。且后續(xù)實驗還需對膠原/殼聚糖納米纖維支架在動物體內(nèi)是否能引導(dǎo)骨缺損修復(fù)再生做出進一步的研究。

4 結(jié)論

由此可見，膠原納米纖維膜和膠原/殼聚糖納米纖維膜均有利于骨髓間充質(zhì)干細胞的黏附、生長及增殖，且能促進其分化，而膠原/殼聚糖納米纖維膜促進骨髓基質(zhì)干細胞增殖和誘導(dǎo)細胞成骨性更強，有望應(yīng)用于骨組織工程領(lǐng)域。

[1] Kim K, Fisher JP. Nanoparticle technology in bone tissue engineering [J]. J Drug Target, 2007, 15(4): 241-252.

[2] Jang JH, Castano O, and Kim HW. Electrospun materials as potential platforms for bone tissue engineering [J]. Adv Drug Deliv Rev, 2009, 61(12): 1065-1083.

[3] Supaphol P, Suwantong O, Sangsanoh P, et al. Electrospinning of biocompatible polymers and their potentials in biomedical applications [J]. 2011, 246: 213-239.

[4] Schiffman JD, Schauer CL. A review: electrospinning of biopolymer nanofibers and their applications [J]. Polymer Reviews, 2008, 48(2): 317-352.

[5] Rebecca R, Klossner HQ, Andrew JC, et al. Correlation of chitosan′s rheological properties and its ability to electrospin [J]. Biomacromolecules, 2008, 9: 2947-2953.

[6] Zupancic S, Sinha S, Kristl J, et al. Long-term sustained ciprofloxacin release from PMMA and hydrophilic polymer blended nanofibers [J]. Mol Pharm, 2016, 13(1): 295-305.

[7] Huang Chen, Geng Xiaohua, Ke Xiufei, et al. Preparation of composite tubular grafts for vascular repair via electrospinning [J]. Progress in Natural Science: Materials International, 2012, 22(2): 108-114.

[8] Deepthi S, Nivedhitha SM, Deepti KJ, et al. Layered chitosan-collagen hydrogel/aligned PLLA nanofiber construct for flexor tendon regeneration [J]. Carbohydrate Polymers, 2016, 153: 492-500.

[9] Huang Rong, Li Wangzhou, Lv Xiaoxing, et al. Biomimetic LBL structured nanofibrous matrices assembled by chitosan/collagen for promoting wound healing [J]. Biomaterials, 2015, 53: 58-75.

[10] Chen Lan, Zhu Chenhui, Fan Daidi, et al. A human-like collagen/chitosan electrospun nanofibrous scaffold from aqueous solution: electrospun mechanism and biocompatibility [J]. J Biomed Mater Res A, 2011, 99(3): 395-409.

[11] Ner Y, Stuart JA, Whited G, et al. Electrospinning nanoribbons of a bioengineered silk-elastin-like protein (SELP) from water [J]. Polymer, 2009, 50(24): 5828-5836.

[12] Su Hengjie, Liu KY, Karydis A, et al. In vitro and in vivo evaluations of a novel post-electrospinning treatment to improve the fibrous structure of chitosan membranes for guided bone regeneration [J]. Biomed Mater, 2016, 12(1): 015003.

[13] Elango J, Zhang JY, Bao B, et al. Rheological, biocompatibility and osteogenesis assessment of fish collagen scaffold for bone tissue engineering [J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2016, 91: 51-59.

[14] Ren K, Wang Y, Sun T, et al. Electrospun PCL/gelatin composite nanofiber structures for effective guided bone regeneration membranes [J]. Materials Science and Engineering: C, 2017, 78: 324-332.

[15] Zhang Shufang, Chen Longkun, Jiang Yangzi, et al. Bi-layer collagen/microporous electrospun nanofiber scaffold improves the osteochondral regeneration [J]. Acta Biomater, 2013, 9(7): 7236-7247.

[16] Shih YR, Chen CN, Tsai SW, et al. Growth of mesenchymal stem cells on electrospun type I collagen nanofibers [J]. Stem Cells, 2006, 24(11): 2391-2397.

[17] Shin SY, Park HN, Kim KH, et al. Biological evaluation of chitosan nanofiber membrane for guided bone regeneration [J]. Journal of Periodontal, 2005, 76(10): 1778-1784.

[18] Venkatesan J, Vinodhini PA, Sudha PN, et al. Chitin and chitosan composites for bone tissue regeneration [J]. Advances in Food and Nutrition Research, 2014, 73: 59-81.

[19] Xie J, Lou XX, Wang XL, et al. Electrospun nanofibers of hydroxyapatite/collagen/chitosan promote osteogenic differentiation of the induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells [J]. Journal of Controlled Release, 2015, 213: e53.

[20] Xue RY, Qian YN, Li LH, et al.Polycaprolactone nanofiber scaffold enhances the osteogenic differentiation potency of various human tissue-derived mesenchymal stem cells [J]. Stem Cell Res Ther, 2017, 8(1): 148.

[21] Li WJ, Tuli R, Huang XX, et al. Multilineage differentiation of human mesenchymal stem cells in a three-dimensional nanofibrous scaffold [J]. Biomaterials, 2005, 26(25): 5158-5166.

[22] Oh S, Brammer KS, Li YS, et al. Stem cell fate dictated solely by altered nanotube dimension [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106(7): 2130-2135.

[23] Liu Huanhuan, Peng Hongju, Wu Yan, et al. The promotion of bone regeneration by nanofibrous hydroxyapatite/chitosan scaffolds by effects on integrin-BMP/Smad signaling pathway in BMSCs [J]. Biomaterials, 2013, 34(18): 4404-4417.

[24] Lu Lanxin, Zhang Xiaofeng, Wang Yanyan, et al. Effects of hydroxyapatite-containing composite nanofibers on osteogenesis of mesenchymal stem cells in vitro and bone regeneration in vivo [J]. ACS Appl Mater Interfaces, 2013, 5(2): 319-330.

[25] 王培偉, 陳憲剛，王紅聲,等.靜電紡殼聚糖-膠原蛋白復(fù)合納米纖維的細胞相容性 [J]. 中國組織工程研究與臨床康復(fù), 2008, 12(1): 5-9.