楊 寧，包雨卓，趙浡彤，呂 巖，彭瞰看，田 宇，徐慶華，于 晶，王軍虹，蒼 晶

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030； 2.廣東白云學(xué)院，廣東廣州 510450)

低溫脅迫是限制小麥產(chǎn)量的主要因素。ABA是重要的植物激素之一。研究證實(shí)，外源施加ABA能夠促進(jìn)植物體內(nèi)ABA的合成和運(yùn)輸，增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，提高抗氧化酶活性，誘導(dǎo)抗寒相關(guān)基因表達(dá)以及促進(jìn)相關(guān)酶的重新合成，從而提高植物抗寒性[1-2]。氟啶酮是ABA合成的抑制劑，通過抑制ABA前體物質(zhì)類胡蘿卜素的合成，從而抑制植物體內(nèi)ABA的合成[3-4]。用氟啶酮作對(duì)照，可進(jìn)一步明確哪些蛋白可能受到ABA的誘導(dǎo)。

雙向電泳技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵技術(shù)，在植物抗逆相關(guān)研究中應(yīng)用日趨廣泛，對(duì)植物抗寒等抗性研究已取得了一些進(jìn)展。Meza-Basso等[5]首次通過雙向電泳技術(shù)在油菜中發(fā)現(xiàn)受低溫誘導(dǎo)的蛋白，并在多種植物中得到應(yīng)用。Hashimoto等[6]采用雙向電泳在對(duì)低溫脅迫下水稻幼苗的研究中發(fā)現(xiàn)，水稻葉鞘、葉片和根系在低溫處理后出現(xiàn)39個(gè)蛋白差異點(diǎn)。Cui等[7]采用雙向電泳對(duì)不同溫度處理下水稻幼苗葉片蛋白進(jìn)行分離，鑒定到41個(gè)低溫誘導(dǎo)蛋白。Gao等[8]采用雙向電泳在對(duì)鹽芥蓮座葉響應(yīng)低溫脅迫的蛋白研究中發(fā)現(xiàn)，所有參與RNA代謝、防御和蛋白代謝的蛋白質(zhì)都顯著上調(diào)。

東農(nóng)冬麥1號(hào)是首例可在北方高寒地區(qū)安全越冬的強(qiáng)抗寒冬小麥品種，返青率大于85%。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，東農(nóng)冬麥1號(hào)分蘗節(jié)是其物質(zhì)準(zhǔn)備能力和抗寒代謝適應(yīng)最強(qiáng)的器官，在冬小麥安全越冬中起重要作用[9]。鑒于此，本試驗(yàn)以東農(nóng)冬麥1號(hào)為材料，于三葉期分別外源噴施10 μmol·L-1ABA和50 μmol·L-1氟啶酮，待大田自然降溫至4 ℃和-25 ℃時(shí)取分蘗節(jié)，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)各處理組全蛋白進(jìn)行分離，然后進(jìn)一步采用雙向電泳分離蛋白，篩選出與ABA調(diào)控相關(guān)或與低溫應(yīng)答相關(guān)的差異蛋白后進(jìn)行質(zhì)譜分析，探討外源ABA對(duì)低溫下冬小麥蛋白質(zhì)組的影響，進(jìn)而揭示冬小麥抗寒的蛋白質(zhì)基礎(chǔ)及其與ABA調(diào)控的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料種植及取樣

供試冬小麥(TriticumaestivumL.)材料為東農(nóng)冬麥1號(hào)，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥育種研究室提供。

選取籽粒飽滿一致的冬小麥種子于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田播種。完全區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，小區(qū)行長(zhǎng)1.5 m，10行區(qū)，行距0.2 m，播種量為450粒·m-2，播深5 cm，常規(guī)管理。待冬小麥生長(zhǎng)至三葉期時(shí)，分別采用10 μmol·L-1ABA、50 μmol·L-1氟啶酮(二者濃度為前期試驗(yàn)確定的最適濃度)進(jìn)行葉面噴施，用量為0.25 L·m-2，以噴施等量蒸餾水為對(duì)照。分別于10 d最低溫平均4 ℃和-25 ℃時(shí)取樣。各處理分別取50株長(zhǎng)勢(shì)相似的麥苗，將分蘗節(jié)剪成0.5 cm的小段，混勻后用液氮迅速冷凍，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 全蛋白的提取、裂解及定量

全蛋白的提取參照Damerval等[10]的方法并略作改進(jìn)。取1.0 g樣品在液氮中充分研磨，轉(zhuǎn)入50 mL離心管中。加入10 mL預(yù)冷的10% 三氯乙酸(TCA)/丙酮溶液，于-20 ℃冰箱放置45 min。4 ℃、16 000 r·min-1離心15 min，棄上清，重懸沉淀。加入10 mL預(yù)冷的10% TCA/丙酮溶液，于-20 ℃冰箱放置45 min。4 ℃、16 000 r·min-1離心15 min，棄上清，沉淀中加入預(yù)冷的80%丙酮，振蕩混勻后于-20 ℃冰箱放置45 min(重復(fù)兩次該步驟)。棄上清，沉淀低溫冷凍干燥成粉末狀。

在上述所得到的粉末狀蛋白質(zhì)樣品中加入500 μL裂解液(7 mol·L-1尿素、2 mol·L-1硫脲、4% CHAPS、65 mol·L-1DTT、2% IPG buffer)混勻，渦旋振蕩20 min，4 ℃過夜。取上清，用蛋白質(zhì)定量試劑盒(2-D Quant-Kit，GE-Healthcare)定量。

1.3 蛋白雙向電泳

根據(jù)蛋白質(zhì)含量吸取一定體積的蛋白溶液，加適量水化液(7 mol·L-1尿素、2 mol·L-1硫脲、2% CHAPS、20 mmol·L-1DTT、0.5% IPG buffer、0.1%溴酚藍(lán))補(bǔ)齊至450 μL，加入膠條槽中，用24 cm IPG strip覆蓋，通過Ettan IPGphor Ⅲ(GE-Healthcare)進(jìn)行等電聚焦，聚焦程序設(shè)置為：主動(dòng)水化30 V 10 h，200 V 1 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，4 000 V 1 h，8 000 V 1 h，64 000 Vh聚焦，500 V維持。

第一相等電聚焦結(jié)束后，將膠條取出置于放入10 mL膠條平衡緩沖液Ⅰ[6 mol·L-1尿素、75 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.8)、29.3%甘油、2% SDS、0.002%溴酚藍(lán)、1% DTT]的水化盤中，平衡15 min。取出后再放入10 mL膠條平衡緩沖液Ⅱ[6 mol·L-1尿素、75 mmol·L-1Tris-HCl(pH 8.8)、29.3%甘油、2% SDS、0.002%溴酚藍(lán)、2.5%碘乙酰胺]中平衡15 min。平衡完畢后，將膠條在電極緩沖液中浸泡2 s后轉(zhuǎn)移到12.5%的SDS-PAGE凝膠上，低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠后，應(yīng)用Ettan Dalt Six(GE-Healthcare)進(jìn)行第二相SDS-PAGE電泳，20 ℃恒溫下，1 W 30 min，13 W直至溴酚藍(lán)移至凝膠底部，電泳停止。

1.4 染色與脫色

電泳結(jié)束后，將膠塊取出置于20%TCA中固定15 min后，用染色液(450 mL蒸餾水、450 mL無(wú)水乙醇、100 mL冰乙酸、2.5 g考馬斯亮藍(lán)R250)染色2 h后，轉(zhuǎn)至脫色液中(450 mL蒸餾水、450 mL無(wú)水乙醇、100 mL冰乙酸)中，不斷更換脫色液直到條帶清晰可見。

1.5 凝膠掃描及質(zhì)譜分析

待凝膠背景清晰后，用Ettan Image Scanner掃描儀拍照后，將凝膠保存于含有10%冰乙酸的溶液中。利用ImageMasterTM2D Platinum 7.0軟件(GE Healthcare)對(duì)圖像進(jìn)行分析，篩選出差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)，選擇相對(duì)體積改變大于2倍的蛋白點(diǎn)，借助SPSS進(jìn)行分析，選擇其中差異倍數(shù)在2倍以上的24個(gè)蛋白點(diǎn)切膠后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

用含50%乙腈的25 mmol·L-1碳酸氫銨洗脫后乙腈脫水。56 ℃下用10 mmol·L-1DTT打開二硫鍵，然后暗處55 m mol·L-1IAM處理，進(jìn)行半胱氨酸的烷基化封閉，最后用胰蛋白酶溶液裂解。裂解液用MALDI-TOF/TOF進(jìn)行肽指紋圖譜及二級(jí)質(zhì)譜測(cè)定。質(zhì)譜儀檢測(cè)時(shí)設(shè)置參數(shù)為：檢測(cè)模式為反射模式，譜圖質(zhì)量范圍為500～3 500 Da，分辨率為50 000。默認(rèn)每張一級(jí)譜圖選擇5個(gè)母離子進(jìn)行二級(jí)鑒定。蛋白質(zhì)膠點(diǎn)鑒定主要是通過試驗(yàn)產(chǎn)生的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，與數(shù)據(jù)庫(kù)模擬得到的理論質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配，從而得到蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 各處理組冬小麥分蘗節(jié)的雙向電泳圖譜

4 ℃時(shí)，各處理組雙向電泳結(jié)果如圖1。對(duì)圖1各處理組進(jìn)行軟件分析，得到可匹配的蛋白點(diǎn)587個(gè)。ABA處理組與對(duì)照組相比，133個(gè)蛋白點(diǎn)差異表達(dá)變化量達(dá)到2倍以上，其中，115個(gè)蛋白點(diǎn)上調(diào)，18個(gè)蛋白點(diǎn)下調(diào)(圖1a、圖1b)；氟啶酮處理組與對(duì)照組相比，59個(gè)蛋白點(diǎn)差異表達(dá)變化量達(dá)到2倍以上，其中，31個(gè)點(diǎn)上調(diào)，28個(gè)點(diǎn)下調(diào)(圖1a、圖1c)；ABA處理組與氟啶酮處理組相比，差異表達(dá)變化量達(dá)到2倍以上的點(diǎn)有64個(gè)，其中36個(gè)點(diǎn)上調(diào)，28個(gè)點(diǎn)下調(diào)(圖1b、圖1c)。

25 ℃時(shí)，各處理組雙向電泳結(jié)果如圖2。對(duì)圖2各處理組進(jìn)行軟件分析得到可以匹配的蛋白點(diǎn)394個(gè)。ABA處理組與對(duì)照組相比，61個(gè)蛋白點(diǎn)差異表達(dá)變化量達(dá)到2倍以上，其中，41個(gè)蛋白點(diǎn)上調(diào)，20個(gè)蛋白點(diǎn)下調(diào)(圖2a、圖2b)；氟啶酮處理組與對(duì)照組相比，84個(gè)蛋白點(diǎn)差異表達(dá)變化量達(dá)到2倍以上，其中，29個(gè)點(diǎn)上調(diào)，55個(gè)點(diǎn)下調(diào)(圖2a、圖2c)；ABA處理組與氟啶酮處理組相比，差異表達(dá)變化量達(dá)到2倍以上的點(diǎn)有65個(gè)，其中34個(gè)點(diǎn)上調(diào)，31個(gè)點(diǎn)下調(diào)(圖2b、圖2c)。

a：對(duì)照組；b：ABA處理組；c：氟啶酮處理組。圖2同。

a:Control; b:ABA treatment; c:Fluridone treatment. The same in figure 2.

圖14℃時(shí)各處理組的2-DE圖譜

Fig.12-DEmapsofeachtreatmentat4℃

2.2 差異表達(dá)蛋白點(diǎn)的選擇和質(zhì)譜鑒定結(jié)果

對(duì)各處理之間差異倍數(shù)達(dá)到2倍以上的蛋白點(diǎn)進(jìn)行篩選，選擇在低溫下變化倍數(shù)較大及在ABA處理組和氟啶酮處理組中變化相反的23個(gè)蛋白點(diǎn)，和低溫下消失的蛋白點(diǎn)1個(gè)，共24個(gè)蛋白點(diǎn)(圖3)。其中，21個(gè)(點(diǎn)1～14、點(diǎn)16～17、點(diǎn)19～23)在ABA處理組中上調(diào)，而在氟啶酮處理組下調(diào)；2個(gè)(點(diǎn)15、點(diǎn)18)在ABA處理組中下調(diào)，而在氟啶酮處理組上調(diào)；1個(gè)(點(diǎn)24)在4 ℃特異表達(dá)，-25 ℃消失的蛋白點(diǎn)。對(duì)以上篩選到的24個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，均得到了完整的肽指紋圖譜，Mascot數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果如表1示，其中15種為已知蛋白，9種未知蛋白。

由圖4可知，鑒定出的蛋白與譜圖匹配的肽段長(zhǎng)度占整個(gè)蛋白長(zhǎng)度40%～100%、35%～40%、30%～35%、25%～30%的分別有28%、20%、11%、11%，說明鑒定出的蛋白覆蓋率較高，有較高的可信度。

圖3 4 ℃下進(jìn)行質(zhì)譜分析的蛋白點(diǎn)

2.3 差異蛋白的功能分析

已鑒定出的差異蛋白可分為逆境蛋白、代謝相關(guān)蛋白、轉(zhuǎn)錄翻譯相關(guān)蛋白和未知蛋白。逆境蛋白包括低溫誘導(dǎo)蛋白16(點(diǎn)1)、低溫響應(yīng)RNA結(jié)合蛋白(點(diǎn)2)、冷調(diào)節(jié)蛋白(點(diǎn)16、點(diǎn)17)。代謝相關(guān)蛋白包括磷酸甘油酸變位酶(點(diǎn)4)、磷酸甘油酸激酶(點(diǎn)23)、ATP合酶β亞基(點(diǎn)5)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶1(點(diǎn)7)、26S蛋白酶非ATP酶調(diào)節(jié)亞基(點(diǎn)10)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(點(diǎn)11)和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶F5(點(diǎn)15)。轉(zhuǎn)錄翻譯相關(guān)蛋白包括新生多肽相關(guān)復(fù)合物β亞基(點(diǎn)3)、4A真核起始因子(點(diǎn)6)和真核翻譯起始因子5A3(點(diǎn)24)。未知蛋白包括點(diǎn)8、9、12、13、14、18、19、20、21和22。

表1 質(zhì)譜分析結(jié)果Table 1 Results of mass spectrometry

圖例中，百分?jǐn)?shù)表示蛋白鑒定覆蓋率，括號(hào)內(nèi)數(shù)字表示覆蓋率范圍內(nèi)的蛋白種類數(shù)。

In the legend,the percentage indicates protein sequence coverage,and the data in the parenthesis indicates the number of protein species within that sequence coverage.

圖4蛋白鑒定覆蓋率分布

Fig.4Distributionofproteinsequencecoverage

3 討 論

3.1 逆境蛋白

低溫誘導(dǎo)蛋白16(cold induced 16, WCI16)(點(diǎn)1)是冬小麥在冷馴化期間誘導(dǎo)的一種蛋白，Sasaki K等[11]的研究從晚期胚胎發(fā)育蛋白(late embriogenesis abundant protein, LEA)通常具有的4個(gè)特征(超親水性、沸騰溶解度、應(yīng)力誘導(dǎo)性和應(yīng)激保護(hù)性)證明了WCI16可能代表一類新的LEA蛋白。植物L(fēng)EA蛋白被認(rèn)為是一種逆境響應(yīng)蛋白，低溫、干旱及ABA等均可誘導(dǎo)其表達(dá)，其中ABA是LEA蛋白基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子，根據(jù)LEA蛋白基因表達(dá)是否依賴ABA可分為ABA依賴型和非ABA依賴型[12]。本試驗(yàn)中WCI16在ABA處理組與氟啶酮處理組表達(dá)量變化相反的特點(diǎn)，說明該蛋白可能是ABA依賴型LEA蛋白。

RNA結(jié)合蛋白(RNA-binding protein, Rbps)是基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的關(guān)鍵蛋白[13]，植物中編碼該蛋白的基因在玉米、擬南芥、煙草和大麥等植物中均被克隆得到。研究表明，擬南芥中編碼該蛋白的多個(gè)基因表達(dá)量在低溫條件下顯著增加[14]，與本研究中低溫響應(yīng)RNA結(jié)合蛋白(low temperature-responsive RNA-binding protein, LTR-Rbps)在低溫ABA處理下表達(dá)量上調(diào)的趨勢(shì)一致，而在ABA處理組與氟啶酮處理組表達(dá)量相反的結(jié)果則表明，低溫響應(yīng)RNA結(jié)合蛋白受到外源ABA的誘導(dǎo)。

冷調(diào)節(jié)蛋白(cold regulated protein, CORPs)(點(diǎn)16、17)是大多數(shù)植物在低溫馴化誘導(dǎo)條件下產(chǎn)生的一類特異性蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，除低溫外，外源ABA、鹽脅迫、干旱、熱激等逆境脅迫均能誘導(dǎo)CORPs產(chǎn)生[15]。本試驗(yàn)得到的COR蛋白WCOR18與之前報(bào)道過的大麥COR蛋白Tma-ap3具有高度同源性[16]。

3.2 代謝相關(guān)蛋白

磷酸甘油酸變位酶(phosphoglycerate mutase, PGAM)(點(diǎn)4)是糖酵解和糖異生途徑中催化3-磷酸甘油酸和2-磷酸甘油酸相互轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶，一般分為輔因子依賴型PGAM(dPGAM)和輔因子非依賴型PGAM(iPGAM)，其中，iPGAM廣泛分布在植物中，并且在響應(yīng)非生物脅迫中起重要作用。Amme等[17]在擬南芥的低溫脅迫研究中發(fā)現(xiàn)，AtiPGAM1表達(dá)量顯著升高，說明AtiPGAM1在植物遭受冷脅迫時(shí)起正調(diào)節(jié)作用。本試驗(yàn)中PAGM在低溫和ABA處理下表達(dá)量上升，說明該酶能夠響應(yīng)植物的低溫脅迫，并可能受到外源ABA的誘導(dǎo)。

磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase, PGK)(點(diǎn)23)的主要功能是作為糖酵解途徑的關(guān)鍵酶，催化1,3-二磷酸甘油酸轉(zhuǎn)化成3-磷酸甘油酸的過程，并產(chǎn)生1分子ATP，逆反應(yīng)生成1分子ADP[18]。PGK在非生物脅迫下表達(dá)量升高產(chǎn)生ATP以增強(qiáng)植物抗性，該結(jié)果在水稻[19]和豌豆[20]均已被證實(shí)。本研究中PGK在低溫和ABA處理下表達(dá)量升高，說明PGK能夠提高植物在低溫脅迫下的抗性，一定量的ABA可能誘導(dǎo)PGK表達(dá)量升高從而增強(qiáng)植物抗逆性。

20S蛋白酶體能選擇性降解氧化脅迫受損的蛋白，這一功能不依賴ATP和泛素[21]。本研究中得到的26S蛋白酶體非ATP酶調(diào)節(jié)亞基(26S proteasome non-ATPase regulatory subunit, 26SRP)(點(diǎn)10)在低溫下表達(dá)量增加，可能是為了清除低溫脅迫中被氧化的正常蛋白質(zhì)，在ABA處理下表達(dá)量增加結(jié)果則表明，該蛋白可能受到外源ABA的誘導(dǎo)。

ATP合成酶廣泛分布于線粒體膜和葉綠體類囊體膜上。作為在高等植物能量代謝中的關(guān)鍵酶之一，它跨膜質(zhì)子動(dòng)力促進(jìn)合成ATP，參與氧化磷酸化和光合磷酸化反應(yīng)。本試驗(yàn)中ATP合成酶β-亞基(ATP synthase subunit beta, ATPase-β)(點(diǎn)5)的表達(dá)量上調(diào)這一結(jié)果與Kong等[22]在 OsNAS1轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜鹽脅迫條件下得到的結(jié)論一致?；谝陨贤茰y(cè)，ATP合成酶β-亞基在低溫下ABA處理后參與離子轉(zhuǎn)運(yùn)能力增強(qiáng)，從而降低細(xì)胞滲透勢(shì)，提高植物的抗寒性。

谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶在植物的初級(jí)代謝和次級(jí)代謝、耐受脅迫和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中行使許多不同的功能，從而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。植物GST家族中的許多成員都與植物抗逆性有關(guān)，如對(duì)除草劑、高鹽、低溫和紫外輻射等的抗性[23]。Harshavardhanan等[24]在關(guān)于甘藍(lán)GST的全基因組表征研究中，發(fā)現(xiàn)BoGST基因具有潛在的抗寒功能。本研究中谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶1(glutathione S-transferase 1, GST1)(點(diǎn)7)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glutathione transferase,GST)(點(diǎn)11)在低溫下ABA處理后表達(dá)量上調(diào)，而谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶F5(glutathione transferase F5, GSTF5)(點(diǎn)15)則下調(diào)，這一結(jié)果表明GST參與植物應(yīng)對(duì)低溫脅迫的調(diào)控過程，一定濃度ABA能提高植物抗寒性。點(diǎn)15表達(dá)量下調(diào)，則可能是由于這三種不同的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶調(diào)控的反應(yīng)不同導(dǎo)致的，點(diǎn)7、點(diǎn)11和點(diǎn)15的調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

3.3 轉(zhuǎn)錄翻譯相關(guān)蛋白

新生多肽復(fù)合物β亞基(點(diǎn)3)即為基本轉(zhuǎn)錄因子3(basic transcription factor 3, BTF3)。有研究從小麥中克隆到一個(gè)受凍害脅迫誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)的BTF3家族基因 TaBTF3，該基因在鹽、干旱、冷、ABA、MeJA和SA脅迫處理下均被誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)[25]，這與本試驗(yàn)得到的該蛋白在低溫、ABA處理下表達(dá)量上調(diào)的結(jié)果一致。

本研究中真核翻譯起始因子4A(eukaryotic initiation factor 4A, eIF4A)(點(diǎn)6)在低溫ABA處理?xiàng)l件下表達(dá)量增加，能夠增加其與真核基因啟動(dòng)子區(qū)域中順式作用元件的特異性結(jié)合，通過與其他相關(guān)蛋白的相互作用，激活轉(zhuǎn)錄過程，增強(qiáng)目的基因的表達(dá)強(qiáng)度，增加目的蛋白的表達(dá)量，從而影響植物抗寒能力。與Stockinger等[26]在研究擬南芥中由 CBF1編碼含有轉(zhuǎn)錄因子的AP2結(jié)構(gòu)域在低溫脅迫條件下的調(diào)節(jié)作用時(shí)也得到類似的研究結(jié)果。

真核細(xì)胞翻譯起始因子5A(eukaryotic translation initiation factor 5A3, eIF5A)是真菌、動(dòng)植物體內(nèi)普遍存在的蛋白質(zhì)翻譯起始因子。擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)了三個(gè)表達(dá)特征不同的eIF5Ab編碼基因[27]，其中，eIF5A3在細(xì)胞分裂活躍的吸脹種子中高表達(dá)，在擬南芥中過表達(dá)eIF5A3，花瓣從正常的四瓣變?yōu)槲灏辏~子變?yōu)椴⑸~，種子變?yōu)樵瓉淼膬杀洞螅f明eIF5A3在發(fā)育早期促進(jìn)細(xì)胞分裂。本研究中真核翻譯起始因子5A3(點(diǎn)24)在4 ℃下特異表達(dá)，該時(shí)期恰好是冬小麥分蘗的旺盛期，與其分蘗節(jié)的細(xì)胞增殖相適應(yīng)，而在-25 ℃時(shí)該蛋白消失，與小麥在-25 ℃低溫下細(xì)胞分裂停滯相一致，可能是低溫下eIF5A3不表達(dá)的結(jié)果。

綜上所述，植物應(yīng)對(duì)低溫是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控過程。本研究發(fā)現(xiàn)外源ABA處理下，與對(duì)照組相比出現(xiàn)顯著差異的蛋白可分為逆境蛋白、代謝相關(guān)蛋白和轉(zhuǎn)錄翻譯相關(guān)蛋白。其中，代謝相關(guān)蛋白最多，包括物質(zhì)代謝和能量代謝。糖代謝相關(guān)蛋白在ABA處理下表達(dá)量上調(diào)，促進(jìn)植物新陳代謝，為抵御外界脅迫提供一定動(dòng)力，本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，ABA對(duì)東農(nóng)冬麥1號(hào)糖代謝有促進(jìn)作用[1]。ATP合成酶相關(guān)蛋白在ABA處理后表達(dá)量上調(diào)，為植物體內(nèi)抵抗脅迫的各種代謝活動(dòng)提供能量。有兩種低溫誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子在ABA處理組表達(dá)量上調(diào)，通過在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控相關(guān)目的蛋白的表達(dá)量，從而增強(qiáng)植物抗寒性。逆境蛋白都在ABA處理組上調(diào)，氟啶酮處理組下調(diào)，說明ABA對(duì)冬小麥抗逆性的提高起重要作用。此外，本研究還有10種未知蛋白，這主要由于小麥的蛋白信息相對(duì)比較匱乏，但近年來蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展迅速，相信隨著蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善，這些問題會(huì)很快得到解決。

[1] 劉麗杰,蒼 晶,李懷偉,等.外源ABA對(duì)冬小麥越冬期呼吸代謝關(guān)鍵酶與糖代謝的影響[J].麥類作物學(xué)報(bào),2013,33(1):71.

LIU L J,CANG J,LI H W,etal.Effects of exogenous abscisic acid on key enzymes of respiratory metabolism and sugar metabolism of winter wheat in the wintering period [J].JournalofTriticeaeCrops,2013,33(1):71.

[2] ZENG Y,YU J,CANG J,etal.Detection of sugar accumulation and expression levels of correlative key enzymes in winter wheat(Triticumaestivum) at low temperatures [J].BioscienceBiotechnologyBiochemistry,2011,75(4):681.

[3] TOSHIHITO Y,TAKASHI E,SHIGERU S.Restoration of seed germination at supraoptimal temperatures by fluridone,an inhibitor of abscisic acid biosynthesis [J].PlantCellPhysiology,1998,39(3):308.

[4] RASMUSSEN R D,HOLE D,HESS J R,etal.Wheat kernel dormancy and(+)-abscisic acid level following exposure to fluridone [J].JournalofPlantPhysiology,1997,150(4):444.

[5] MEZA-BASSO L,ALBERDI M,RAYNL M,etal.Changes in protein synthesis in rapeseed seedlings during a low temperature treatment [J].PlantPhysiology,1986,82(3):733.

[6] HASHIMOTO M,KOMATSU S.Proteomic analysis of rice seedlings during cold stress [J].Proteomics,2007,7(8):1293.

[7] CUI S,HUANG F,WANG J,etal.A proteomic analysis of cold stress responses in rice seedlings [J].Proteomics,2005,5(12):3162.

[8] GAO F,ZHOU Y,ZHU W,etal.Proteomic analysis of cold stress-responsive proteins inThellungiellarosette leaves [J].Planta,2009,230(5):1043.

[9] 于 晶,張 林,崔 紅,等.高寒地區(qū)冬小麥東農(nóng)冬麥1號(hào)越冬前的生理生化特征[J].作物學(xué)報(bào),2008,34(11):2020.

YU J,ZHANG L,CUI H,etal.Physiological and biochemical characteristics of Dongnongdongmai 1 before wintering in high-cold area [J].ActaAgronomicaSinica,2008,34(11):2020.

[10] DAMERVAL C,VIENNE D D,ZIVY M,etal.Technical improvements in two-dimensional electrophoresis increase the level of genetic variation detected in wheat-seedling proteins [J].Electrophoresis,1986,7(1):52.

[11] SASAKI K,CHRISTOV N K,TSUDA S,etal.Identification of a novel LEA protein involved in freezing tolerance in wheat [J].PlantandCellPhysiology,2014,55(1):136.

[12] 劉 洋,邢 鑫,李德全.LEA蛋白的分類與功能研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào),2011(8):38.

LIU Y,XING X,LI D Q.Studies on classification and function of LEA proteins [J].BiotechnologyBulletin,2011(8):38.

[13] 唐 蜻.植物RNA結(jié)合蛋白研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(1):38.

TANG J.Research progress on the plant RNA-binding proteins [J].JournalofAnhuiAgriculturalScience,2010,38(1):38.

[14] FUSARO A F,BOCCA S N,RAMOS R L B,etal.AtGRP2,a cold-induced nucleo-cytoplasmic RNA-binding protein,has a role in flower and seed development [J].Planta,2007,225:1348.

[15] 郭新勇,程 晨,王愛英,等.天山雪蓮冷調(diào)節(jié)蛋白基因siCOR轉(zhuǎn)化煙草植株的抗旱性分析[J].植物學(xué)報(bào),2012,47(2):115.

GUO X Y,CHENG C,WANG A Y,etal.Drought-tolerance analysis of tobacco plant transformed withSasussuredinvolucratasiCORgene [J].ChineseBulletinofBotany,2012,47(2):115.

[16] KOBAVASHIA F,TAKUMIA S,NAKATAA M,etal.Comparative study of the expression profiles of theCor/Leagene family in two wheat cultivars with contrasting levels of freezing tolerance [J].PhysiologlaPlantarum,2003,120:591.

[17] AMME S,MATROS A,SCHLESIER B,etal.Proteome analysis of cold stress response inArabidopsisthalianausing DIGE-technology [J].JournalofExperimentalBotany,2006,57(7):1537.

[18] 郭 楠,趙敬會(huì),高天姝,等.甘藍(lán)型油菜PGK基因的克隆與表達(dá)分析[J].西北植物學(xué)報(bào),2014,34(11):2189.

GUO N,ZHAO J H,GAO T S,etal.Cloning and expression analysis of PGK gene inBrassicanapus[J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica,2014,34(11):2189.

[19] SINGH R,JWA N S.Understanding the responses of rice to environmental stress using proteomics [J].JournalofProteomeResearch,2013,12:4652.

[20] KHATOON A,REHMAN S,HIRAGA S,etal.Organ-specific proteomics analysis for response mechanism in soybean seedlings under flooding stress [J].JournalofProteomics,2012,75:5706.

[21] SHRINGARPURE R,GRUNESCAPE T,MEHLHASE J,etal.Ubiquitin conjugation is not required for the degradation of oxidized proteins by proteasome [J].JournalofBiologicalChemistry,2003,278(1):311.

[22] KONG F,MAO S,DU K,etal.Comparative proteomics analysis of OsNAS1 transgenicBrassicanapusunder salt stress [J].ChineseScienceBulletin,2011,56(22):2343.

[23] 胡廷章,周大祥,羅 凱.植物谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)與功能及其基因表達(dá)[J].植物生理學(xué)通訊,2007,43(1):198.

HU T Z,ZHOU D X,LUO K.Structure and biological function of glutathione transferases and their genes in plant [J].PlantPhysiologyCommunications,2007,43(1):198.

[24] HARSHAVARDHANAN V,SENTHIL K T,ASHOKRAJ S,etal.Glutathione transferases superfamily:cold-inducible expression of distinctGSTgenes inBrassicaoleracea[J].InternationalJournalofMolecularSciences,2016,17:1211.

[25] KANG G Z,MA H Z,LIU G Q,etal.Silencing of TaBTF3 gene impairs tolerance to freezing and drought stresses in wheat [J].MolecularGeneticsandGenomics,2013,288:591.

[26] STOCKINGER E J,GILMOUR S J,THOMASHOW M F,etal.ArabidopsisthalianaCBF1 encodes an AP2 domain containing transcriptional activator that binds to the C-repeat/DRE,acis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature and water deficit [J].PlantBiology,1997,94:1039.

[27] THOMPSON J E,HOPKINS M T,TAYLOR C,etal.Regulation of senescence by eukaryotic translation initiation factor 5A:implications for plant growth and development [J].TrendsinPlantScience,2004,9(4):177.