霍璐陽(yáng) 李志國(guó) 劉晴 劉宇彤 董愛(ài)榮

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

化學(xué)農(nóng)藥中高毒、高殘留、難降解的農(nóng)藥是重要的環(huán)境污染物，不僅污染土壤環(huán)境和農(nóng)作物，而且還進(jìn)一步污染到地面水體和地下水以及海洋環(huán)境，直接威脅著人類(lèi)的生存環(huán)境和身體健康。長(zhǎng)期持續(xù)使用化學(xué)農(nóng)藥，會(huì)對(duì)環(huán)境和生物產(chǎn)生危害，而且由于耐藥性的產(chǎn)生防治效果逐漸減弱，農(nóng)藥的殘留也給生態(tài)環(huán)境帶來(lái)許多負(fù)面影響[1]。

土壤酶是土壤的重要組成部分，參與土壤中所有的生化反應(yīng)，在物質(zhì)轉(zhuǎn)化、能量代謝、污染土壤修復(fù)等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[2]。土壤酶是存在于土壤中的生物催化劑，土壤中所進(jìn)行的一切生物化學(xué)過(guò)程都要經(jīng)過(guò)酶的催化才能完成。土壤酶活性不僅是土壤理化性質(zhì)的具體反應(yīng)，而且還是土壤生物活性的重要體現(xiàn)。由于土壤酶的種類(lèi)繁多，其單一酶活性也只能夠反應(yīng)土壤中某種特定生物化學(xué)及養(yǎng)分循環(huán)的過(guò)程[3]。一般情況下，土壤各養(yǎng)分含量與土壤酶活性之間有較好的相關(guān)關(guān)系[4]。脲酶作用是極為專(zhuān)性的，它能水解土壤中的尿素，生成氨、二氧化碳和水。土壤脲酶活泩的測(cè)定方法較多[5]，常用的方法有比色法、擴(kuò)散法和電極法等。邱莉萍等[6]研究表明，土壤中脲酶與磷酸酶活性的大小受土壤的理化性質(zhì)和其他酶活性的影響。近年來(lái)，隨著土壤酶活性研究方法及技術(shù)的不斷更新，加之與其他學(xué)科的交叉與整合，不少學(xué)者發(fā)現(xiàn)，土壤酶具有評(píng)價(jià)土壤肥力[7]、診斷土壤污染[8]、評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量[9]、培肥土壤[10]及防治植物病蟲(chóng)害[11]等方面的功能。土壤脲酶活性可以表征土壤氮素的狀況，通過(guò)測(cè)定各時(shí)期脲酶活性的變化，研究短密木霉、大豆與咪唑乙煙酸與脲酶之間的相關(guān)性，為咪唑乙煙酸的酶促降解提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

盆栽模擬試驗(yàn)土壤為m(草炭)∶m(沙子)∶m(土)=5∶3∶2的比例進(jìn)行混合所得。大豆品種是黑農(nóng)48，菌種是試驗(yàn)前期馴化得到的高效降解菌株短密木霉(Trichodermabrevicompactum)。

培養(yǎng)真菌的培養(yǎng)基采用孟加拉紅培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g、葡萄糖10.0 g、磷酸二氫鉀1.0 g、硫酸鎂0.5 g、瓊脂20.0 g、1/3 000孟加拉紅溶液100 mL、蒸餾水1 000 mL、氯霉素0.1 g。

保存菌株采用PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 試驗(yàn)方法

將短密木霉接種于60個(gè)PDA平板中，放入培養(yǎng)箱，25 ℃、黑暗條件下培養(yǎng)5 d。待菌株大量產(chǎn)孢后，將菌絲連同孢子刮下，加入到盛有無(wú)菌水的燒杯中，放入少量的吐溫80，用玻璃棒充分的攪拌，均勻地混入部分試驗(yàn)用土壤中。再將部分試驗(yàn)用土壤加入不等量的5%咪唑乙煙酸水劑，分別制成咪唑乙煙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50、100、150 mg·kg-1的污染土。選擇籽粒飽滿(mǎn)、均勻、無(wú)病蟲(chóng)的大豆種子，每盆擺15粒，覆土2.0 cm，放在盆栽?xún)?nèi)自然生長(zhǎng)。

按表1設(shè)計(jì)盆栽試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，種植于東北林業(yè)大學(xué)溫室大棚中。盆栽處理后5、10、20、30、40 d分別用五點(diǎn)法取土樣，風(fēng)干，過(guò)10目篩，放入冰箱4 ℃保存待用。

表1 盆栽試驗(yàn)處理組合

1.3 土壤脲酶活性測(cè)定方法

采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法[12]測(cè)定土壤脲酶活性。脲酶活性以24 h后1.0 g土壤中NH3-N的毫克數(shù)表示。

m(NH3-N)=2a。

(1)

式中：a為從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查得的NH3-N質(zhì)量(mg)；2為換算成1.0 g土的系數(shù)。

每處理組設(shè)3組重復(fù)，并設(shè)無(wú)土對(duì)照和無(wú)基質(zhì)對(duì)照組。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作：在測(cè)定樣品吸光值之前，分別取0、1、3、5、7、9、11、13 mL氮工作液，移于50 mL容量瓶中，然后補(bǔ)加蒸餾水至20 mL，再加入4 mL苯酚鈉溶液和3 mL次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻。20 min后顯色，定容。1 h內(nèi)在分光光度計(jì)上于578 nm波長(zhǎng)處比色。然后以氮工作液濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

比色法測(cè)定土壤脲酶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

y=0.038 4x-0.003 9(R2=0.997 9)。

(2)

式中：x為氮工作液濃度，y為吸光度。

脲酶抑制(激活)率=((d-c)/c)×100%。

(3)

式中：c為空白對(duì)照處理的脲酶活性；d為農(nóng)藥處理的脲酶活性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)的整理采用Excel軟件完成；差異顯著性測(cè)驗(yàn)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 短密木霉對(duì)土壤脲酶活性的影響

由表2可知，在土壤中加入短密木霉后，土壤脲酶活性呈現(xiàn)出抑制—恢復(fù)—激活的趨勢(shì)。在培養(yǎng)期間，A5與CK的脲酶活性差異性顯著(P<0.05)。土壤脲酶活性5 d時(shí)有所下降，但從10 d起有顯著的激活趨勢(shì)，20 d時(shí)基本恢復(fù)到對(duì)照水平。脲酶活性到30 d后呈現(xiàn)激活狀態(tài)直到試驗(yàn)結(jié)束。脲酶活性是表征土壤供氮能力的重要指標(biāo)。處理30 d土壤氮素水平最高，激活率最高，達(dá)到31.13%。這可能是由于土壤中微生物死亡，細(xì)胞中的脲酶被釋放到土壤中，增強(qiáng)了土壤脲酶的活性。

表2 不同處理對(duì)土壤脲酶活性的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；采用鄧肯氏多重比較試驗(yàn)分析，同列數(shù)據(jù)后不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

2.2 種植大豆對(duì)土壤脲酶活性的影響

由表2得知，種植大豆后，土壤脲酶活性呈現(xiàn)出抑制—恢復(fù)—激活的趨勢(shì)。在培養(yǎng)期間，A4組與CK對(duì)照組的脲酶活性均差異性顯著(P<0.05)。種植大豆5 d時(shí)抑制率達(dá)到最高,為10.35%，10～20 d逐漸恢復(fù)到對(duì)照組水平。30 d后土壤脲酶活性被激活，直到試驗(yàn)結(jié)束，有明顯的差異性。

2.3 咪唑乙煙酸對(duì)土壤脲酶活性的影響

由表2可知，當(dāng)土壤中咪唑乙煙酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為50、100、150 mg·kg-1時(shí)，土壤脲酶活性呈現(xiàn)出抑制—激活的趨勢(shì)，土壤中脲酶活性隨著咪唑乙煙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高抑制率也在逐漸升高，在5～10 d脲酶活性被顯著抑制，A8組10 d抑制率最高，為16.18%。30 d后呈現(xiàn)激活效應(yīng)并持續(xù)到試驗(yàn)結(jié)束，在30 d時(shí)A7組激活率最高，達(dá)到85.23%；除A8組10 d脲酶活性外，其他脲酶活性均與CK對(duì)照組有明顯的差異性。

2.4 協(xié)同作用對(duì)土壤脲酶活性的影響

由表2可知，在土壤中種植大豆、加入短密木霉之后，再分別加入50、100、150 mg·kg-1的咪唑乙煙酸，土壤脲酶基本呈現(xiàn)抑制—恢復(fù)—抑制—激活的趨勢(shì)。5 d時(shí)加入50 mg·kg-1的A1組脲酶抑制率最高，達(dá)到38.42%，10 d逐漸恢復(fù)到水平對(duì)照，30 d后呈現(xiàn)激活狀態(tài)一直到試驗(yàn)結(jié)束。30 d激活率最高，達(dá)到29.29%。在加入50、100 mg·kg-1咪唑乙煙酸的對(duì)照組中，5 d時(shí)脲酶活性被抑制。而加入150 mg·kg-1的處理組卻與對(duì)照組基本持平，不加短密木霉的土壤脲酶活性變化很大，而種植大豆后的土壤脲酶活性基本無(wú)變化，這可能與大豆的固氮作用有關(guān)。短密木霉對(duì)咪唑乙煙酸有一定的降解作用，在土壤中同時(shí)加入二者后，相當(dāng)于模擬了大豆田的基本模式，咪唑乙煙酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，脲酶受到的抑制作用也就越強(qiáng)，但當(dāng)咪唑乙煙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為150 mg·kg-1時(shí)，土壤脲酶的活性卻高于在土壤中加入100 mg·kg-1的咪唑乙煙酸，可能是由于咪唑乙煙酸的淋溶作用。脲酶是對(duì)尿素轉(zhuǎn)化起關(guān)鍵作用的酶類(lèi)，脲酶活性越低，說(shuō)明這時(shí)土壤中的供氮能力越弱。

3 結(jié)論與討論

本研究表明：當(dāng)土壤中咪唑乙煙酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為50、100、150 mg·kg-1時(shí)，5～10 d脲酶活性被抑制，20～40 d時(shí)又被激活，該結(jié)果與張清明等[13]報(bào)道的氟磺胺醚100、500 μg·kg-1的處理對(duì)土壤脲酶的作用趨勢(shì)一致。在種植大豆后，加入50、100 mg·kg-1的咪唑乙煙酸的A1、A2組呈現(xiàn)抑制—激活—抑制的趨勢(shì)，該結(jié)果與王鑫宏等[14]報(bào)道的氯嘧磺隆在土壤中質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12～48 μg·g-1時(shí)對(duì)土壤脲酶的影響結(jié)果一致。咪唑乙煙酸屬咪唑啉酮類(lèi)除草劑即支鏈氨基酸生物合成抑制劑，大豆可將其代謝，所以種植大豆后并加入咪唑乙煙酸的脲酶活性要比未種植大豆的高，也說(shuō)明咪唑乙煙酸對(duì)脲酶在一定程度上有抑制作用。脲酶活性是表征土壤供氮能力的重要指標(biāo)。在土壤中加入短密木霉后，30 d土壤脲酶活性最高，土壤氮素水平最高，有可能由于土壤中微生物死亡，細(xì)胞中的脲酶被釋放到土壤中，增強(qiáng)了土壤脲酶的活性。大豆的生長(zhǎng)隨著咪唑乙煙酸添加的毫克數(shù)的增加，受到的抑制力就越大。

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