羅麗芬　江冰冰　鄧琳梅　梅馨月　黃惠川　劉屹湘　楊敏　朱書生

摘要：【目的】探究三七根系分泌物對(duì)根腐病原菌生長(zhǎng)的影響，為解析三七根系分泌物介導(dǎo)的植物與土傳病原菌互作機(jī)制提供理論依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^根系與病原菌孢子互作的方式研究三七根系對(duì)根腐病原菌茄腐鐮刀菌F3（Fusarium solani）和惡疫霉菌D-1（Phytophthora cactorum）孢子萌發(fā)及芽管生長(zhǎng)方向的影響;收集三七根系分泌物并利用氣相色譜—飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-TOF-MS）分析根系分泌物中的成分;通過菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定三七根系分泌物中部分糖類、氨基酸類和長(zhǎng)鏈有機(jī)酸對(duì)三七根腐病原菌生長(zhǎng)的影響?！窘Y(jié)果】三七根系能顯著促進(jìn)茄腐鐮刀菌和惡疫霉菌孢子萌發(fā)且對(duì)芽管生長(zhǎng)方向具有明顯的吸引作用。三七根系分泌物中主要含有酸類、醇類、糖類、氨基酸類、胺類、嘌呤嘧啶類、酯類、酮類和酚類等9類物質(zhì)。其中酸類、醇類、糖類和氨基酸類是根系分泌物中的主要成分，且長(zhǎng)鏈有機(jī)酸類（苯甲酸、鄰苯二甲酸和月桂酸）對(duì)根腐病原菌具有低促高抑效應(yīng)，糖類（纖維二糖和麥芽三糖）和天冬氨酸可作為唯一碳源和氮源促進(jìn)病原菌菌絲生長(zhǎng)，且纖維二糖和麥芽三糖能促進(jìn)根腐病原菌孢子萌發(fā)，對(duì)鐮刀菌孢子萌發(fā)的芽管具有趨化作用?！窘Y(jié)論】三七根系分泌物對(duì)根腐病原菌的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，且對(duì)芽管的生長(zhǎng)方向具有吸引作用。

關(guān)鍵詞： GC-TOF-MS;趨化;孢子萌發(fā);鐮刀菌;根腐病

中圖分類號(hào)： S435.672? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）12-2952-10

Abstract：【Objective】The effect of Panax notoginseng（Bark）F. H. Chen root exudates on root rot pathogens was studied to provide a theoretical basis for analyzing the mechanism of interaction between plant and soil-borne pathogens mediated by root exudates. 【Method】The effects of root of P. notoginseng on spore germination and germ tube growth direction of Fusarium solani and Phytophthora cactorum were studied by root-spore interaction method. The root exudates were collected and? the components of root exudates of P. notoginseng were analyzed by gas chromatography-time-of-flight mass spectrometer（GC-TOF-MS）， and then determined the effects of some metabolites（sugars， amino acids and long-chain organic acids） in root exudates on the growth of root rot pathogens by mycelium growth rate method. 【Result】The results showed that the spore germination rate of F. solani and P. cactorum was significantly increased around the root and the germ tubes had chemotaxis activity towards roots of P. notoginseng. Root exudates of P. notoginseng contained nine kinds of substances， including acids， alcohols， sugars， amino acids， amines， purines， esters， ketones and phenols. Among them， acids， alcohols， sugars and amino acids were the main components in root exudates of P. notoginseng. Long-chain organic acids （benzoic acid， pathalic acid， palmitic acid and lauric acid） could promote and inhibite the growth of root rot pathogen according to the condition. Sugars（cellobiose and maltotriose） and aspartic acid could promote the mycelium growth of pathogen as the sole carbon source and notrogen source respectively. Cellobiose and maltotriose also promoted the germination of root rot pathogen spores and had a chemotaxis on the growth of germ tube of Fusarium. 【Conclusion】Root exudates of P. notoginseng can promote the growth of root rot pathogens， and has attraction effect on the growth direction of germ tube.

Key words： GC-TOF-MS; chemotaxis; spore germination; Solani; root rot

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31772404， 31660605）; Young and Middle-aged Academic and Technical Talent Reserve Program in Yunnan（202005AC160045）;? Yunnan Academician Workstation of Chinese Academy of Engineering（2018IC063）

0 引言

【研究意義】三七[Panax notoginseng（Burk.） F. H. Chen]為五加科人參屬植物，是我國(guó)獨(dú)具特色的大宗藥用作物，具有散瘀止血、消腫定痛等功效，對(duì)心腦血管系統(tǒng)疾病具有顯著療效（張玉軍，2009）。三七的種植和加工已成為地方經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要支柱產(chǎn)業(yè)（郭旭初，2007）。三七根腐病是三七生產(chǎn)中的一類重要病害，嚴(yán)重影響三七的產(chǎn)量和質(zhì)量。三七根腐病的病原極為復(fù)雜，目前已報(bào)道的病原包括鐮孢屬真菌（Fusarium solani、F. oxysporum、F. moniliform var. intermecliumt和F. solani f. radicicola等）、柱孢屬真菌（Cylindrocarpon destructans和C. didynum）、草莖點(diǎn)霉（Phoma herbarum）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、惡疫霉（Phytophthora cactorum）、假單胞菌（Pseudomonas spp.）和線蟲（Meloidogyne spp.）等（陳昱君等，2002;繆作清等，2006;王勇等，2007;蔣妮等，2011）。生產(chǎn)中三七根腐病的防治措施主要包括農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治等，但由于根腐病的復(fù)雜性以及各防治措施自身的局限性，根腐病的防治已成為三七生產(chǎn)中急需解決的問題。明確三七根腐病發(fā)生的根本原因，可為制定合理有效的防治措施提供理論參考?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物可通過根系分泌物有選擇地募集有益或有害微生物。有研究表明，植物根系分泌的碳水化合物（如果糖、葡萄糖、半乳糖等）、氨基酸類（如谷氨酸、色氨酸、鳥氨酸等）、芳香族化合物（如香豆素、水楊酸和4-羥基苯甲酸等）及其他許多化合物既能為微生物生長(zhǎng)提供所需的養(yǎng)分，又能作為信號(hào)物質(zhì)影響微生物向根際積聚（Bais et al.，2004;Rudrappa et al.，2008;Huang et al.，2014;Canarini et al.，2019）。Xie等（2012）研究表明，植物根尖分泌的阿拉伯半乳聚糖蛋白能吸引有益微生物，但排斥病原菌向根際聚集;Carvalhais等（2015）發(fā)現(xiàn)，茉莉酸無論是外源添加還是植株合成突變均能顯著改變土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)。植物根系分泌物的組成和含量決定了根際微生物的種類和豐度，并對(duì)微生物的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)生一定影響（何歡等，2011;Peiffer et al.，2013;Tur-ner et al.，2013）。Badri等（2013）從離體培養(yǎng)的擬南芥中收集分泌物混合物，在沒有植物的情況下施用于土壤中，發(fā)現(xiàn)酚類化合物對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)和吸引作用影響最大，其次是氨基酸和糖。研究表明，擬南芥在其發(fā)育的前期和后期會(huì)影響放線菌、擬桿菌和藍(lán)藻的豐度以及微生物的活性（Chaparro et al.，2014）。三七根系分泌物中的皂苷對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)具有顯著影響，其原因是土壤中的微生物對(duì)皂苷的利用能力存在顯著差異（Luo et al.，2020）。這些研究表明，植物具有通過根系分泌物調(diào)控根際微生物的特性，且同種物質(zhì)可能對(duì)不同的微生物具有不同的功能。另外，根系分泌物中許多成分還具有促進(jìn)土傳病原菌生長(zhǎng)的功能。番茄根系分泌物可刺激番茄病原菌F. oxysporum f. sp. lycopersici和F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici小型分生孢子的萌發(fā)，且刺激程度受植物生長(zhǎng)發(fā)育階段的影響（Steinkellner et al.，2005）;西瓜根系分泌物中的酚酸、糖和游離氨基酸能顯著提高F. oxysporum f. sp. niveum的產(chǎn)孢能力，促進(jìn)孢子的萌發(fā)（Hao et al.，2010）;十字花科植物根系分泌的烯丙基異硫氰酸能刺激土壤中根腫病菌休眠孢子囊的萌發(fā)（Hwang et al.，2015）。【本研究切入點(diǎn)】前期研究發(fā)現(xiàn)三七生長(zhǎng)過程中通過根系分泌或殘?bào)w降解釋放到根際土壤中的皂苷類物質(zhì)一方面會(huì)對(duì)三七根系產(chǎn)生自毒作用，另一方面會(huì)改變根際土壤微生物結(jié)構(gòu)和功能，促進(jìn)病原菌而抑制有益微生物的生長(zhǎng)，從而使當(dāng)茬和下茬三七發(fā)生嚴(yán)重的根腐病，加重連作障礙的程度（楊敏等，2014;Yang et al.，2015）。然而三七根系分泌物中是否還有其他物質(zhì)參與了植物與根際病原菌之間的互作目前尚不清楚。【擬解決的關(guān)鍵問題】觀察三七根系與主要根腐病菌的互作效應(yīng)，收集根系分泌物并利用氣相色譜—飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-TOF-MS）分析三七根系分泌物中的成分，同時(shí)測(cè)定部分糖類、氨基酸類和長(zhǎng)鏈有機(jī)酸對(duì)三七主要根腐病菌生長(zhǎng)的影響，為解析三七根系分泌物介導(dǎo)的植物與土傳病原菌互作機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

一年生健康三七種苗來自云南農(nóng)業(yè)大學(xué)尋甸大河橋教學(xué)實(shí)驗(yàn)基地。試驗(yàn)所用化合物標(biāo)準(zhǔn)品分別購自上海麥克林生化科技有限公司、貴州迪大科技有限責(zé)任公司和美國(guó)Sigma公司，化合物詳細(xì)信息見表1。

供試病原菌為茄腐鐮刀菌F3（F. solani）、尖孢鐮刀菌Z4（F. oxysporum）、毀滅柱孢菌CD9（C. destructans）和惡疫霉菌D-1（P. cactorum），均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物多樣性與病害控制實(shí)驗(yàn)室從三七根腐病病株中分離獲得，并經(jīng)過形態(tài)和致病性鑒定。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 三七根系對(duì)根腐病原菌孢子萌發(fā)和芽管生長(zhǎng)方向的影響 參考劉屹湘（2011）的方法，略有改進(jìn)。以直徑1 mm的毛細(xì)管在載玻片上圍成一個(gè)U形管，形成一個(gè)一端開口的槽（長(zhǎng)×寬×高=50 mm×25 mm×1 mm）。在槽中分別加入濃度為1×105個(gè)孢子/mL的菌株F3或D-1孢子懸浮液，蓋上蓋玻片;以插入一端封口的直徑1 mm毛細(xì)管作為對(duì)照。選擇完整無損傷的三七根系，分別插入菌株F3和D-1孢子懸浮液中。在倒置顯微鏡（Leica DM 2000，德國(guó)）下觀察三七根圍菌株D-1孢子的行為，并每隔5 min拍照一次，比較不同時(shí)間根系周圍游動(dòng)孢子休止和萌發(fā)的數(shù)量、芽管朝向根系伸長(zhǎng)孢子的數(shù)量，每處理10個(gè)重復(fù)。菌株F3孢子于28 ℃恒溫箱中放置24 h后，在倒置顯微鏡下觀察三七根圍分生孢子的分布情況并拍照，比較孢子萌發(fā)和芽管朝向根系的數(shù)量，每處理10個(gè)重復(fù)。

孢子萌發(fā)率、休止率和向根率計(jì)算公式：萌發(fā)率（%）=萌發(fā)孢子數(shù)/孢子總數(shù)×100;休止率（%）=休止孢數(shù)/孢子總數(shù)×100;向根率（%）=芽管朝向根系的孢子數(shù)/孢子總數(shù)×100。

1. 2. 2 三七根系分泌物收集 參照Neumann等（2009）的方法收集三七根系分泌物。取生長(zhǎng)健康的一年生三七苗，自來水沖洗干凈后用0.3%次氯酸鈉消毒3 min，注意不要損傷根系，保持根系完整。將準(zhǔn)備好的三七苗放入底部連接有閥門的玻璃瓶，保持根系舒展，緩慢加入75 g石英砂，每瓶種植1棵三七苗。設(shè)4個(gè)重復(fù)，每重復(fù)30瓶，共120瓶。無菌水培養(yǎng)2周后，在玻璃瓶閥門下端連接干凈的三角瓶即可開始收集根系分泌物，收集時(shí)緩慢加入無菌水6 mL，多余液體順著通氣閥口流入收集瓶，每3 d收集1次。將每次收集到的根系分泌物用0.22 ?m濾膜過濾后取250 mL于方形鐵盤中，-80 ℃冰箱中冷凍至固體后取出置于冷凍干燥儀（Alpha 1-2 LD plus，Christ，德國(guó)）-76 ℃下進(jìn)行冷凍干燥。冷凍干燥后的根系分泌物為粉末狀，用離心管收集后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 3 三七根系分泌物GC-TOF-MS鑒定

1. 2. 3. 1 根系分泌物萃取 取8.5 mg根系分泌物凍干粉末于2 mL EP管中，加入0.2 mL甲醇—水提取試劑（體積比3∶1）漩渦混勻，4 ℃，12000 r/min離心15 min;取0.18 mL上清液于2 mL進(jìn)樣瓶中。

1. 2. 3. 2 根系分泌物衍生化 在真空濃縮器中干燥提取物;向干燥后的代謝物加入40 μL甲氧胺鹽試劑（甲氧胺鹽酸鹽，溶于20 mg/mL吡啶），輕輕混勻后放入烘箱中80 ℃孵育20 min;向每個(gè)樣品中迅速加入80 μL雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）[含有1% N-甲基三甲基硅基三氟乙酰胺（TCMS），v/v]，將混合物70 ℃孵育1 h;混勻后上機(jī)檢測(cè)。

1. 2. 3. 3 根系分泌物GC-TOF-MS鑒定 Agilent 7890氣相色譜—飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀配有Restek Rxi-5Sil MS毛細(xì)管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）。GC-TOF-MS分析條件：進(jìn)樣量：1 μL，不分流模式;載氣：氦氣;前進(jìn)樣口吹掃流速：3 mL/min;柱流速：1 mL/min;柱溫：60 ℃保持1 min，以10 ℃/min的速率上升至330 ℃，保持10 min;前進(jìn)樣口溫度：280 ℃;傳輸線溫度：280 ℃;離子源溫度：220 ℃;電離電壓：-70 eV;掃描范圍：85～600 m/z;掃描速率：20 spectra/sec;溶劑延遲：366 s。

1. 2. 3. 4 數(shù)據(jù)處理 利用LECO公司的Chroma TOF 4.3X和LECO-Fiehn Rtx5進(jìn)行基線數(shù)據(jù)過濾、基線校準(zhǔn)、峰對(duì)齊、解卷積分析、峰定性和峰面積計(jì)算，利用保留時(shí)間指數(shù)方法進(jìn)行峰定性。

1. 2. 4 三七根系分泌物中不同化合物對(duì)根腐病原菌生長(zhǎng)速率的影響

1. 2. 4. 1 長(zhǎng)鏈有機(jī)酸對(duì)三七根腐病原菌生長(zhǎng)的影響 采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定。分別將長(zhǎng)鏈有機(jī)酸類物質(zhì)（苯甲酸、鄰苯二甲酸、棕櫚酸和月桂酸）利用甲醇溶解后添加到已滅菌的PDA培養(yǎng)基中制成終濃度為1、10、100和1000 μg/mL的平板待用，以含有1%甲醇的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照。在培養(yǎng)基中央接種菌株F3、Z4、CD9和D-1，25 ℃黑暗培養(yǎng)，待對(duì)照菌落長(zhǎng)至培養(yǎng)皿的2/3時(shí)采用十字交叉法測(cè)量各處理菌落直徑，每處理4次重復(fù)。

菌絲生長(zhǎng)抑制率（%）=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100

1. 2. 4. 2 天冬氨酸和羥胺作為唯一氮源對(duì)根腐病原菌生長(zhǎng)的影響 準(zhǔn)確稱量0.20 g KH2PO4、0.20 g MgSO4·7H2O、0.20 g CaSO4·2H2O、5.00 g CaCO3、10.00 g葡萄糖和20.00 g瓊脂，定容至1 L，調(diào)節(jié)pH=7.0～7.2，121 ℃高壓滅菌40 min，制成缺氮培養(yǎng)基平板。在缺氮培養(yǎng)基中分別加入10 g/L天冬氨酸和羥胺制成唯一氮源培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中央分別接種菌株F3、Z4、CD9和D-1，于25 ℃黑暗培養(yǎng)，待對(duì)照菌落長(zhǎng)至培養(yǎng)皿的2/3時(shí)采用十字交叉法測(cè)量各處理菌落直徑，每處理4次重復(fù)。

菌絲生長(zhǎng)促進(jìn)率（%）=（處理菌落直徑-對(duì)照菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×

100

1. 2. 4. 3 纖維二糖和麥芽三糖作為唯一碳源對(duì)根腐病原菌生長(zhǎng)的影響 準(zhǔn)確稱量3.00 g NaNO3、1.00 g KH2PO4、0.50 g MgSO4·7H2O、0.01g FeSO4·6H2O、0.50 g KCl和20.00 g瓊脂，定容至1 L，調(diào)節(jié)pH=7.0～7.5，121 ℃高壓滅菌40 min，制成缺碳培養(yǎng)基平板。在缺碳培養(yǎng)基中分別加入10 g/L纖維二糖和麥芽三糖制成唯一碳源培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中央分別接種菌株F3、Z4、CD9和D-1，25 ℃黑暗培養(yǎng)，待對(duì)照菌落長(zhǎng)至培養(yǎng)皿的2/3時(shí)采用十字交叉法測(cè)量各處理菌落直徑，每處理4次重復(fù)。菌絲生長(zhǎng)促進(jìn)率計(jì)算公式同1.2.4.2。

1. 2. 4. 4 纖維二糖和麥芽三糖對(duì)菌株F3孢子萌發(fā)和芽管生長(zhǎng)方向的影響 （1）孢子懸浮液制備：在培養(yǎng)（28 ℃，12 h光暗交替）7～10 d的菌株F3培養(yǎng)基中加入適量無菌水，然后用玻片輕刮菌絲，使孢子脫落下來，再用紗布過濾，制成105個(gè)孢子/mL的懸浮液備用。（2）帶糖水瓊脂培養(yǎng)基配制：20.00 g瓊脂，定容至1 L，分別添加纖維二糖和麥芽三糖到培養(yǎng)基中，配制成濃度為0.01、0.10和1.00 μg/mL的帶糖培養(yǎng)基，滅菌冷卻后用滅菌的小刀切成1.5 cm×0.8 cm的小塊。（3）糖類物質(zhì)對(duì)菌株F3孢子萌發(fā)和芽管生長(zhǎng)方向的影響：將制成的培養(yǎng)基小塊放置在毛細(xì)管圍成的U形管中間，蓋上蓋玻片，取200 μL孢子懸浮液沿毛細(xì)管邊緣緩慢加入U(xiǎn)形管內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡，每處理4次重復(fù)。將玻片水平放置于28 ℃黑暗培養(yǎng)24 h后進(jìn)行觀察拍照，按照下列公式計(jì)算孢子萌發(fā)率和向營(yíng)養(yǎng)源生長(zhǎng)率。

萌發(fā)率（%）=萌發(fā)孢子數(shù)/孢子總數(shù)×100

向營(yíng)養(yǎng)源生長(zhǎng)率（%）=芽管朝向瓊脂塊伸長(zhǎng)孢

子數(shù)/孢子總數(shù)×100

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 三七根系對(duì)菌株D-1和F3孢子萌發(fā)和芽管生長(zhǎng)方向的影響

三七根系放入菌株D-1孢子懸浮液中5 min開始觀察到游動(dòng)孢子休止，15 min后根系周圍游動(dòng)孢子休止率增加，極顯著高于毛細(xì)管對(duì)照（P<0.01，下同）;25 min后，根系周圍游動(dòng)孢子休止率與對(duì)照相比無顯著差異（P>0.05，下同）;到30 min時(shí)游動(dòng)孢子休止率與對(duì)照基本相同，游動(dòng)孢子基本完全休止（圖1- A）。三七根系周圍的菌株D-1孢子于15 min后開始萌發(fā)，同時(shí)芽管向三七根系所在方向生長(zhǎng)，而毛細(xì)管周圍的孢子萌發(fā)遲緩，到20 min時(shí)孢子才開始萌發(fā)，且三七根系周圍的孢子萌發(fā)率極顯著高于毛細(xì)管周圍，芽管朝著三七根系生長(zhǎng)的比例顯著（P<0.05，下同）（30 min時(shí)極顯著）高于朝著毛細(xì)管生長(zhǎng)的比例（圖1-B和圖1-C）。表明三七根系能顯著促進(jìn)惡疫霉菌游動(dòng)孢子的休止和休止孢的萌發(fā)，并對(duì)芽管的生長(zhǎng)方向具有明顯的吸引作用。

與對(duì)照相比，三七根系周圍菌株F3孢子萌發(fā)率極顯著高于對(duì)照，孢子萌發(fā)后芽管的向根率也顯著高于對(duì)照（圖1-D）。表明三七根系能顯著促進(jìn)茄腐鐮刀菌孢子萌發(fā)且對(duì)芽管生長(zhǎng)方向具有明顯的吸引作用。

2. 2 三七根系分泌物的GC-TOF-MS鑒定結(jié)果

采用GC-TOF-MS對(duì)三七根系分泌物進(jìn)行鑒定，從中共檢測(cè)出292種物質(zhì)，主要為酸類、醇類、糖類、氨基酸類、胺類、嘌呤嘧啶類、酯類、酮類和酚類等9類物質(zhì)（圖2）。其中，酸類、醇類、糖類和氨基酸類的相對(duì)含量最多，分別達(dá)34.97%、30.03%、13.08%和3.52%，其次為胺類（相對(duì)含量為1.32%），嘌呤嘧啶類、酯類、酮類和酚類物質(zhì)的相對(duì)含量較低，僅占0.11%～0.78%（表2）。表明三七根系分泌物成分組成復(fù)雜，相對(duì)含量差異較大，酸類、醇類、糖類和氨基酸類是根系分泌物中的主要成分。

2. 3 三七根系分泌物中不同化合物對(duì)根腐病原菌生長(zhǎng)的影響

利用菌絲生長(zhǎng)速率法進(jìn)一步測(cè)定三七根系分泌物中的長(zhǎng)鏈有機(jī)酸（苯甲酸、鄰苯二甲酸、棕櫚酸和月桂酸）、糖類（纖維二糖和麥芽三糖）、羥胺和天冬氨酸對(duì)三七根腐病原菌生長(zhǎng)的影響。

2. 3. 1 苯甲酸、鄰苯二甲酸、棕櫚酸和月桂酸對(duì)三七根腐病原菌生長(zhǎng)的影響 由圖3可看出，濃度為1或10 μg/mL的苯甲酸、鄰苯二甲酸和棕櫚酸除對(duì)菌株F3有輕度抑制效果外，對(duì)其他病原菌生長(zhǎng)均表現(xiàn)為促進(jìn)作用;月桂酸在1和10 μg/mL時(shí)對(duì)菌株F3無抑制效果;當(dāng)濃度為100 μg/mL時(shí)，苯甲酸和月桂酸對(duì)三七根腐病原菌開始表現(xiàn)出不同程度的抑制作用;當(dāng)濃度為1000 μg/mL時(shí)，除棕櫚酸只對(duì)菌株CD9表現(xiàn)為輕度抑制作用外，其他3種酸類物質(zhì)均對(duì)三七根腐病原菌生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯的抑制作用。說明苯甲酸、鄰苯二甲酸和月桂酸對(duì)三七根腐病原菌多表現(xiàn)出低促高抑效應(yīng)。

2. 3. 2 天冬氨酸和羥胺作為唯一氮源對(duì)三七根腐病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 由圖4可知，菌株Z4、F3、D-1和CD9在缺氮及缺氮培養(yǎng)基中添加羥胺的培養(yǎng)條件下均不能生長(zhǎng);天冬氨酸能作為唯一氮源供菌株F3、Z4和CD9菌絲生長(zhǎng)，但不能供菌株D-1菌絲生長(zhǎng)。表明天冬氨酸可作為唯一氮源供三七根腐病原菌生長(zhǎng)，但不同病原菌對(duì)天冬氨酸的利用能力存在較大差異。

2. 3. 3 纖維二糖和麥芽三糖對(duì)三七根腐病原菌生長(zhǎng)的影響

2. 3. 3. 1 纖維二糖和麥芽三糖作為唯一碳源對(duì)三七根腐病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 由圖5可知，纖維二糖和麥芽三糖均能作為唯一碳源供菌株Z4、F3和CD9菌絲生長(zhǎng)，但不能供菌株D-1菌絲生長(zhǎng)。菌株F3利用纖維二糖的能力最強(qiáng)，其次是麥芽三糖;菌株Z4與CD9菌株間利用纖維二糖和麥芽三糖的能力無顯著差異。

2. 3. 3. 2 纖維二糖和麥芽三糖對(duì)菌株F3孢子萌發(fā)和芽管生長(zhǎng)方向的影響 纖維二糖和麥芽三糖處理菌株F3孢子24 h后統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，纖維二糖對(duì)菌株F3孢子萌發(fā)具有明顯的促進(jìn)作用，且隨著濃度增加，促進(jìn)作用增強(qiáng)，但對(duì)芽管向營(yíng)養(yǎng)源方向生長(zhǎng)無顯著促進(jìn)作用（圖6-A）;麥芽三糖對(duì)菌株F3孢子萌發(fā)無顯著促進(jìn)作用，但在低濃度下即能顯著促進(jìn)芽管向營(yíng)養(yǎng)源生長(zhǎng)（圖6-B）。

3 討論

植物可通過釋放化合物對(duì)根際土壤微生物進(jìn)行調(diào)控（Reinhold-Hurek et al.，2015），在土壤和根際之間形成獨(dú)特的微生物組合，這種現(xiàn)象被稱為“根際效應(yīng)”（Berendsen et al.，2012）。根系分泌物既能提供微生物生長(zhǎng)所需的養(yǎng)分，又能作為信號(hào)激活或募集微生物（Canarini et al.，2019）。本研究發(fā)現(xiàn)，三七根系能促進(jìn)根腐病原菌孢子萌發(fā)和芽管趨向根系伸長(zhǎng)，表明三七根腐病菌能特異性地趨向和識(shí)別寄主根系?；瘜W(xué)趨向性響應(yīng)是一些植物病原菌感應(yīng)到寄主植物信號(hào)并侵入寄主的一種重要方式，為根腐病原菌在三七根際大量繁殖成為優(yōu)勢(shì)菌群打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

為明確根系分泌物在三七根系與病原菌互作中的作用，本研究利用GC-TOF-MS鑒定了三七根系分泌物的化學(xué)成分。利用GC-MS開展植物根系分泌物的研究已應(yīng)用于多種作物。王文斌等（2010）檢測(cè)出橡膠樹幼苗根系分泌物由多種有機(jī)化合物組成，包括烴類、醇類、有機(jī)酸類、酯類、酰胺類、醛類和酚類等物質(zhì)。張愛華等（2014）發(fā)現(xiàn)人參根系分泌物中含有人參皂苷及烷烴類物質(zhì)、有機(jī)酸酯類物質(zhì)和酚酸類物質(zhì)。本研究對(duì)三七根系分泌物進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果主要為酸類、醇類、糖類、氨基酸類、胺類、嘌呤嘧啶類、酯類、酮類和酚類等9類物質(zhì)，其中酸類、醇類、糖類和氨基酸類的相對(duì)含量最高，是三七根系分泌物中的主要成分，推測(cè)這些物質(zhì)可能在植物根系與外界環(huán)境的互作中發(fā)揮重要作用。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，三七根系分泌物能顯著促進(jìn)引起三七根腐的鐮刀菌和銹腐菌在三七根際增殖，抑制木霉菌和芽孢桿菌等有益菌的生長(zhǎng)（Luo et al.，2019）。三七根系分泌的人參皂苷在低濃度（0.2～20.0 mg/L）下對(duì)三七根腐病原菌如惡疫霉菌、腐霉菌（Pythium irregulare）、鐮刀菌（F. solani和F. oxysporum）以及毀滅柱孢菌的生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用（Nicol et al.，2003;Yang et al.，2015，2018;匙坤等，2016）。但目前對(duì)三七分泌的游離氨基酸和可溶性糖類的作用研究較少（李浩成等，2020）。連作大豆根系分泌的糖類和氨基酸類物質(zhì)對(duì)引起大豆根腐的鐮刀菌具有明顯的促生長(zhǎng)活性（鞠會(huì)艷等，2002）;與三七同屬的人參根系分泌物中的阿拉伯糖、鼠李糖2種糖類物質(zhì)和賴氨酸、異亮氨酸等6種氨基酸對(duì)人參細(xì)菌性軟腐病菌具有明顯的化學(xué)趨向性響應(yīng)（張愛華等，2016）。本研究結(jié)果顯示，三七根系分泌物中的糖類（纖維二糖和麥芽三糖）和天冬氨酸可作為唯一碳源和氮源促進(jìn)三七根腐病原菌生長(zhǎng)，且2種糖類物質(zhì)具有促進(jìn)茄腐鐮刀菌F3孢子萌發(fā)或在低濃度條件下促進(jìn)芽管向營(yíng)養(yǎng)源生長(zhǎng)的功能。表明三七根系分泌的糖類和氨基酸類物質(zhì)可能對(duì)土壤中的根腐病原菌具有一定的吸引作用或可作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)病原菌生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致三七根腐病加重發(fā)生。

有研究發(fā)現(xiàn)，植物根系分泌的長(zhǎng)鏈有機(jī)酸可能對(duì)土壤中特定微生物具有選擇作用（Yuan et al.，2018）。本研究結(jié)果顯示，苯甲酸、鄰苯二甲酸和月桂酸等常見長(zhǎng)鏈有機(jī)酸對(duì)三七根腐病原菌多表現(xiàn)出低促高抑效應(yīng)。在三七重茬根際土壤和三七根系分泌物中均存在的苯甲酸及其衍生物對(duì)三七根腐菌同樣表現(xiàn)為低促高抑效應(yīng)（趙靜等，2018）。其他作物上的研究也發(fā)現(xiàn)，鄰苯二甲酸和對(duì)羥基苯甲酸在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)亦表現(xiàn)低促高抑效應(yīng)（鞠會(huì)艷等，2002;Zhao et al.，2018）。嫁接茄根系分泌物中的棕櫚酸對(duì)黃萎病菌具有一定的化感抑制作用（Zhou et al.，2010）。上述研究結(jié)果進(jìn)一步說明植物可通過調(diào)控根系分泌物中長(zhǎng)鏈有機(jī)酸的含量來特異性調(diào)控根際土壤微生物。但本研究?jī)H測(cè)定了三七根系分泌物中的部分代謝物對(duì)根腐病原菌生長(zhǎng)的影響，后續(xù)亟需對(duì)一些相對(duì)含量較高的化合物如乳酸和丙三醇等進(jìn)行深入研究，以明確這些代謝物的功能，以期對(duì)三七根系分泌物的功能有更全面解析。

4 結(jié)論

三七根系分泌物中的長(zhǎng)鏈有機(jī)酸類（苯甲酸、鄰苯二甲酸和月桂酸）對(duì)根腐病原菌具有低促高抑效應(yīng)，糖類（纖維二糖和麥芽三糖）和天冬氨酸可作為唯一碳源和氮源促進(jìn)病原菌菌絲生長(zhǎng)，且纖維二糖和麥芽三糖具有促進(jìn)茄腐鐮刀菌孢子萌發(fā)或吸引芽管朝向營(yíng)養(yǎng)源方向生長(zhǎng)的功能，可為解析根腐病原菌在三七根際土壤中的異常積累提供理論參考。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）