師長宏

(第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，西安 710032)

1 背景

將患者新鮮的腫瘤組織移植于免疫缺陷小鼠建立的患者來源的異種移植(patient-derived xenograft,PDX)模型較好地保持了原發(fā)腫瘤的遺傳特性和異質(zhì)性, 在腫瘤的個體化治療研究中具有獨特的優(yōu)勢[1]。其優(yōu)點在于: 移植所用標(biāo)本直接來源于人體腫瘤組織, 較好地保留了腫瘤間質(zhì)和干細(xì)胞成分, 使腫瘤生長的微環(huán)境更接近原發(fā)瘤; 不同PDX模型反映不同患者來源的樣本之間的差異，更接近于患者的實際情況，適用于抗腫瘤藥物和生物標(biāo)志物的研究; 也可為腫瘤樣本的保存和傳代提供大量標(biāo)本。傳統(tǒng)的細(xì)胞系移植模型(cell-derived xenograft, CDX)，經(jīng)過長期的體外培養(yǎng)，腫瘤細(xì)胞為了適應(yīng)外環(huán)境，喪失了異質(zhì)性，獲得的實驗結(jié)果趨于同質(zhì)化。而PDX模型未經(jīng)過體外培養(yǎng)，穩(wěn)定地保留了原發(fā)瘤的遺傳特性、組織學(xué)和表型特征，實驗結(jié)果臨床預(yù)見性更好。

2 PDX模型的基本特征

將人體腫瘤標(biāo)本接種至小鼠體內(nèi)，生長出的腫瘤組織連續(xù)接種到新的小鼠體內(nèi)，傳至第三代腫瘤能夠穩(wěn)定生長且80%以上成瘤，表示PDX模型建立成功。體內(nèi)成瘤時間不超過12周; 將模型腫瘤組織凍存在液氮內(nèi)，復(fù)蘇后移植于小鼠體內(nèi)可以穩(wěn)定生長。為了保持原發(fā)腫瘤的組織形態(tài)，體內(nèi)傳代次數(shù)應(yīng)不超過10代[2]。

常用PDX模型的移植方法包括: ①皮下移植，腫瘤一般局限于皮下成團(tuán)生長，很少出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和擴散，移植成功率較低，只有約25%。②腎包膜由于血供豐富，組織相容性好是較常采用的移植方法, 其成功率能達(dá)到70%以上，在膀胱癌、結(jié)腸癌、肺癌的移植中成功率可達(dá)到95%以上。③原位移植是將腫瘤組織移植到小鼠體內(nèi)與其同源的組織內(nèi)，其影響因素較多，成功率低，建模難度大，特別是一些消化道腫瘤，因其原位處于消化道腔內(nèi)，其移植的成功率進(jìn)一步降低[3]。

確認(rèn)PDX模型與原發(fā)瘤的組織相似性至關(guān)重要，其溯源方法包括: ①組織形態(tài)學(xué)比較，通過組織學(xué)類型和Lauren分類等方法對移植瘤和原發(fā)瘤組織形態(tài)進(jìn)行分析，判斷一致性。同時關(guān)注PDX模型是否保留了原發(fā)瘤的微環(huán)境特征[4]。②腫瘤特異性標(biāo)志物分析，人源性的特異性標(biāo)志物檢測能夠確定移植瘤的來源，進(jìn)而對比二者的一致性。特異性標(biāo)志物的表達(dá)與某一類型腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，也是指導(dǎo)臨床診斷和治療策略的潛在分子靶點，如甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP), 癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA), 前列腺特異性抗原(prostate-specific antigen，PSA)和糖鏈抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9，CA19-9)等。③短片段重復(fù)序列分型(short tandem repeat，STR)，STR序列廣泛存在于哺乳動物的基因組中，多態(tài)性程度高，通常由2～6個堿基構(gòu)成一個核心序列，重復(fù)數(shù)目的變化決定多態(tài)性。對于特定個體，染色體上某一位置的重復(fù)序列和重復(fù)次數(shù)是固定的。通過檢測就可以明確區(qū)分個體的不同，確定親緣關(guān)系。④測序分析，通過多個基因外顯子和RNA測序，可以確定原發(fā)瘤的遺傳特征是否在PDX模型異體生長和傳代期間發(fā)生變化；也可通過測序分析PDX模型的堿基突變特征、等位基因頻率和RNA表達(dá)水平方面是否與對應(yīng)原發(fā)瘤具有相關(guān)性。

3 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀

PDX模型保持了原發(fā)性瘤中大多數(shù)的關(guān)鍵基因和信號通路活性，更能模擬腫瘤患者親本基因?qū)W特征，這些應(yīng)用于靶向藥物篩選試驗具有獨特優(yōu)勢。可以根據(jù)每個腫瘤患者PDX模型的特征，篩選敏感的治療藥物，制定個體化的治療方案，在臨床前研究中用于評估腫瘤的個體化療效。Keysar 等[5]利用建立的PDX模型，研究分析了 PI3K 通路在鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，并通過藥物實驗證實了PI3K 抑制劑可以作為一個候選藥物的靶點，而在CDX模型中PI3K 抑制劑的作用并不明顯。PDX模型充分展示了腫瘤的臨床特點和患者個體的遺傳特異性，細(xì)胞遺傳學(xué)分析顯示PDX腫瘤最大限度的保留了原發(fā)患者的染色體結(jié)構(gòu)，并且在組織形態(tài)、轉(zhuǎn)錄組、多態(tài)性和拷貝數(shù)變異方面也具有較好的一致性[6]。比如，具有PI3KCA基因突變和KRAS/BRAF野生型的結(jié)腸癌PDX模型已成功建立，但這種亞型在結(jié)腸癌細(xì)胞系中并未發(fā)現(xiàn)[7]。

PDX模型所具有的細(xì)胞學(xué)和分子學(xué)的異質(zhì)性,使得一些發(fā)生遺傳變異的腫瘤細(xì)胞亞群在長期的治療過程中被篩選和富集下來, 從而被用于發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)記預(yù)測藥物的敏感性或耐藥性。如西妥昔單克隆抗體結(jié)合靶點為表皮生長因子受體(EGFR), 使用79個PDX模型(包括腸癌、胃癌、頭頸腫瘤、肺癌和乳腺癌)用于評價西妥昔單克隆抗體的活性, 結(jié)果表明RAS通路突變、EGFR的表達(dá)、EGFR的磷酸化、Erb3的表達(dá)、Akt的活化以及MET的磷酸化等10個生物標(biāo)志, 可用于預(yù)測西妥昔單克隆抗體的敏感性或抗性作用[8]。

不同腫瘤患者來源的PDX模型其性質(zhì)可能會略有不同，甚至體現(xiàn)在基因的表達(dá)上，但可能擁有相同的藥物靶點，因此，開展基于PDX模型基因組學(xué)的腫瘤靶向藥物篩選，對于PDX模型的應(yīng)用具有重要意義。首先對建立的PDX模型進(jìn)行基因測序和分型，分析腫瘤遺傳改變情況，在基因水平上進(jìn)行分組研究。然后針對不同的基因型分組，采取相應(yīng)的靶向藥物進(jìn)行試驗, 而不考慮腫瘤類型。記錄各組藥物的療效差異, 研究不同藥物在不同基因型模型上的反應(yīng)過程，分析來源和基因型特征，目的是從個性研究中，整合出共性結(jié)論[9]。

利用PDX模型也可對腫瘤細(xì)胞與其微環(huán)境之間的相互作用進(jìn)行研究。在PDX模型早期傳代過程中，包括間充質(zhì)細(xì)胞和浸潤性淋巴細(xì)胞在內(nèi)的人間質(zhì)細(xì)胞參與了腫瘤的形成。已證實血液腫瘤和實體瘤都含有原始腫瘤細(xì)胞(tumor-initiating cells, TICs)或腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)亞群[10,11]。雖然上述細(xì)胞只是腫瘤組織中極少部分細(xì)胞亞群，但實驗表明TICs更能抵抗輻射、化療和靶向治療，這對于耐藥和腫瘤的復(fù)發(fā)研究非常重要[12]。PDX模型體現(xiàn)了TIC的主要生物學(xué)特性，可以使用特定標(biāo)記物從人體腫瘤活組織持續(xù)分離出大量的TICs。已證實在PDX模型中具有TIC特征的CD133+(高致瘤基因)亞群在非小細(xì)胞肺癌中能引起順鉑的抗性[13]。

總之，患者來源腫瘤異種移植(PDTX)模型保持和穩(wěn)定了原發(fā)腫瘤的遺傳、組織和表型特征; 保存了腫瘤組織中間質(zhì)和干細(xì)胞成份; 有利于腫瘤組織中生物標(biāo)志物的評估，可用于測試抗腫瘤藥物的敏感性和預(yù)測患者的預(yù)后，實現(xiàn)腫瘤的個性化治療。

4 PDX模型研究中存在的問題

4.1 移植成功率

提高PDX模型成功率需要重點關(guān)注以下因素:①腫瘤自身因素，與其它腫瘤相比，乳腺癌和前列腺癌PDX模型建模更難。惡性程度高、分化程度低的腫瘤移植成功率較高; 移植腫瘤細(xì)胞的數(shù)量越多成功率越高[14]。②宿主因素，敲除一些免疫相關(guān)基因可獲得重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠，適合人源細(xì)胞移植，特別是NOD-PrkdcscidIl2rgnull小鼠，是迄今免疫缺陷程度最高的小鼠，保證了高的移植成功率[15]。③技術(shù)因素，標(biāo)本的新鮮度及標(biāo)本離體后到移植間的時間是影響細(xì)胞活性的一個重要因素，需要外科醫(yī)生、組織學(xué)家和研究者密切配合; 飼養(yǎng)環(huán)境以及標(biāo)本的污染程度也會影響移植成功率。因此，每個樣本需要移植大量的受體鼠，需觀察3個月以上才能決定模型是否成功。

4.2 人源化問題

人和鼠始終是兩種不同的物種，無法完全消除物種間的差異。移植過程中小鼠基質(zhì)會逐漸替代原發(fā)瘤基質(zhì)。腫瘤組織在小鼠體內(nèi)傳代過程中，也可能導(dǎo)致個別基因的改變而無法準(zhǔn)確反映患者的病情; 由于PDX模型使用免疫缺陷動物，導(dǎo)致無法篩選免疫調(diào)節(jié)藥物或通過免疫功能激活的藥物[16]。

4.3 淋巴瘤的發(fā)生

在不同類型腫瘤的PDX模型中，均有個別病例形成與EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)相關(guān)的B細(xì)胞淋巴瘤，在胃癌的PDX模型中發(fā)生比例最高，且制備模型使用的均為NOD/SCID或NOD小鼠。分析原因可能是EBV感染的B細(xì)胞在人體內(nèi)處于潛伏狀態(tài)，但當(dāng)移植到重度免疫缺陷小鼠后，由于缺乏功能性免疫細(xì)胞，易被活化形成淋巴瘤。由于幽門螺桿菌相關(guān)的胃炎與胃癌的發(fā)生高度相關(guān)，在胃癌病例中基底炎癥發(fā)生程度顯著高于其它腫瘤，從而胃癌PDX模型中淋巴瘤的發(fā)生率顯著高于其它腫瘤[17]。

4.4 藥物評價中治療策略的選擇

由于PDX模型代表了不同患者的狀況，在篩藥過程中化療藥物劑量、治療頻次需要個體化的策略，通過預(yù)實驗進(jìn)行調(diào)整; 同時PDX模型治療前的分組、治療時機、治療周期，停藥后觀察時間等因素都會影響藥物的評價效果[18]。

4.5 正確評估和應(yīng)用PDX模型

目前PDX模型廣泛應(yīng)用于新藥評價和腫瘤新靶標(biāo)的篩選，體現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。在國內(nèi)，一些大學(xué)和科研院所積極與醫(yī)藥研發(fā)企業(yè)合作，投入大量資金和人力從事PDX模型的應(yīng)用研究。2017年度國家生物醫(yī)學(xué)重點專項中設(shè)立精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究課題，涉及個性化藥物評價體系建立，包括建立中國人群遺傳背景的PDX模型不少于2 000例。

盡管如此, 2016年Nature和N Engl J Med均發(fā)文對包括PDX模型在內(nèi)的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)提出質(zhì)疑[19,20]。通過大量的臨床實驗研究和數(shù)據(jù)分析，結(jié)合測序等分子診斷技術(shù)，表明只有約30%～50%的患者能找到可以解釋腫瘤惡變的相關(guān)突變，而相應(yīng)的藥物有限，只有3%～13%的患者能夠找到精準(zhǔn)的藥物，其中只有30%的患者有療效。最后真正受益的患者僅占所有患者的1.5%。分析個體化治療藥物不夠理想的原因主要是: ①適用個體有限; ②制模周期較長，成本過高; ③腫瘤異質(zhì)性，即同一個患者的腫瘤細(xì)胞有多個突變株，治好了一部分細(xì)胞，另一部分又長出來了; ④一開始有效的藥物，可能很快就產(chǎn)生了耐藥性。因此，從目前臨床數(shù)據(jù)看，基于PDX模型的個體化治療還沒有顯示出實質(zhì)性療效，仍處于臨床驗證階段。

5 展望

PDX模型的建立和應(yīng)用為腫瘤學(xué)研究，特別是藥物的個體化應(yīng)用提供了良好的實驗平臺。但需要注意的是在強調(diào)腫瘤PDX模型個體化的同時，需要運用共性研究思維，針對PDX模型的基因組特征開展靶向治療，提高模型的應(yīng)用效能，獲得更多的腫瘤亞型和更為高效的靶向選擇方案。同時，應(yīng)鼓勵不同部門和機構(gòu)加強協(xié)作，建立腫瘤異種移植模型的數(shù)據(jù)庫，共享PDX模型的信息與研究結(jié)果，從而使更多的患者受益。

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