汪瑾雨，余海立，劉蘭慶，蘇香萍，汪鋆植，2*

（1.三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院 湖北省生物酵素工程技術(shù)研究中心，湖北 宜昌443002；2.湖北省土家族醫(yī)藥研究所，湖北 宜昌 443002）

根皮素是根皮苷的脫糖基產(chǎn)物，存在于蔬菜，蘋果、梨等水果中，是著名的天然二氫查爾酮之一[1-3]，具有抗氧化[4]、抑制酪氨酸酶活性[5-6]、抗癌[7-8]、抗炎[9]、抗菌[10]和雌激素作用[11]等多種生物活性[12]。近年來，根皮素作為抗氧化功效因子在食品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，李姝靜等[13]制備出根皮素與β-環(huán)糊精的包合物，提高了根皮素的水溶性和抗氧化能力，有利于其加工成水基化保健食品劑型。孫玥等[14]采用等效面分析法考察了多組分食品添加劑—阿魏酸、根皮素和水溶性維生素E（vitamin E，VE）抗氧化的協(xié)同作用，并進行配方比例的響應(yīng)面優(yōu)化；此外，還制備出阿魏酸、根皮素及水溶性維生素E（VE）的復(fù)方微乳[15]，提高了復(fù)方抗氧化體系的穩(wěn)定性和抗氧化效力，擴大了其在食品、化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用。ZHANG T J等[16]用不同溶劑提取蘋果渣并測定其活性，證實了根皮素可作為合成抗氧化、抗菌食品添加劑的天然替代品。然而，根皮素在植物中的含量較低[17]，而根皮苷易于從蘋果、海棠等植物中大量獲取，因此，利用根皮苷制備根皮素是一條可行途徑[18-20]。為了更高效、環(huán)保地生產(chǎn)根皮素，本研究利用酵母菌生物轉(zhuǎn)化根皮苷制備根皮素，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化出根皮苷最佳轉(zhuǎn)化工藝，以期為根皮素工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：安琪酵母股份有限公司；根皮苷標(biāo)準品（純度≥98%）、根皮素標(biāo)準品（純度≥98%）：上海純優(yōu)生物科技有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：美國Tedia有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL，pH自然，121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市城西春蘭實驗儀器廠；ME215S型十萬分之一電子天平：德國Sartorios公司；Dionex U 3000型高效液相色譜儀（high performance liquid chromatograph，HPLC）：美國戴安液相色譜有限公司；JY99-IIDN型超聲波破碎儀：寧波新芝生物科技有限公司；HEV-50型自動滅菌鍋：日本HIRAYAMA公司；SB-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：日本EYELA公司；0.45 μm尼龍膜針筒過濾器：天津津騰實驗設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母轉(zhuǎn)化液收集

取斜面菌種接種至200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、100 r/min條件下，培養(yǎng)24 h，制得種子液。以5%的接種量吸取種子液至200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、100 r/min條件下，培養(yǎng)48 h后，于2 000 r/min離心10 min，棄去上清液，收集沉淀細胞。沉淀細胞用同等體積的pH 6.0的磷酸鹽緩沖液淋洗兩遍，置于三角燒瓶中，在冰浴條件下破碎（破碎3 s，間歇3 s，共70次，10 min），即得酵母轉(zhuǎn)化液。

1.3.2 根皮苷的生物轉(zhuǎn)化方法

實驗組：取上述一定體積的轉(zhuǎn)化液，pH自然，加入合適比例的一定濃度的根皮苷溶液，于適宜溫度下水浴相應(yīng)時間，沸水加熱5 min，以終止反應(yīng)。轉(zhuǎn)化液用同等體積的乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯，于45℃減壓蒸干，用甲醇溶解，并定容至一定體積，0.45 μm的微孔濾膜過濾。采用HPLC分析濾液中的根皮素，并根據(jù)根皮素標(biāo)準曲線回歸方程計算含量。實驗中，同時設(shè)立對照組，即只加轉(zhuǎn)化液，不加底物。根皮素產(chǎn)率按如下公式計算：

式中：C1為轉(zhuǎn)化液中根皮素的質(zhì)量濃度，g/L；C2為底物根皮苷的質(zhì)量濃度，g/L；M1為根皮素的相對分子質(zhì)量，274.27；M2為根皮苷的相對分子質(zhì)量，436.41。

1.3.3 高效液相色譜分析

色譜條件：CosmailC18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈-水（55∶45，V/V）；檢測波長為285 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫：30 ℃，進樣量：10 μL。

1.3.4 根皮素標(biāo)準曲線的繪制

精密稱取0.01g的根皮素標(biāo)準品，置于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度線，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1.0 g/L的根皮素標(biāo)準品溶液。精密吸取標(biāo)準溶液0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL，分別置于10 mL容量瓶，用甲醇定容，配成質(zhì)量濃度為10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL的系列根皮素標(biāo)準溶液。吸取10 μL，于上述色譜條件下進樣分析，每個質(zhì)量濃度進樣3次，計算平均峰面積。以根皮素質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，得根皮素標(biāo)準回歸方程為：Y=0.459 2X-1.325（R2=0.999 5）。根據(jù)根皮素標(biāo)準回歸方程計算樣品中根皮素含量。

1.3.5 單因素試驗

選取轉(zhuǎn)化時間（4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h）、轉(zhuǎn)化溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）、酵母轉(zhuǎn)化液與底物根皮苷體積比（液料比）（5∶1、7∶1、9∶1、11∶1、13∶1（V/V））和底物根皮苷質(zhì)量濃度（8g/L、10g/L、12g/L、14g/L、16 g/L）對根皮素產(chǎn)率的影響，以確定響應(yīng)面試驗的考察因素及各因素的水平。

1.3.6 響應(yīng)面試驗[21-22]

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇轉(zhuǎn)化時間（X1）、轉(zhuǎn)化溫度（X2）、液料比（X3）為考察因素，以根皮素產(chǎn)率（Y）為評價指標(biāo)，按照Box-BehnkenDesign（BBD）試驗設(shè)計，進行3因素3水平響應(yīng)面分析試驗，數(shù)據(jù)分析采用Design-Expert 8.0.6軟件，從而得出生物轉(zhuǎn)化制備根皮素的最佳條件。響應(yīng)面試驗因素與水平見表1。

表1 根皮素制備條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for phloretin preparation conditions optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 轉(zhuǎn)化時間對根皮素產(chǎn)率的影響

圖1 轉(zhuǎn)化時間對根皮素產(chǎn)率的影響Fig.1 Effect of conversion time on the yield of phloretin

轉(zhuǎn)化時間對根皮素產(chǎn)率的影響見圖1。由圖1可知，隨著轉(zhuǎn)化時間的延長，根皮素產(chǎn)率也逐漸增加，當(dāng)轉(zhuǎn)化時間為18 h時，根皮素產(chǎn)率最高，為49.75%。若轉(zhuǎn)化時間太短，底物根皮苷轉(zhuǎn)化不完全；轉(zhuǎn)化時間過長，轉(zhuǎn)化液中酶失活。因此，選取轉(zhuǎn)化時間16 h、18 h、20 h為響應(yīng)面試驗的取值范圍。

2.1.2 轉(zhuǎn)化溫度對根皮素產(chǎn)率的影響

轉(zhuǎn)化溫度對根皮素產(chǎn)率的影響見圖2。由圖2可知，隨著轉(zhuǎn)化溫度的升高，根皮素產(chǎn)率先增加后減少，當(dāng)轉(zhuǎn)化溫度為40℃時，產(chǎn)率達最大，為48.67%；當(dāng)轉(zhuǎn)化溫度在30℃～40℃時，根皮素產(chǎn)率隨著轉(zhuǎn)化溫度的升高而緩慢增加；當(dāng)轉(zhuǎn)化溫度高于40℃后，隨著轉(zhuǎn)化溫度的升高，根皮素產(chǎn)率呈下降趨勢。其原因可能是溫度過高，轉(zhuǎn)化液中酶失活且失活速率也加快所致。因此，選取轉(zhuǎn)化溫度30℃、40℃、50℃為響應(yīng)面試驗的取值范圍。

圖2 轉(zhuǎn)化溫度對根皮素產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of conversion temperature on the yield of phloretin

2.1.3 液料比對根皮素產(chǎn)率的影響

液料比對根皮素產(chǎn)率的影響見圖3。由圖3可知，隨著液料比的增加，根皮素產(chǎn)率逐漸增加，液料比為11∶1（V/V）時產(chǎn)率最大且趨于穩(wěn)定，為70.05%。說明在底物根皮苷的量一定的情況下，液料比達到11∶1（V/V）后，根皮素產(chǎn)率基本保持不變，此后無增加液料比的必要。因此，選取液料比9∶1、11∶1、13∶1（V/V）為響應(yīng)面試驗的取值范圍。

圖3 液料比對根皮素產(chǎn)率的影響Fig.3 Effect of liquid-material ratio on the yield of phloretin

2.1.4 底物質(zhì)量濃度對根皮素產(chǎn)率的影響

底物質(zhì)量濃度對根皮素產(chǎn)率的影響見圖4。由圖4可知，隨著底物質(zhì)量濃度的增加，根皮素產(chǎn)率也逐漸增加，但整體增加幅度相對較小，底物質(zhì)量濃度在10 g/L時產(chǎn)率最大，為69.55%。這是因為轉(zhuǎn)化液中酶的耐受能力與底物質(zhì)量濃度有關(guān)，同時產(chǎn)物根皮素的積累也會對轉(zhuǎn)化液中的酶產(chǎn)生抑制。底物質(zhì)量濃度為8 g/L時的產(chǎn)率（66.21%）與底物質(zhì)量濃度為10 g/L時的產(chǎn)率（69.55%）差異不大，且此后，繼續(xù)增加底物質(zhì)量濃度，根皮素產(chǎn)率變化不明顯。

圖4 底物質(zhì)量濃度對根皮素轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of substrate concentration on the yield of phloretin

2.2 響應(yīng)面試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以轉(zhuǎn)化時間（X1）、轉(zhuǎn)化溫度（X2）、液料比（X3）為自變量，以根皮素產(chǎn)率（Y）為響應(yīng)值進行響應(yīng)面試驗。響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments

2.2.2 模型建立及響應(yīng)面分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件對表2數(shù)據(jù)進行處理，方差分析見表3。

由表3回歸模型的方差分析結(jié)果可知，模型的F值為14.09（P＜0.01），說明擬合的方程極顯著（模型可靠），但是失擬項的F值為93.15（P＜0.01），說明方程模擬的不好，不能很好用于根皮素產(chǎn)率的分析。因此對該模型進行手動優(yōu)化，結(jié)果見表4。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

表4 手動優(yōu)化后的回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model after manual optimization

由表4可知，手動優(yōu)化后的回歸模型F值為224.41，說明擬合的方程極顯著（P＜0.01）；同時，失擬項的F值為6.95，失擬項不顯著（P＞0.05），說明用轉(zhuǎn)化時間、轉(zhuǎn)化溫度、液料比這3個參數(shù)擬合的根皮素產(chǎn)率方程是可行的；此外，該回歸模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.998 0，校正系數(shù)（與預(yù)測復(fù)相關(guān)系數(shù)（以上參數(shù)均說明該模型合理，實驗誤差小，可以用于根皮素產(chǎn)率的分析。

一次項X1對根皮素產(chǎn)率的影響有顯著作用（P＜0.05），X2和X3對根皮素產(chǎn)率的影響達極顯著水平（P＜0.01）；二次項、、對根皮素產(chǎn)率的影響有極顯著作用（P＜0.01）；交互項X1X3對根皮素產(chǎn)率有極顯著影響（P＜0.01），而X1X2、X2X3對根皮素產(chǎn)率的作用不顯著（P＞0.05），無統(tǒng)計學(xué)差異。

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，得到的回歸擬合方程如下：回歸模型中X1、X2、X3前的擬合系數(shù)分別為0.61、1.93、1.99，可知各試驗因素對根皮素產(chǎn)率影響的大小順序為X3（液料比）＞X2（轉(zhuǎn)化溫度）＞X1（轉(zhuǎn)化時間），其中液料比和轉(zhuǎn)化溫度是主要影響因素；回歸方程的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為0.88%，說明數(shù)據(jù)離散程度較小，在正常范圍內(nèi)；因此，可用該回歸模型對根皮素產(chǎn)率進行預(yù)測和分析。由回歸方程預(yù)測得到的根皮苷最佳生物轉(zhuǎn)化工藝為：轉(zhuǎn)化時間18.09 h、轉(zhuǎn)化溫度41.20℃、液料比11.52∶1（V/V），根皮素產(chǎn)率為70.97%。

2.3 響應(yīng)曲面圖分析與驗證試驗

表4數(shù)據(jù)通過Design-Expert 8.0.6軟件進行回歸擬合后，所得響應(yīng)面圖見圖5。

由圖5可知，當(dāng)液料比一定時，根皮素產(chǎn)率隨時間的延長而增加，在18 h時趨于穩(wěn)定；而根皮素的產(chǎn)率隨溫度的升高呈先增后減的趨勢，在40℃時根皮素產(chǎn)率最高，此后根皮素產(chǎn)率呈下降趨勢，分析其原因可能是因為溫度升高，轉(zhuǎn)化液中酶失活所致。當(dāng)轉(zhuǎn)化溫度一定時，根皮素產(chǎn)率隨著時間和液料比的增加而增加，但時間過長可能會導(dǎo)致根皮素的水解，進而影響根皮素產(chǎn)率。當(dāng)時間一定時，隨著液料比增大，根皮素產(chǎn)率呈增加趨勢；液料比達到11∶1（V/V）后，根皮素產(chǎn)率基本保持不變，此時，底物根皮苷最大限度地參與反應(yīng)。

基于響應(yīng)面法分析結(jié)果和實際工業(yè)生產(chǎn)，將理論最佳工藝調(diào)整為：轉(zhuǎn)化時間18 h、轉(zhuǎn)化溫度41℃、液料比12∶1（V/V）。在此條件下平行驗證3次，最終試驗結(jié)果取平均值，得到根皮素產(chǎn)率為70.12%，與理論值70.97%基本相符，說明該回歸模型可靠。

圖5 轉(zhuǎn)化時間、轉(zhuǎn)化溫度、液料比交互作用對根皮素產(chǎn)率影響的響應(yīng)面與等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between conversion time,conversion temperature and liquor-material ratio on the yield of phloretin

3 結(jié)論

本試驗利用釀酒酵母可產(chǎn)β-葡萄糖苷酶，該酶專一性地作用于根皮苷的β-D-葡萄糖苷鍵，脫糖基為根皮素。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計，考察轉(zhuǎn)化時間、轉(zhuǎn)化溫度、液料比這三個因素對根皮素產(chǎn)率的影響，建立數(shù)學(xué)模型，得出根皮苷生物轉(zhuǎn)化最佳工藝條件為：轉(zhuǎn)化時間18 h、轉(zhuǎn)化溫度41℃、液料比12∶1（V/V），底物質(zhì)量濃度8 g/L。在此條件下，根皮素產(chǎn)率為70.12%。

本研究獲得了釀酒酵母生物轉(zhuǎn)化根皮苷為根皮素的工藝條件，與傳統(tǒng)化學(xué)法和酸堿法相比，具有操作簡單、條件溫和、成本低等優(yōu)點，為后期根皮素工業(yè)化的生成奠定了基礎(chǔ)，但還需要進一步中試調(diào)試，以滿足工業(yè)化生成的實際需求。

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