郭昕， 鞏榮艷， 朱娟娟， 曾成娟， 沈詠梅， 岳碧松， 李靜*

1. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610065；2.四川省藥用動(dòng)物工程技術(shù)研究中心，四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限責(zé)任公司，成都610031)

美洲大蠊Periplanetaamericana隸屬于昆蟲綱Insecta蜚蠊目Blattaria大蠊屬Periplaneta，是重要的藥用昆蟲，臨床上對(duì)創(chuàng)面的修復(fù)及愈合具有明顯的促進(jìn)作用，同時(shí)還具有消炎抗菌、保肝抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功能(胡艷芬等，2008；史未名，2012；吳紅梅等，2013；湯雁利等，2014；陳啟亮等，2015；張漢超等，2017)。原兒茶酸(protocatechuic acid，PCA)化學(xué)名稱為3，4-二羥基苯甲酸，是一種天然的酚酸類物質(zhì)。研究顯示，這種廣泛存在的化合物在抗癌、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、修復(fù)缺血損傷，以及治療阿爾茲海默病、過敏性哮喘、帕金森癥、乙型肝炎等方面都發(fā)揮了重要作用。PCA具有多樣的生物活性，如提高心肌耐氧能力、減慢心率、抗高血糖以及抗腫瘤，此外，還具有抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、抑制細(xì)胞凋亡、抗血小板凝集、降低心肌耗氧量、祛痰等功能，臨床上常用于治療慢性氣管炎，同時(shí)PCA能夠抑制體外的化學(xué)致癌物質(zhì)，達(dá)到促凋亡和抗增殖的效果，具有潛在的化學(xué)防護(hù)及抗乙肝病毒價(jià)值(Anetal.，2006；魏苗苗，2013；黃非，2017；張曉燕等，2017)。研究表明，美洲大蠊除了含有大量的脂肪酸、多糖、氨基酸、多元醇(楊勇勛，2013；滿紅霞等，2014；周芹芹等，2015)，還含有水楊酸、PCA及核苷酸類成分。學(xué)者們已通過高效液相色譜法建立了定量分析美洲大蠊提取物中尿嘧啶、次黃嘌呤、肌苷含量的方法(楊勇勛，2013；周蘇，2013；黃博等，2014；蔣文賢等，2015；李旸等，2015；溫慧敏等，2015)。但迄今為止，關(guān)于美洲大蠊中其他藥理活性成分的定量分析仍缺乏相關(guān)報(bào)道。

美洲大蠊乙醇提取物是康復(fù)新液上市藥品的基礎(chǔ)成分，呂娜等(2017)通過萃取、制備型液相和波譜法發(fā)現(xiàn)美洲大蠊乙醇提取物含有PCA，但其在美洲大蠊乙醇提取物中的含量分析尚未見報(bào)道。

超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography，UPLC)與傳統(tǒng)的高效液相色譜相比，具有分離度更高、分析速度更快、檢測(cè)器靈敏度更高的特點(diǎn)。UPLC色譜柱采用粒徑小于2 μm的填料，顯著增加了柱的效能。與傳統(tǒng)的C18色譜柱相比，T3色譜柱能保證與100%水相流動(dòng)相兼容，對(duì)不同極性的化合物均有良好的保留，在分析過程中適用范圍更廣。本文擬通過外標(biāo)法在UPLC上運(yùn)用T3色譜柱建立定量分析美洲大蠊乙醇提取物中PCA的方法，同時(shí)測(cè)定PCA的含量。

1 材料與方法

1.1 儀器材料

Waters ACQUITY超高效液相色譜儀，配備ACQUITY Arc系統(tǒng)及PDA檢測(cè)器；ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，美國Waters公司。

美洲大蠊乙醇提取物脫脂原液(批號(hào)：B170205)由四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限責(zé)任公司提供；PCA(批號(hào)：223812，J & K Chemical公司)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%。

1.2 樣品制備

美洲大蠊乙醇提取物脫脂原液經(jīng)13 000 r·min-1高速離心1 min，取上清液過膜后，每個(gè)樣品瓶分裝1.5 mL，分裝6個(gè)樣品瓶備用，作為供試品。

稱取0.016 g PCA溶于100 mL甲醇配成濃度為160 μg·mL-1的PCA對(duì)照品溶液，再加甲醇等比例依次稀釋到80 μg·mL-1、40 μg·mL-1、20 μg·mL-1、10 μg·mL-1，每個(gè)濃度保留10 mL，置于4 ℃冰箱備用。

1.3 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)

美洲大蠊乙醇提取物脫脂原液、濃度為160 μg·mL-1的PCA對(duì)照品溶液各1 mL，13 000 r·min-1高速離心1 min，取上清液過膜后備用。精確稱取1 mg PCA加入到3 mL美洲大蠊乙醇提取物脫脂原液中，充分溶解后離心過膜，作為加樣對(duì)照組。上述樣品均按照本實(shí)驗(yàn)建立的色譜條件進(jìn)樣分析。

1.4 方法學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.4.1線性關(guān)系考察在本實(shí)驗(yàn)建立的色譜條件下，按照濃度由低到高的順序?qū)?個(gè)濃度PCA對(duì)照品溶液依次進(jìn)樣分析。分別記錄各個(gè)濃度PCA對(duì)照品溶液的相對(duì)峰面積。然后以濃度為橫坐標(biāo)、相對(duì)峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性分析(姚靜倩等，2009；周蘇，2013；李宇馳等，2016)。

1.4.2精密度實(shí)驗(yàn)取1 mL 160 μg·mL-1的PCA，離心過膜后在本實(shí)驗(yàn)建立的色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，以PCA對(duì)照品溶液的峰面積計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)(姚靜倩等，2009；周蘇，2013；李宇馳等，2016)。

1.4.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取1份供試品在本實(shí)驗(yàn)建立的色譜條件下每隔2 h進(jìn)樣1次，共進(jìn)樣6次。取6組中PCA所對(duì)應(yīng)的峰面積計(jì)算RSD，評(píng)估樣品的穩(wěn)定性(姚靜倩等，2009；周蘇，2013；李宇馳等，2016)。

1.4.4重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取6份供試品在本實(shí)驗(yàn)建立的色譜條件下每份樣品進(jìn)1針，不間斷分析。取6組中PCA所對(duì)應(yīng)的峰面積計(jì)算RSD(姚靜倩等，2009；周蘇，2013；李宇馳等，2016)。

1.4.5加樣回收實(shí)驗(yàn)取3份10 mL已知含量的美洲大蠊乙醇提取物脫脂原液按照1∶2、1∶1、2∶1(已知量∶添加量)比例向其中分別添加1.00 mg、0.50 mg、0.30 mg PCA，每種添加濃度進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取平均值；根據(jù)加樣回收率=(測(cè)得量-固有含量)/加入量×100%計(jì)算(姚靜倩等，2009；周蘇，2013；李宇馳等，2016)。

2 結(jié)果

2.1 UPLC洗脫條件建立

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm×100 mm；1.8 μm)，樣品溫度25 ℃，進(jìn)樣量1 μL，柱溫40 ℃，流速0.5 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置3個(gè)，分別是190～450 nm、254 nm、360 nm。流動(dòng)相選擇緩沖鹽(0.1%甲酸，25 mmol甲酸銨)(流動(dòng)相A)和100%乙腈(流動(dòng)相B)，洗脫時(shí)間為11 min(劉璇等，2013；馮光維等，2016)。洗脫梯度見表1。

表1 UPLC洗脫梯度程序Table 1 Elution gradient program of UPLC

實(shí)驗(yàn)初期，選擇流動(dòng)相A(0.1%乙酸)、流動(dòng)相B(100%乙腈)時(shí)，出峰效果不理想，分離度差，有拖尾現(xiàn)象；后加入緩沖鹽，改用流動(dòng)相A(0.1%甲酸和25 mmol甲酸銨)后，峰型明顯改善，達(dá)到了預(yù)期的分離效果。

在選擇檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)，190～450 nm為全波長(zhǎng)；280 nm是PCA的最大吸收波長(zhǎng)；360 nm處的特征吸收峰可以幫助鑒定特征物質(zhì)，因此，選擇在190～450 nm、254 nm、360 nm下同時(shí)檢測(cè)。為了滿足美洲大蠊乙醇提取物脫脂原液中高極性成分的分析要求，選用T3色譜柱代替常用的C18色譜柱。結(jié)果顯示，T3色譜柱能準(zhǔn)確分析原液中的目標(biāo)成分，適用于本實(shí)驗(yàn)建立的洗脫方法。

為了能夠快速出峰，首先建立9 min的洗脫程序，并未出現(xiàn)PCA的特征峰；當(dāng)優(yōu)化條件至11 min，在3.3 min處洗脫出分離度較好的單峰，經(jīng)外標(biāo)法鑒定為PCA，且原液以及PCA對(duì)照品的目標(biāo)峰分離度良好。

2.2 美洲大蠊乙醇提取物的UPLC分析

美洲大蠊乙醇提取物在3.3 min處所出峰與PCA的保留時(shí)間一致，且兩者在3.3 min提取的光譜圖均相同(圖1：A，B)；向3 mL美洲大蠊乙醇提取物脫脂原液中加入1 mg PCA對(duì)照品后，進(jìn)樣1 μL分析(圖1：C)，與美洲大蠊乙醇提取物1號(hào)峰的出峰時(shí)間完全吻合，且峰高及峰面積明顯升高，表明1號(hào)峰就是目標(biāo)成分——PCA。

2.3 方法學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以PCA濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，取5個(gè)系列濃度依次進(jìn)樣分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，在10～160 μg·mL-1內(nèi)，PCA濃度與峰面積呈線性關(guān)系，方程為y=7 188.6x+5 371.7，R2=0.999 9(圖2)。

精密度實(shí)驗(yàn)測(cè)得RSD為0.59%，穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)與重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的RSD分別為0.80%和0.73%，均小于1%，表明儀器的精密度、樣品的穩(wěn)定性以及方法的重復(fù)性良好。

加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PCA的平均回收率為98.30%～99.57%，RSD分別為0.40%、0.64%、0.30%，3組回收率均大于98%，RSD均小于1%，符合統(tǒng)計(jì)學(xué)分析標(biāo)準(zhǔn)，證明樣品及實(shí)驗(yàn)儀器穩(wěn)定，本方法具有良好的回收率(表2)。

圖1 美洲大蠊乙醇提取物脫脂原液(A)、原兒茶酸(B)和加樣對(duì)照組(C)的超高效液相色譜Fig. 1 Ultra performance liquid chromatography of ethanol extract of Periplaneta americana (A)， protocatechuic acid (B) and control group (C)

a. 1號(hào)峰的光譜圖， b. 原兒茶酸的光譜圖

a. spectrum of No.1 peak， b. spectrum of protocatechuic acid

圖2 原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of protocatechuic acid

2.4 樣品中PCA的定量分析

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得1 mL美洲大蠊乙醇提取物脫脂原液中含有51.38 μg PCA，即美洲大蠊乙醇提取物脫脂原液中PCA的濃度為51.38 μg·mL-1。

3 討論

周燕園(2014)基于高效液相色譜法比較了乙腈-磷酸水溶液、乙腈-水溶液、甲醇-磷酸水溶液、甲醇-水溶液等流動(dòng)相系統(tǒng)，最終確定以甲醇-0.1%磷酸水溶液作為流動(dòng)相時(shí)，醋五味子配方顆粒中PCA的分離度最好。但傳統(tǒng)的高效液相色譜法分析耗時(shí)長(zhǎng)、消耗人力物力大。與之相比，UPLC法分析快速、穩(wěn)定性和重復(fù)性高，可大大提高分析效率。劉冰等(2015)使用ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱建立益智仁的UPLC指紋圖譜，并標(biāo)定出PCA特征峰。也

表2 原兒茶酸回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The recovery rate of protocatechuic acid

有研究采用Waters H-Class UPLC系統(tǒng)以及ACQUITY UPLC BEH C18柱，以甲醇-0.2%磷酸水、乙腈-0.1%甲酸水體系建立的測(cè)定大血藤及潛陽育陰方中PCA含量的方法也相對(duì)成熟(劉曉涵，祁龍凱，2016；孟龑等，2017)。本研究首次采用外標(biāo)法，通過UPLC分析鑒定了美洲大蠊乙醇提取物中的PCA色譜峰，并針對(duì)美洲大蠊乙醇提取物的極性及物質(zhì)組成，在分離度最高、出峰數(shù)量最多的前提下采用T3色譜柱建立了定量分析PCA含量的UPLC法。結(jié)果表明，PCA在UPLC圖譜中的保留時(shí)間約3.3 min，本方法重復(fù)性好、穩(wěn)定性高，在分析美洲大蠊乙醇提取物脫脂原液中的PCA時(shí)針對(duì)性強(qiáng)。本研究建立的PCA定量分析方法為今后定量檢測(cè)美洲大蠊相關(guān)制劑中該成分提供了重要方法，也為美洲大蠊中藥制劑的質(zhì)量控制研究奠定了基礎(chǔ)。

近年來，隨著對(duì)美洲大蠊藥用價(jià)值研究的不斷深入，美洲大蠊中多種藥理活性成分不斷被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道。PCA已被證實(shí)具有抗癌、抗氧化、保護(hù)神經(jīng)、修復(fù)缺血損傷等廣泛的生物活性。本研究基于UPLC法定量檢測(cè)了美洲大蠊乙醇提取物中PCA的含量為51.38 μg·mL-1。在UPLC色譜圖上，PCA的色譜峰峰面積比其他色譜峰高，表明該成分可能是美洲大蠊乙醇提取物中重要的活性成分之一，從而為闡明美洲大蠊中的藥用活性成分提供了重要參考。

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