孔德望，張克強(qiáng) ，房 芳，高文萱，梁軍鋒 ，梁 雨，杜連柱*

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院，沈陽(yáng) 110866；2.農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，天津 300191；3.天津環(huán)科源環(huán)?？萍加邢薰荆旖?300191）

隨著我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)集約化、規(guī)模化的快速發(fā)展，畜禽糞便產(chǎn)量逐年增加，正確處理和利用養(yǎng)殖廢棄物已成為養(yǎng)殖業(yè)健康良性發(fā)展的關(guān)鍵因素。厭氧消化因其工藝相對(duì)簡(jiǎn)單、活性污泥量少而逐漸成為有機(jī)廢棄物處理的主要技術(shù)之一，在畜禽養(yǎng)殖廢棄物處理和資源化利用中得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。

厭氧消化性能受溫度、pH、有機(jī)負(fù)荷、回流等眾多因素的影響，其中消化液的回流能夠減少微生物流失和沼液排放量、提高發(fā)酵體系的緩沖能力、緩解沼液后續(xù)深度處理的壓力[1]。Estevez等[2]研究了消化液回流對(duì)牛糞和汽爆過(guò)的沙柳混合半連續(xù)厭氧發(fā)酵的作用，結(jié)果表明，1∶1的回流比能夠提高沼氣中的甲烷含量，同時(shí)甲烷產(chǎn)率提高16.0%。吳樹(shù)彪等[3]在牛糞的厭氧發(fā)酵研究中發(fā)現(xiàn)，固液分離后的消化液回流使基質(zhì)的產(chǎn)甲烷率提高16.3%，但隨著回流的進(jìn)行，日產(chǎn)甲烷量呈下降趨勢(shì)。Nordberg等[4]的研究結(jié)果表明，消化液回流能夠增加青貯苜蓿厭氧發(fā)酵體系的pH、堿度和穩(wěn)定性。高新星等[5]對(duì)比了固體產(chǎn)酸發(fā)酵反應(yīng)器中消化液浸泡和噴淋兩種回流方式對(duì)豬糞和秸稈混合原料兩相厭氧消化性能的影響，發(fā)現(xiàn)在消化液浸泡回流方式下累積產(chǎn)氣量是噴淋回流的2倍，而且穩(wěn)定性更好，單位質(zhì)量總固體產(chǎn)氣量可達(dá)217.88 mL·g-1。

以往的研究主要針對(duì)固液分離后的消化液回流，重點(diǎn)集中在對(duì)產(chǎn)氣性能的影響，對(duì)消化液直接回流及直接回流過(guò)程中微生物的群落變化及其與產(chǎn)氣之間的關(guān)系研究不足。鄧遵等[6]研究了ABR反應(yīng)器出水回流對(duì)微生物種群的影響，結(jié)果表明，與不回流相比，回流反應(yīng)器中真細(xì)菌、古細(xì)菌、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌和耗氫產(chǎn)乙酸菌的相對(duì)豐度分別高出8.5%、4.5%、3.5%和3.0%。Zamanzadeh等[7]研究了消化液回流對(duì)食品廢水厭氧消化中微生物的影響，結(jié)果表明，中溫條件下，回流和不回流體系中優(yōu)勢(shì)古菌均為甲烷鬃毛菌屬，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯差別，門(mén)水平上優(yōu)勢(shì)菌分別為厚壁菌門(mén)和綠屈撓菌門(mén)，而高溫條件下的微生物群落則非常相似。

本試驗(yàn)采用實(shí)驗(yàn)室豬糞中溫厭氧消化連續(xù)試驗(yàn)，研究消化液直接回流過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)組成變化特征，并分析其與產(chǎn)氣性能的關(guān)系，為優(yōu)化規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)大中型沼氣工程的運(yùn)行參數(shù)、提高產(chǎn)氣效率提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

豬糞取自天津市西青區(qū)某養(yǎng)殖有限公司，取當(dāng)日產(chǎn)鮮豬糞冷藏于（4±1）℃的冰箱。接種物取自實(shí)驗(yàn)室正常運(yùn)行的有機(jī)負(fù)荷（OLR）為 4.0 g·L-1·d-1的豬糞中溫混合厭氧反應(yīng)器（Continuous Stirred Tank Reactor，CSTR）。底物與接種物的理化指標(biāo)見(jiàn)表1。

表1 底物和接種物的基本性質(zhì)Table 1 Characteristics of substrates and inoculum sludge

1.2 試驗(yàn)裝置

試驗(yàn)裝置為有機(jī)玻璃材質(zhì)的CSTR反應(yīng)器，有效容積7 L。反應(yīng)器頂部安裝攪拌裝置，設(shè)有進(jìn)料口、排氣口，側(cè)部設(shè)上下兩個(gè)取樣口，底部設(shè)有出料口，反應(yīng)器采用雙層結(jié)構(gòu)，恒溫水浴加熱（圖1）。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

圖1 厭氧發(fā)酵試驗(yàn)裝置圖Figure 1 Experimental equipment of anaerobic digestion

厭氧發(fā)酵的OLR為4.0 g·L-1·d-1（以VS計(jì)），水力停留時(shí)間（HRT）為30 d。試驗(yàn)啟動(dòng)前，在反應(yīng)器內(nèi)裝填4 L接種物，加水至7 L。啟動(dòng)階段，每天排出約233.3 mL的消化液，定量稱(chēng)取豬糞加蒸餾水至約233.3 mL，混勻后填充至反應(yīng)器。運(yùn)行穩(wěn)定后，出料的50%替代蒸餾水進(jìn)入反應(yīng)器，回流試驗(yàn)共進(jìn)行219 d。反應(yīng)器通過(guò)雙層水浴加熱，保持發(fā)酵溫度為（35±0.5）℃。試驗(yàn)采取間歇攪拌方式，每攪拌2 h停10 min，轉(zhuǎn)數(shù)為 50 r·min-1。

每天測(cè)量產(chǎn)氣量，每2 d測(cè)量氣體中CH4和CO2的百分含量，每3 d取消化液分析pH值、揮發(fā)性脂肪酸（VFAs，乙酸、丙酸、丁酸和戊酸）、氨氮等指標(biāo)。取接種物（S0）、試驗(yàn)第 68 d（S1，1～68 d，短期回流）和第219 d（S2，69～219 d，長(zhǎng)期回流）消化液樣品（重復(fù)取樣3次）用于微生物群落分析。

1.4 理化指標(biāo)分析

產(chǎn)生的沼氣收集于氣袋中，通過(guò)濕式氣體流量計(jì)測(cè)量體積，消化液pH、氨氮濃度采用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定[8]，CH4和CO2的百分含量及VFAs濃度采用前期試驗(yàn)[9]的處理及分析方法。

1.5 Miseq高通量測(cè)序分析

1.5.1 樣品DNA提取

樣品DNA采用Fast DNAs Spin Kit（Mpbio，美國(guó)）試劑盒提取，S0、S1和S2的重復(fù)樣品（3個(gè)）分別提取DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA的完整性，通過(guò)超微量分光光度計(jì)（Nano Drop 2000，Thermo Scientific，Wilmington，美國(guó)）測(cè)定濃度，然后將提取的DNA混勻。

1.5.2 PCR擴(kuò)增

細(xì)菌擴(kuò)增引物為341F（5′-CCTACACGACGCTCT TCCGATCTG（barcode）CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和 805R（5′-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATT CCAGACTACHVGGGTATCTAATCC-3′），產(chǎn)甲烷古菌擴(kuò)增引物為 349F[5′-CCCTACACGACGCTCTTCCG ATCTN（barcode）GYGCASCAGKCGMGAAW-3′]和806R（5′-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTC CAGGACTACVSGGGTATCTAAT-3′）[10]。采用 PCR 儀（C100 Thermal Cycler）對(duì)樣品16S rDNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系及條件參照文獻(xiàn)[11-12]，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，采用生工瓊脂糖回收試劑盒（Cat：SK8131）對(duì) PCR 產(chǎn)物進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物用Qubit 2.0定量。

1.5.3 Miseq測(cè)序

樣品送生工生物工程（上海）股份有限公司，測(cè)序平臺(tái)為Miseq 2x300，測(cè)序后的DNA序列進(jìn)行拼接，通過(guò)barcode標(biāo)簽序列區(qū)分樣品序列，采用Prinseq（0.20.4）對(duì)樣本序列做質(zhì)量控制，在QIIME中調(diào)用Uclust（1.1.579）軟件，設(shè)置97%相似性，對(duì)有效DNA序列數(shù)據(jù)進(jìn)行操作分類(lèi)單元（OTU）分類(lèi)，采用RDP軟件比對(duì)Silva數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種分類(lèi)，在門(mén)、綱、目、科和屬分類(lèi)水平上統(tǒng)計(jì)樣本的物種豐度。采用Mothur軟件計(jì)算種群豐富度指數(shù)（Chao指數(shù)、ACE指數(shù)）和群落多樣性指數(shù)（Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)）。

2 結(jié)果與討論

2.1 沼氣發(fā)酵性能參數(shù)

表2為厭氧發(fā)酵在短期長(zhǎng)期回流下沼氣產(chǎn)率、氨氮濃度、乙酸濃度、pH值等參數(shù)的平均值。由表可見(jiàn)，消化液回流的平均VS產(chǎn)氣率由409 mL·g-1升高到477 mL·g-1，氨氮、乙酸的平均濃度和pH值也明顯升高，但沼氣中的CH4百分含量有所降低。

表2 沼氣產(chǎn)率及反應(yīng)器關(guān)鍵指標(biāo)Table 2 Variations of biogas yield and key factors

2.2 微生物群落多樣性分析

在OTUs（操作分類(lèi)單位）為97%的相似性水平下，對(duì)厭氧消化過(guò)程中細(xì)菌和古菌微生物群落多樣性進(jìn)行分析比較（圖2、圖3和表3）。由圖2和圖3可知，盡管細(xì)菌和古菌的稀釋曲線未達(dá)到平坦?fàn)顟B(tài)，但Shannon指數(shù)曲線隨著序列數(shù)的增加迅速趨于平坦，表明測(cè)序數(shù)量能夠反映樣品中絕大多數(shù)微生物信息[11]。從圖2稀釋曲線和表3中Chao和ACE指數(shù)可知，隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，厭氧發(fā)酵體系中細(xì)菌和古菌群落的豐富度均有所提高，細(xì)菌的豐富度增加幅度明顯高于古菌。

表征微生物群落多樣性的Shannon指數(shù)變化趨勢(shì)與Chao、ACE指數(shù)相似，隨著發(fā)酵的進(jìn)行呈升高趨勢(shì)，表明細(xì)菌群落多樣性增加，群落的復(fù)雜程度升高，而古菌的Shannon指數(shù)基本沒(méi)有變化，表明長(zhǎng)期消化液回流對(duì)古菌群落的多樣性和復(fù)雜程度影響不大。厭氧發(fā)酵體系中，微生物群落多樣性越高產(chǎn)沼氣性能越好，雖然S2中產(chǎn)甲烷古菌的多樣性沒(méi)有明顯增加，但細(xì)菌多樣性提高了16.1%，從而導(dǎo)致了沼氣產(chǎn)率的提升。

Simpson指數(shù)體現(xiàn)了優(yōu)勢(shì)物種生物量占群落生物總量的比重，該指數(shù)越大表明優(yōu)勢(shì)菌群生物量占總生物量比重越小，反之則優(yōu)勢(shì)菌群生物量占總生物量比重越大[12]。與Shannon指數(shù)不同，隨著厭氧發(fā)酵的進(jìn)行細(xì)菌的Simpson指數(shù)降低，而產(chǎn)甲烷古菌的升高，表明細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群的生物量占總生物量的比例增大，古菌優(yōu)勢(shì)菌群的占比減小。

圖2 細(xì)菌和古菌的稀釋曲線Figure 2 Rarefaction curves of bacteria and archaeal communities

圖3 細(xì)菌和古菌的Shannon指數(shù)曲線Figure 3 Shannon index curves of bacteria and archaeal communities

表3 發(fā)酵過(guò)程中微生物豐富度和多樣性變化Table 3 Richness and diversity of microbial communities during digestion

綜合各指數(shù)可以看出，與產(chǎn)甲烷古菌相比，厭氧發(fā)酵體系中的細(xì)菌具有更高的微生物種群豐富度和多樣性，與已有研究報(bào)道相一致，這主要是由細(xì)菌和產(chǎn)甲烷古菌遺傳發(fā)育的多樣性差異造成的[13]。

2.3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化

不同發(fā)酵時(shí)期樣品中細(xì)菌群落在門(mén)、綱和屬的分類(lèi)水平見(jiàn)圖4。由圖4a可知，細(xì)菌主要屬于8個(gè)門(mén)，其中厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）為主要的優(yōu)勢(shì)菌群，在S0、S1和S2中的相對(duì)豐度分別為62.79%、71.66%、81.46%和 19.39%、20.32%、6.74%；其次是變形菌門(mén)（Proteobacteria）和無(wú)壁菌門(mén)（Tenericutes），相對(duì)豐度分別為 2.59%、1.84%、3.23%和0.04%、0.11%和1.96%；未分類(lèi)菌門(mén)則為12.75%、3.41%和3.36%。

厚壁菌門(mén)是厭氧發(fā)酵水解酸化階段最優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌類(lèi)群，能夠產(chǎn)生降解復(fù)雜有機(jī)物的纖維素酶、蛋白酶和各種胞外水解酶，在高濃度氨氮的厭氧消化體系中，很多已知的同型乙酸氧化（SAO）菌屬于該門(mén)類(lèi)微生物[14-15]。Sundberg等[16]的研究結(jié)果顯示，在餐廚和屠宰場(chǎng)等廢棄物的中溫混合厭氧發(fā)酵中，厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度達(dá)到83%。Li等[14]對(duì)我國(guó)12個(gè)以豬場(chǎng)糞污為原料的厭氧沼氣工程微生物分析結(jié)果顯示，厚壁菌門(mén)的平均豐度為63.73%，其在5個(gè)沼氣工程中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，平均豐度達(dá)到78.44%，另外，牛場(chǎng)和豬場(chǎng)廢棄物厭氧消化中，游離氨與厚壁菌門(mén)成顯著正相關(guān)。試驗(yàn)中不同階段厚壁菌門(mén)均占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，而且隨著回流時(shí)間的延長(zhǎng)其相對(duì)豐度逐漸升高，達(dá)到81.46%，這可能與體系中氨氮濃度逐漸升高有關(guān)。擬桿菌門(mén)和變形菌門(mén)是污泥水解和產(chǎn)酸的主要菌。試驗(yàn)中，發(fā)酵液長(zhǎng)期回流對(duì)擬桿菌門(mén)細(xì)菌影響明顯，相對(duì)豐度從初期的20%左右降至219 d時(shí)的6.74%，而變形菌門(mén)和無(wú)壁菌門(mén)變化較小。

屬于厚壁菌門(mén)（Firmicutes）的梭菌綱（Clostridia）包含數(shù)量眾多的微生物，具有降解蛋白、脂肪和碳水化合物等多種物質(zhì)的功能，同時(shí)能夠?qū)⒁宜岷腿樗徂D(zhuǎn)化為H2和CO2[17-18]。試驗(yàn)中，梭菌綱在不同時(shí)期均占明顯優(yōu)勢(shì)，占比分別為58.62%、65.60%和68.19%（圖4b），相對(duì)豐度逐漸升高，表明該種群在水解酸化過(guò)程中較其他綱微生物具有更強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力，同時(shí)反映出消化液回流的厭氧消化系統(tǒng)中梭菌綱與氫營(yíng)養(yǎng)型甲烷菌的互養(yǎng)關(guān)系占主導(dǎo)，并呈加強(qiáng)趨勢(shì)[18]。另一種優(yōu)勢(shì)微生物為擬桿菌綱（Bacteroidia），占比分別為2.45%、4.31%和4.92%。其他主要微生物相對(duì)豐度幾乎均呈升高趨勢(shì)，但不大于3.88%。

圖4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化Figure 4 Variation of bacteria communities structure

圖4c為屬分類(lèi)水平上細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，雖然大量的細(xì)菌序列未能分類(lèi)，但屬水平上的群落結(jié)構(gòu)仍能提供反應(yīng)器中微生物群落功能的重要信息[18-19]。由圖可知，相對(duì)豐度高于1.00%的細(xì)菌基本屬于厚壁菌門(mén)、梭菌綱，以梭菌屬（Clostridium）為優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度由S0的35.44%經(jīng)S1的35.77%升高至S2的39.10%，與日平均產(chǎn)氣率的變化一致，表明日平均產(chǎn)氣率與梭菌屬的豐度呈正相關(guān)。第二優(yōu)勢(shì)菌屬為具有纖維素降解能力的Saccharofermentans，相對(duì)豐度從11.64%經(jīng)13.9%下降到5.25%。未分類(lèi)的細(xì)菌在各個(gè)階段的相對(duì)含量分別為28.57%、27.43%和20.66%，表明還存在較多的細(xì)菌尚未被分類(lèi)，需要更深入的研究和挖掘。

2.4 古菌群落結(jié)構(gòu)變化

圖5為消化液回流不同階段產(chǎn)甲烷古菌在門(mén)、綱、目、科和屬水平上的群落結(jié)構(gòu)。由圖5a可知，在S0、S1和S2中，產(chǎn)甲烷菌在門(mén)水平上非常單一，廣古菌門(mén)（Euryarchaeota）占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其相對(duì)豐度分別為94.76%、99.89%和 99.59%，泉古菌門(mén)（Crenarchaeota）則只占4.40%、0.08%和0.11%。綱水平上（圖5b）甲烷微菌綱（Methanomicrobia）和甲烷桿菌綱（Methanobacteria）是優(yōu)勢(shì)微生物，但隨消化液回流時(shí)間的延長(zhǎng)表現(xiàn)出不同的變化規(guī)律，甲烷微菌綱由S0的53.35%升高至S1和S2的56.97%和78.09%，而甲烷桿菌綱則由S0的38.34%最終下降至S2的16.78%。

目水平上，各產(chǎn)甲烷菌的相對(duì)豐度大小表現(xiàn)為甲烷八疊球菌目（Methanosarcinales）＞甲烷桿菌目（Methanobacteriales）＞甲烷微菌目（Methanomicrobiales），消化過(guò)程中，前者處于升高的趨勢(shì)，中者下降，后者下降，但變化不大，科水平上的古菌相對(duì)豐度變化與目水平一致。有研究表明，不同產(chǎn)甲烷菌對(duì)體系中有害物質(zhì)或環(huán)境因子具有不同的抵抗能力，高沼氣產(chǎn)率下，甲烷八疊球菌目（科）占比高于其他古菌[20-22]。試驗(yàn)中，隨著回流時(shí)間的延長(zhǎng)，雖然對(duì)產(chǎn)甲烷微生物具有毒害作用的氨氮的濃度逐漸升高達(dá)到5371 mg·L-1，但沼氣的VS產(chǎn)率達(dá)到477 mg·g-1（表2），這與高氨氮濃度下甲烷八疊球菌科的相對(duì)豐度較高有關(guān)。

圖5 產(chǎn)甲烷古菌群落結(jié)構(gòu)變化Figure 5 Variation of archaeal communities structure

雖然整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)甲烷古菌的多樣性差異較小（表3），但在屬水平上分類(lèi)的差異卻非常明顯（圖5e），可分為7個(gè)屬，其中甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）、甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）和甲烷球菌屬（Methanosphaera）為優(yōu)勢(shì)菌屬。甲烷八疊球菌屬相對(duì)豐度由S0的23.99%依次升高到S1的56.55%和S2的72.28%，而甲烷短桿菌和甲烷球菌屬的相對(duì)豐度總體呈降低趨勢(shì)，分別由16.34%、21.71%降低至3.70%、12.93%，表明回流體系的產(chǎn)氣率與甲烷八疊球菌屬的相對(duì)豐度呈正相關(guān)，與甲烷短桿菌屬和甲烷球菌屬呈負(fù)相關(guān)。其他菌屬還包括甲烷鬃毛菌屬（Methanosaeta）、甲烷囊菌屬（Methanoculleus）、熱裸單胞菌屬（Thermogymnomonas）、甲烷螺菌屬（Methanospirillum）。

作為畜禽糞污厭氧發(fā)酵中常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)甲烷菌屬，甲烷八疊球菌屬是已知的唯一能夠利用所有產(chǎn)甲烷途徑的菌屬，很多文獻(xiàn)都將其歸結(jié)為乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌[23-24]，然而這需要進(jìn)一步研究。試驗(yàn)中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，甲烷八疊球菌屬的相對(duì)豐度升高，而包括甲烷短桿菌屬、甲烷球菌屬和甲烷囊菌屬（Methanoculleus）等在內(nèi)的氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的總占比在S0和S1中基本相同（43.10%和43.14%），在S2中則下降至22.54%，表明在回流初期多種微生物對(duì)甲烷產(chǎn)生的貢獻(xiàn)相當(dāng)，隨著回流時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸以甲烷八疊球菌屬的代謝為主，其主要原因可能是：（1）接種物取自長(zhǎng)期運(yùn)行的豬糞厭氧消化反應(yīng)器，經(jīng)過(guò)高濃度氨氮的馴化，具有較高的氨氮耐受濃度；（2）甲烷八疊球菌屬對(duì)氨氮具有高達(dá)7000 mg·L-1的耐受濃度[25]，雖然體系中氨氮濃度達(dá)到 5371 mg·L-1，但未對(duì)甲烷八疊球菌屬產(chǎn)生抑制。

值得注意的是，同屬乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的甲烷鬃毛菌屬和甲烷八疊球菌屬在本研究中表現(xiàn)迥然不同，甲烷八疊球菌屬占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，而甲烷鬃毛菌屬S0時(shí)為24.14%，S1和S2時(shí)則低于0.05%，主要原因是甲烷鬃毛菌屬對(duì)乙酸和氨氮均比甲烷八疊球菌屬敏感[22]。甲烷鬃毛菌屬只能代謝乙酸，能在低至0.3～1.2 mg·L-1的濃度環(huán)境中生長(zhǎng)，在 93.7～140.6 mg·L-1的濃度范圍內(nèi)為優(yōu)勢(shì)菌屬，而甲烷八疊球菌屬所需最小乙酸濃度約為 60.1 mg·L-1，在 234.3～468.6 mg·L-1以上時(shí)為優(yōu)勢(shì)菌屬[23，25]。試驗(yàn)中，S1和S2的乙酸濃度分別為 52.5 mg·L-1和 3 397.7 mg·L-1，均不在甲烷鬃毛菌屬的最適乙酸濃度內(nèi)，但是甲烷八疊球菌屬在S2時(shí)期處于適宜的乙酸濃度內(nèi)，因此甲烷八疊球菌屬表現(xiàn)出更強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力[26]。另外，有機(jī)負(fù)荷也影響乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌。有文獻(xiàn)[27]報(bào)道，在低有機(jī)負(fù)荷下甲烷鬃毛菌屬占優(yōu)勢(shì)，而高有機(jī)負(fù)荷下甲烷八疊球菌屬占優(yōu)勢(shì)，本試驗(yàn) VS 負(fù)荷為 4.0 g·L-1·d-1，處在較高水平。

3 結(jié)論

（1）在消化液回流過(guò)程中，細(xì)菌較古菌具有更高的多樣性和豐富度，并且隨著回流時(shí)間的延長(zhǎng)有所提高，而產(chǎn)甲烷古菌變化不明顯。

（2）消化液回流的不同時(shí)期，細(xì)菌以厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）為主，梭菌屬（Clostridium）占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，古菌以甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）為主，且隨回流時(shí)間的延長(zhǎng)，優(yōu)勢(shì)更加明顯，這與甲烷八疊球菌屬具有高的氨氮和乙酸耐受濃度有關(guān)。

（3）回流過(guò)程中，發(fā)酵體系的日平均產(chǎn)氣率與梭菌屬和甲烷八疊球菌屬的相對(duì)豐度呈正相關(guān)，而與甲烷短桿菌屬和甲烷球菌屬呈負(fù)相關(guān)。

（4）在219 d的發(fā)酵周期內(nèi)，回流導(dǎo)致氨氮和揮發(fā)性有機(jī)酸濃度升高，產(chǎn)氣效率維持在較高水平，雖未表現(xiàn)出抑制作用，但長(zhǎng)期運(yùn)行應(yīng)關(guān)注氨氮濃度變化對(duì)微生物和產(chǎn)氣效率的影響。

[1]Hu Y,Shen F,Yuan H R,et al.Influence of recirculation of liquid fractionofthedigestate（LFD）onmaizestoveranaerobicdigestion[J].Biosystems Engineering,2014,127（1）：189-196.

[2]Estevez M M,Sapci Z,Linjordet R,et al.Semi-continuous anaerobic co-digestion of cow manure and steam-exploded Salix with recirculation of liquid digestate[J].Journal of Environmental Management,2014,136（8）：9-15.

[3]吳樹(shù)彪,黎佳茜,李 偉,等.沼液回流對(duì)牛糞厭氧發(fā)酵產(chǎn)氣特性及其動(dòng)力學(xué)的影響[J].農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào),2015,46（10）：241-246.WU Shu-biao,LI Jia-qian,LI Wei,et al.Effect of liquid digestate recirculation on biogas production and fermentation kinetics for anaerobic digestion of cattle manure[J].Transactions of the Chinese Society of A-gricultural Machinery,2015,46（10）：241-246.

[4]Nordberg A,Jarvis A,Stenberg B,et al.Anaerobic digestion of alfalfa silage with recirculation of process liquid[J].Bioresource Technology,2007,98（1）：104-111.

[5]高新星,趙立欣,董保成,等.分離式兩相厭氧發(fā)酵滲濾液回流對(duì)發(fā)酵過(guò)程影響試驗(yàn)[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2011,27（10）：266-269.GAO Xin-xing,ZHAO Li-xin,DONG Bao-cheng,et al.Experimental study on effect of separated two-phase anaerobic fermentation leachate recirculation on anaerobic process[J].Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering,2011,27（10）：266-269.

[6]鄧 遵,彭劍峰,宋永會(huì),等.出水回流對(duì)ABR反應(yīng)器啟動(dòng)過(guò)程中污染物去除效果和微生物種群的影響[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2012,32（9）：2104-2111.DENG Zun,PENG Jian-feng,SONG Yong-hui,et al.Effect of reflux on population distributions of microorganisms and contaminant removals in start-up of an anaerobic baffled reactor[J].ActaScientiae Circumstantiae,2012,32（9）：2104-2111.

[7]Zamanzadeh M,Hagen L H,Svensson K,et al.Anaerobic digestion of food waste effect of recirculation and temperature on performance and microbiology[J].Water Research,2016,96：246-254.

[8]國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局.水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法[M].四版.北京：中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社,2002：211-281.State Environmental Protection Administration.Methods for monitoring and analysis of water and wastewater[M].4th Edition.Beijing：China Environmental Science Press,2002：211-281.

[9]宋香育,張克強(qiáng),房 芳,等.工藝措施對(duì)豬糞秸稈混合厭氧干發(fā)酵產(chǎn)氣性能的影響[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2017,33（11）：233-239.SONG Xiang-yu,ZHANG Ke-qiang,FANG Fang,et al.Influences of different technological strategies on performance of anaerobic co-digestion of pig manure with straw in solid-state[J].Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering,2017,33（11）：233-239.

[10]Yang B,Xu H,Wang J F,et al.Bacterial and archaeal community distribution and stabilization of anaerobic sludge in a strengthen circulation anaerobic（SCA）reactor for municipal wastewater treatment[J].Bioresource Technology,2017,244：750-758.

[11]Zhang J,Sun Q L,Zeng Z G,et al.Microbial diversity in the deep-sea sediments of Iheya North and Iheya Ridge,Okinawa Trough[J].Microbiological Research,2015,177（3）：43-52.

[12]陳重軍,張海芹,汪瑤琪,等.基于高通量測(cè)序的ABR厭氧氨氧化反應(yīng)器各隔室細(xì)菌群落特征分析[J].環(huán)境科學(xué),2016,37（7）：2652-2658.CHEN Chong-jun,ZHANG Hai-qin,WANG Yao-qi,et al.Characteristics of microbial community in each compartment of ABR ANAMMOX reactor based on high-throughput sequencing[J].Environmental Science,2016,37（7）：2652-2658.

[13]Guo X H,Wang C,Sun F Q,et al.A comparison of microbial characteristics between the thermophilic and mesophilic anaerobic digesters exposed to elevated food waste loadings[J].Bioresource Technology,2014,152：420-428.

[14]Li J B,Rui J P,Yao M J,et al.Substrate type and free ammonia determine bacterial community structure in full-scale mesophilic anaerobic digesters treating cattle or swine manure[J].Frontiers in Microbiology,2015,6.doi:10.3389/fmicb.2015.01337.

[15]Sieber J R,McInerney M J,Gunsalus R P.Genomic insights into syntrophy：The paradigm for anaerobic metabolic cooperation[J].Annual Review of Microbiology,2012,66（1）：429-452.

[16]Sundberg C,Al-Soud W A,Larsson M,et al.454 pyrosequencing analyses of bacterial and archaeal richness in 21 full-scale biogas digesters[J].FEMS Microbiology Ecology,2013,85（3）：612-626.

[17]Luo G,Angelidaki I.Analysis of bacterial communities and bacterial pathogens in a biogas plant by the combination of ethidium monoazide,PCR and Ion Torrent sequencing[J].Water Research,2014,60：156-163.

[18]Jang H M,Kim J H,Ha J H,et al.Bacterial and methanogenic archaeal communities during the single-stage anaerobic digestion of highstrength food wastewater[J].Bioresource Technology,2014,165（8）：174-182.

[19]Chen S Y,Niu L L,Zhang Y X.Saccharo fermentans acetigenes gen.nov.,sp.nov.,an anaerobic bacterium isolated from sludge treating brewery wastewater[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2010,60（12）：2735-2738.

[20]De Vrieze J,Saunders A M,He Y,et al.Ammonia and temperature determine potential clustering in the anaerobic digestion microbiome[J].Water Research,2015,75：312-323.

[21]Regueiro L,Lema J M,Carballa M.Key microbial communities steering the functioning of anaerobic digesters during hydraulic and organic overloading shocks[J].Bioresource Technology,2015,197：208-216.

[22]Hao L P,Bize A,Conteau D,et al.New insights into the key microbial phylotypes of anaerobic sludge digesters under different operational conditions[J].Water Research,2016,102：158-169.

[23]Liu Y C,Whitman W B.Metabolic,phylogenetic,and ecological diversity of the methanogenic archaea[J].Annals of the New York Academy of Sciences,2010,1125（1）：171-189.

[24]Song Z L,Zhang C.Anaerobic codigestion of pretreated wheat straw with cattle manure and analysis of the microbial community[J].Bioresource Technology,2015,186：128-135.

[25]De Vrieze J,Hennebel T,Boon N,et al.Methanosarcina：The rediscovered methanogen for heavy duty biomethanation[J].Bioresource Technology,2012,112（5）：1-9.

[26]Yu D,Kurola J M,Lahde K,et al.Biogas production and methanogenic archaeal community in mesophilic and thermophilic anaerobic co-digestion processes[J].Journal of Environmental Management,2014,143：54-60.

[27]Chelliapan S,Wilby T,Yuzir A,et al.Influence of organic loading on the performance and microbial community structure of an anaerobic stage reactor treating pharmaceutical wastewater[J].Desalination,2011,271（1）：257-264.