王會(huì)敏 ，張洪軍 ，李秀慧 ，陳瑞蘭 ，路廣計(jì) ，張秀麗 ，劉建民

（1.圍場(chǎng)縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 068450；2.河北省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 050000；3.圍場(chǎng)縣農(nóng)牧局 068450）

布魯氏菌?。˙rucellosis）簡(jiǎn)稱布病，是由布魯氏菌屬（Brucella）的細(xì)菌（簡(jiǎn)稱布魯氏菌）引起的一種人畜共患病，為《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》規(guī)定報(bào)告的乙類傳染病之一，在世界各地都有廣泛流行，嚴(yán)重威脅人類健康，尤其在發(fā)展中國(guó)家，是受到普遍關(guān)注的世界性公共衛(wèi)生問(wèn)題。全世界現(xiàn)有布魯氏菌病患者約500600萬(wàn)人，年新發(fā)病人數(shù)約有50萬(wàn)，全世界每年因布魯氏菌病造成的經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)30億美元[1]。

布魯氏菌分為6個(gè)經(jīng)典的種，其中羊種、牛種、豬種、犬種4個(gè)種能夠使人致病。而牛種和羊種是最為常見(jiàn)的人布病的病原體。據(jù)中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心2013年定點(diǎn)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，牛的場(chǎng)群陽(yáng)性率34.13%、樣品平均陽(yáng)性率4.02%，羊的場(chǎng)群陽(yáng)性率51.18%、樣品平均陽(yáng)性率4.32%。由于帶菌動(dòng)物是其他動(dòng)物和人類布魯氏菌病的傳染源。因此從源頭抑制畜間布魯氏菌病的疫情上升趨勢(shì)是控制人間布魯氏菌病的重要前提[2]。我國(guó)人間布病的發(fā)病數(shù)呈逐年上升趨勢(shì)，病原學(xué)監(jiān)測(cè)研究顯示在我國(guó)引起人發(fā)病的布魯氏菌菌株主要是羊種3型[3]。

本研究從某地區(qū)分離布魯氏菌病流行菌株，并對(duì)其進(jìn)行鑒定。從而掌握此地區(qū)布魯氏菌病的傳染源和疫情流行情況，為制定切實(shí)可行的布魯氏菌病綜合性防控措施提供前期基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料

采集牛的組織樣品及牛奶樣品，采集15頭陽(yáng)性牛共45份樣品（牛奶及組織）。培養(yǎng)基、恒溫CO2培養(yǎng)箱。其他實(shí)驗(yàn)耗材。

2 試驗(yàn)方法

將采集的臟器進(jìn)行研磨后，無(wú)菌組織勻漿接種于150個(gè)選擇性培養(yǎng)基，同時(shí)將乳汁離心沉淀上接種于50個(gè)選擇性培養(yǎng)基中，然后將75個(gè)培養(yǎng)平皿放于普通培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，75個(gè)培養(yǎng)基放于含有5%～10%的CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，培養(yǎng)5d進(jìn)行觀察。

將未生長(zhǎng)細(xì)菌的平皿，繼續(xù)培養(yǎng)10～20d后，繼續(xù)觀察。

疑似陽(yáng)性進(jìn)行菌落觀察，挑取單菌落進(jìn)行單菌落劃線25個(gè)平皿培養(yǎng)，同時(shí)進(jìn)行結(jié)晶紫染色，挑取光滑型菌落接種于斜面培養(yǎng)基，進(jìn)行CO2的需求和H2S的產(chǎn)生試驗(yàn)，用對(duì)硫堇、復(fù)紅染料進(jìn)行敏感性測(cè)試，用特異性抗血清進(jìn)行凝集反應(yīng)試驗(yàn)。

3 試驗(yàn)結(jié)果與分析

25頭75份樣品接種75個(gè)培養(yǎng)基初篩結(jié)果（見(jiàn)表1），分離菌株革蘭氏染色檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)圖1），分離菌株Bruce-Ladder檢測(cè)結(jié)果（見(jiàn)圖2、圖3），分離菌株生化鑒定試驗(yàn)（見(jiàn)表2）。

表1 培養(yǎng)基初篩結(jié)果

25份樣品通過(guò)培養(yǎng)基進(jìn)行初篩后，發(fā)現(xiàn)16份疑似菌落，其余未見(jiàn)疑似菌落，布魯氏菌病檢測(cè)為陰性。16份疑似菌落經(jīng)鑒定13份牛種3型，3份羊種1型。

3.1 菌落的形態(tài)

25份勻漿在布氏瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)生長(zhǎng)5d后，16份樣品的培養(yǎng)基上可見(jiàn)生長(zhǎng)的菌落，菌落無(wú)色、圓潤(rùn)、表面光滑（見(jiàn)圖1）。

3.2 布魯氏菌株的PCR鑒定

挑取16個(gè)平板培養(yǎng)基上的疑似菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。以牛種A544標(biāo)準(zhǔn)株和羊種16M標(biāo)準(zhǔn)株為陽(yáng)性對(duì)照。鑒定結(jié)果表明，16個(gè)疑似菌株中有13株約750bp的特異性片段，與布魯氏菌陽(yáng)性對(duì)照一致?？瞻讓?duì)照未見(jiàn)特異性片段（見(jiàn)圖2、圖3）。

3.3 生化鑒定

應(yīng)用常規(guī)生化試驗(yàn)對(duì)PCR鑒定的牛種3型與羊種1型及陰性菌進(jìn)行鑒定。采用布魯氏菌特異性血清A、M分別與待檢菌株的培養(yǎng)物進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)，同時(shí)還進(jìn)行CO2需要、H2S產(chǎn)生、染料抑菌試驗(yàn)。分離的3株細(xì)菌對(duì)CO2無(wú)依賴，不產(chǎn)生H2S、在硫堇和堿性復(fù)紅染料培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)，9株陰性菌菌株鑒定后仍為陰性菌（表2）。

圖1 分離菌株革蘭氏染色檢測(cè)結(jié)果

圖2 分離菌株Bruce-Ladder檢測(cè)結(jié)果

4 討論

我國(guó)流行的布魯氏菌主要有羊種、牛種、豬種，其中羊種對(duì)人的感染率最強(qiáng)，豬種次之，牛種較弱。此次分離到的16株地方菌株，經(jīng)鑒定13株為牛種3型布魯氏菌，3株為羊種1型布魯氏菌。2013年錢(qián)振宇、姜霞、賈肇一等人研究，分離的8株菌株經(jīng)傳統(tǒng)分型方法鑒定均為羊種菌，羊種1型1株，羊3型6株，粗糙型羊種菌1株[4]。僅有羊種1型人畜共有，其他菌型在人間還未見(jiàn)報(bào)道。這也表明目前感染布魯氏菌病的羊是主要的傳染源，印證我國(guó)布魯氏菌病流行菌株的感染強(qiáng)度，提醒我們對(duì)牛、羊布魯氏菌病的監(jiān)測(cè)是控制動(dòng)物布魯氏菌病的有效途徑。

病原的分離是確診布魯氏菌的標(biāo)準(zhǔn)，分離的病原進(jìn)行種型的鑒定是控制、預(yù)防和根除布魯氏菌病的關(guān)鍵[5]。但現(xiàn)基層動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)受到人員、設(shè)備及經(jīng)費(fèi)的影響，主要采用血清學(xué)檢測(cè)的方式進(jìn)行檢測(cè)，無(wú)法開(kāi)展病原學(xué)監(jiān)測(cè)，血清學(xué)方法存在一定的假陽(yáng)性，易造成誤殺，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖者的經(jīng)濟(jì)收入。因此，找尋一種方法或者幾種方法相結(jié)合、敏感性高的血清學(xué)檢測(cè)方法，對(duì)掌握布魯氏菌病的流行及分布情況具有重要的意義。

圖3 分離菌株Bruce-Ladder檢測(cè)結(jié)果

表2 分離菌株生化鑒定試驗(yàn)結(jié)果