吳家棟 綜述，肖 瑞 審校

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 050059)

成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(CRISPR)/CRISPR蛋白9(Cas9)是一種多功能的基因組編輯技術(shù)，被稱(chēng)為分子剪刀，廣泛應(yīng)用于遺傳因子功能的研究、遺傳疾病的臨床前研究、癌癥研究、藥物發(fā)現(xiàn)、精神疾病研究及植物應(yīng)用等領(lǐng)域。CRISPR/Cas9系統(tǒng)被發(fā)現(xiàn)于多種細(xì)菌和古細(xì)菌物種中，已經(jīng)成功地被用于編輯真核生物基因組[1-2]。目前，越來(lái)越多的數(shù)據(jù)表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)不僅可以靶向蛋白質(zhì)編碼基因組，而且可以靶向人類(lèi)的非編碼RNA(noncoding RNA，ncRNA)[3-5]。然而，CRISPR/Cas9系統(tǒng)也有其局限性，它存在嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)，這可能導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性并破壞其他正?；虻墓δ躘6-7]。癌癥是導(dǎo)致人類(lèi)死亡的主要原因之一[8]，盡管腫瘤的綜合治療已取得了令人振奮的成果，但是腫瘤的復(fù)發(fā)及放化療過(guò)程中出現(xiàn)的不良反應(yīng)等問(wèn)題大大降低了癌癥患者的生活質(zhì)量[9]，而CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以糾正導(dǎo)致癌癥的突變，并且是一種可以在基因水平保護(hù)患者的治療技術(shù)[3]，因此，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的出現(xiàn)拉開(kāi)了癌癥治療的新序幕。本文通過(guò)總結(jié)CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)及其在ncRNA相關(guān)基因組編輯中的最新應(yīng)用，旨在為腫瘤治療的深入研究甚至臨床治療提供新思路。

1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的概述

迄今為止，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了3種可編程核酸酶用于基因組編輯，包括鋅指核酸酶(ZFN)[10]，轉(zhuǎn)錄激活劑樣效應(yīng)子因子核酸酶(TALEN)[11-12]和CRISPR相關(guān)蛋白(Cas)系統(tǒng)[13]的RNA引導(dǎo)的核酸酶(RGNs)。在這些核酸酶中，根據(jù)其指導(dǎo)RNA和DNA之間的Watson-Crick堿基配對(duì)識(shí)別目標(biāo)DNA的Cas9核酸酶實(shí)施最簡(jiǎn)單，并且迅速成為基因組工程中最流行和有力的工具。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是來(lái)自細(xì)菌和古細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，可檢測(cè)和降解來(lái)自噬菌體和質(zhì)粒的侵染性DNA[14]。1987年末，ISHINO等[15]在大腸桿菌中首次發(fā)現(xiàn)了聚類(lèi)重復(fù)片段被一系列間隔序列中斷，該現(xiàn)象后被稱(chēng)為CRISPR。到目前為止，研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了10多種不同的CRISPR/Cas系統(tǒng)，根據(jù)其不同的機(jī)制將其分為3類(lèi)(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型)和許多亞型[16-17]。其中CRISPR/Cas9是一種在化膿鏈球菌中應(yīng)用的Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)，由于其具有高效率和高準(zhǔn)確性，是哺乳動(dòng)物中使用最廣泛的系統(tǒng)[18]。Cas9介導(dǎo)的基因組編輯有3個(gè)要求：(1)單鏈向?qū)NA(single guide RNA，sgRNA)序列，CRISPR/Cas9系統(tǒng)是第一個(gè)用于基因組編輯的CRISPR/Cas系統(tǒng)，部分原因是它含有一個(gè)相關(guān)的易編程的sgRNA，只有20個(gè)核苷酸長(zhǎng)的識(shí)別序列[1-2，19]。 sgRNA由具有與靶位點(diǎn)互補(bǔ)序列的CRISPR RNA(crRNA)和分別轉(zhuǎn)錄并部分與crRNA互補(bǔ)的反式激活的crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)組成[1，20-21]。(2)具有核定位信號(hào)的Cas9蛋白，為了發(fā)揮基因組編輯功能，CRISPR/Cas9系統(tǒng)還需要與這兩種RNA組分緊密相關(guān)的關(guān)鍵酶組分Cas9核酸酶[18]，這些RNA需要將Cas9蛋白引導(dǎo)到靶位點(diǎn)并激活Cas9核酸酶。(3)前間區(qū)序列鄰近基序(protospacer adjacent motif，PAM)，sgRNA與Cas9蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，sgRNA與Cas9蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，并嚴(yán)格識(shí)別位于靠近PAM的3′末端側(cè)翼的靶向互補(bǔ)DNA序列，其通常由NGG或NAG(N可為A，T，G或C)組成，然后啟動(dòng)DNA雙鏈斷裂(DSBs)[9]。從理論上講，帶有PAM的任何基因組序列都可以由Cas9用特定的sgRNA進(jìn)行編輯，由于基因組中PAM的高發(fā)生率，CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的sgRNA幾乎可以靶向所有的基因。

2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)

雖然CRISPR/Cas9系統(tǒng)與ZFN、TALEN等其他的基因組編輯技術(shù)相比有許多優(yōu)勢(shì)，但它仍有一些嚴(yán)重的缺點(diǎn)亟待解決，例如脫靶效應(yīng)，也就是說(shuō)Cas9可能會(huì)錯(cuò)誤地結(jié)合到目標(biāo)位點(diǎn)之外的序列內(nèi)并產(chǎn)生突變，引起一些嚴(yán)重的后果[5，22-23]。SCHAEFER等[24]采用全基因組測(cè)序檢測(cè)經(jīng)CRISPR處理的小鼠細(xì)胞的脫靶情況，結(jié)果顯示，在經(jīng)CRISPR/Cas9體內(nèi)編輯后誘導(dǎo)出高數(shù)目的突變，該研究表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)是一個(gè)廣泛存在的現(xiàn)象。這種脫靶效應(yīng)已經(jīng)通過(guò)不同的體內(nèi)和體外方法進(jìn)行了徹底分析[8-9，25]，主要是由于sgRNA的識(shí)別序列與非靶點(diǎn)DNA發(fā)生了局部匹配，主要原因有：(1)一般情況下，sgRNA不能識(shí)別和編輯任何鄰近PAM的非靶點(diǎn)DNA位點(diǎn)(長(zhǎng)度為10～12 bp)，發(fā)生堿基錯(cuò)配，且不能識(shí)別3個(gè)以上的非靶點(diǎn)DNA位點(diǎn)。經(jīng)典的通過(guò)體外篩選結(jié)合高通量測(cè)序的方法檢測(cè)CRISPR/Cas9系統(tǒng)在HEK293T細(xì)胞的脫靶情況的研究表明，Cas9的sgRNA有多達(dá)5個(gè)錯(cuò)配[25]。(2)當(dāng)脫靶位點(diǎn)DNA序列長(zhǎng)度比sgRNA多或少幾個(gè)堿基時(shí)會(huì)形成DNA凸起或RNA凸起，從而完成其他堿基的正確配對(duì)。即使脫靶位點(diǎn)DNA序列長(zhǎng)度比sgRNA的識(shí)別序列的長(zhǎng)度差5 bp，仍能通過(guò)形成多個(gè)凸起的形式進(jìn)行堿基配對(duì)并介導(dǎo)CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行DNA切割[26]。

2.1CRISPR/Cas9系統(tǒng)脫靶效應(yīng)的影響因素

2.1.1sgRNA 雖然Cas9的靶點(diǎn)特異性地被sgRNA的20nt引導(dǎo)的序列區(qū)嚴(yán)格控制著，但幾項(xiàng)初步研究表明，sgRNA鄰近PAM的10～12 bp的堿基配對(duì)更能決定Cas9的靶點(diǎn)特異性，并且通常比其余的向?qū)NA(gRNA)序列更重要[2，18]。此外，sgRNA的GC含量也與特異性密切相關(guān)。在一項(xiàng)CRISPR/Cas9介導(dǎo)誘變的研究中觀察到，sgRNAs的PAM序列的最近端區(qū)域其誘變效率與GC含量呈正相關(guān)[27]。研究表明，在最接近PAM序列的6個(gè)堿基對(duì)的序列中，具有至少4個(gè)GC的sgRNA具有超過(guò)60%的可遺傳突變率，這提示可以根據(jù)PAM附近序列的GC含量選擇有效的sgRNA。

2.1.2PAM CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行切割的必要條件就是PAM序列區(qū)，也就是說(shuō)即使靶點(diǎn)序列與sgRNA序列完全匹配，如果沒(méi)有PAM序列，Cas9也不能進(jìn)行切割[28]，而DNA的切割效率也取決于PAM序列[29]。NGG(N可為A，T，C或G)是PAM的既定序列。然而，最近的研究表明，盡管與NGG相比只有約五分之一的結(jié)合效率，Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)也可以使用NRG(其中R為G或A)作為PAM序列。幾項(xiàng)研究報(bào)道，NRG序列是人EMX基因座中CRISPR/Cas9介導(dǎo)的DNA切割的主要非既定PAM[9，30]。PAM序列中每個(gè)堿基的結(jié)合頻率不同。第1個(gè)核苷酸是最不固定的，其中G在接近50%的結(jié)合位點(diǎn)，而第2個(gè)位置，G在大于90%的結(jié)合位點(diǎn)[9，31]，表明NRG不是CRISPR/Cas9序列設(shè)計(jì)的最佳PAM。因此，NRG PAM序列對(duì)Cas9 DNA切割的確切作用在很大程度上尚不清楚[32]。

2.1.3Cas9蛋白和其他因素 研究顯示，將純化的Cas9蛋白和sgRNA直接輸送到細(xì)胞中，可導(dǎo)致脫靶效應(yīng)降低，這是因?yàn)镃as9-sgRNA核糖核蛋白復(fù)合物在分娩后幾乎立即切割染色體DNA并在細(xì)胞中迅速降解[33-34]。脫靶效應(yīng)還可能與細(xì)胞型特異性有關(guān)，并且高度取決于特定細(xì)胞類(lèi)型的DNA雙鏈斷裂(DBS)修復(fù)途徑的完整性[35]。此外，CpG位點(diǎn)的DNA甲基化也可能會(huì)阻礙Cas9在細(xì)胞中的結(jié)合效率[36]。

2.2降低脫靶效應(yīng)的策略

2.2.1改變sgRNA序列 通過(guò)截短sgRNA的3′末端、縮短與sgRNA的5′末端的靶點(diǎn)互補(bǔ)區(qū)域3nt或添加2個(gè)鳥(niǎo)嘌呤核苷酸到sgRNA的5′末端，可以大大降低脫靶反應(yīng)，并可在一些脫靶位點(diǎn)減少約5 000倍突變的可能[25，37]。同時(shí)，RNA引導(dǎo)的內(nèi)切核酸酶(RNA-guided endonuclease，RGEN)使用這些改變的sgRNA也可以降低脫靶效應(yīng)。

2.2.2控制Cas9/sgRNA復(fù)合物的濃度 如果增加轉(zhuǎn)染的DNA量，則增加了Cas9/sgRNA復(fù)合物的濃度，雖然增加了正確靶點(diǎn)的結(jié)合率，但也增加了脫靶效應(yīng)；如果減少轉(zhuǎn)染的DNA的量，則減少了Cas9/sgRNA復(fù)合物的濃度，通過(guò)增加靶點(diǎn)專(zhuān)一性導(dǎo)致靶內(nèi)切割減少，即脫靶效應(yīng)減少，但正確靶點(diǎn)的結(jié)合率也隨之降低[38]。因此，必須考慮靶內(nèi)切割效率和脫靶效應(yīng)之間的平衡。所以未來(lái)對(duì)Cas9和sgRNA的優(yōu)化設(shè)計(jì)需要考慮在提高Cas9特異性的同時(shí)而不犧牲靶內(nèi)切割效率[9，25，39]。

2.2.3應(yīng)用雙切口措施 盡管可以設(shè)計(jì)高度特異性的sgRNA，但是Cas9的脫靶活性卻降低了其靶向位點(diǎn)的數(shù)量，為了克服這個(gè)缺陷，有研究者將Cas9蛋白修飾得到其突變型D10ACas9切口酶(Cas9n)，Cas9n替換野生型Cas9蛋白[40-41]。這些Cas9n需要一對(duì)sgRNA編輯1個(gè)位點(diǎn)，由于Cas9n只有1個(gè)結(jié)構(gòu)域，只能通過(guò)切割DNA單鏈產(chǎn)生1個(gè)切口，因此Cas9n會(huì)在每個(gè)sgRNA結(jié)合的位置形成單鏈切口，兩個(gè)相鄰的單鏈切口會(huì)引起DBS，DBS形成后細(xì)胞會(huì)進(jìn)行修復(fù)。而在脫靶位點(diǎn)處，單鏈切口則無(wú)法形成DBS。因此，該方法在保持基因切割效率的同時(shí)，具有最小程度的脫靶效應(yīng)。目前，該方法已經(jīng)被其他許多實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用[39-40，42]。

2.2.4fCas9系統(tǒng) 為了進(jìn)一步提高DNA的切割特異性，研究者已經(jīng)合成了具有FokI核酸酶結(jié)構(gòu)域(fCas9)的無(wú)催化活性的Cas9(dCas9)的融合物(FokI-dCas9)，F(xiàn)okI-dCas9編輯目標(biāo)DNA位點(diǎn)的特異性比野生型Cas9高140倍以上[43-44]。fCas9系統(tǒng)要求當(dāng)兩個(gè)FokI-dCas9彼此靠近形成二聚體時(shí)才可進(jìn)行DNA切割。該方法在很大程度上降低了非靶向位點(diǎn)的DNA切割[44]。

3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的ncRNA編輯在人類(lèi)癌癥中的應(yīng)用

3.1CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的微RNA(miRNA)編輯 目前，許多研究已經(jīng)表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)是ncRNA相關(guān)基因組編輯或調(diào)控的最佳選擇[45-52]。miRNA作為主要的ncRNA之一在CRISPR/Cas9相關(guān)領(lǐng)域已被廣泛研究。CHANG等[45]證明了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在初級(jí)miRNA結(jié)構(gòu)上產(chǎn)生的改變可導(dǎo)致成熟的miRNA在體內(nèi)和體外下調(diào)，同時(shí)，這項(xiàng)研究還表明正確設(shè)計(jì)CRISPR/Cas9中sgRNA可顯著將同一家族中具有高度保守序列的miRNA的脫靶效應(yīng)最小化。ZHOU等[53]的研究中利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功敲除了肝癌細(xì)胞系中的miRNA-3188，發(fā)現(xiàn)miRNA-3188 KO能有效地抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和遷移，并抑制裸鼠中的異種移植物腫瘤生長(zhǎng)。另一項(xiàng)研究表明，慢病毒CRISPR/Cas9載體在將插入和缺失引入前體miRNA序列中是高效的，通過(guò)使用該方法研究者成功地破壞了miRNA-21的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)前體miRNA-21序列的破壞可導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的減少。除了編輯或調(diào)節(jié)上述的miRNA之外，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在各種癌細(xì)胞或生物體中也顯示出對(duì)其他miRNA如miRNA-137、miRNA-93、miRNA-309、miRNA-126a/b等的廣泛應(yīng)用[47-51]。

3.2CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(IncRNA)編輯 除了miRNA之外，另一種主要調(diào)控多種生物學(xué)過(guò)程的ncRNA，即IncRNA已經(jīng)被CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功調(diào)控。尿路上皮癌抗原1(UCA1)是膀胱癌中上調(diào)的IncRNA，可以通過(guò)特定設(shè)計(jì)的CRISPR/Cas9的gRNA來(lái)靶向，并在體內(nèi)和體外有效地被抑制[54]?？梢?jiàn)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可調(diào)節(jié)IncRNA的表達(dá)，并可為臨床治療癌癥提供新方法。微小的基因的缺失或插入可能不一定使某個(gè)非編碼基因的功能喪失，這可能是將CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于非編碼基因的限制之一。為了克服這個(gè)障礙，HO等[55]采用同源重組技術(shù)，將標(biāo)記基因整合到基因組中，通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功地將UCA1、IncRNA-21及AK023948分別在HTC-116和MCF-7細(xì)胞中敲除。在SHECHNER等[56]的研究中，研究者開(kāi)發(fā)了CRISPR-Display(CRISP-Disp)法，一種使用Cas9將大分子RNA載體部署到DNA基因座的有目標(biāo)性的定位方法，研究者發(fā)現(xiàn)至少長(zhǎng)4.8 bp的功能性RNA結(jié)構(gòu)域可以插入CRISPR gRNA的多個(gè)位點(diǎn)中，從而允許構(gòu)建具有天然lncRNA的Cas9復(fù)合物，這種方法可能為癌癥領(lǐng)域中的IncRNA研究開(kāi)辟一條途徑。

4 小 結(jié)

目前CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為第3代基因編輯技術(shù)，由于其經(jīng)濟(jì)、易操作，研究者們可以在其工作包中通過(guò)獲得更好的選擇而輕松地編輯感興趣的基因組等優(yōu)點(diǎn)已成為科學(xué)界的研究熱點(diǎn)。雖然CRISPR/Cas9系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)不言而喻，但它仍面臨著許多問(wèn)題與挑戰(zhàn)。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)可能會(huì)是造成不良遺傳改變的原因，從而導(dǎo)致癌癥或其他棘手的問(wèn)題，成為CRISPR/Cas9系統(tǒng)的瓶頸。雖然研究者們已經(jīng)投入了很多努力改進(jìn)對(duì)脫靶效應(yīng)的預(yù)測(cè)和降低脫靶效應(yīng)，但為了能更精確有效地編輯目標(biāo)序列，需要研究者們開(kāi)發(fā)更多的技術(shù)和算法。以往地研究認(rèn)為，脫靶效應(yīng)是一個(gè)不常見(jiàn)的現(xiàn)象，然而SCHAEFER等[24]的研究表明脫靶效應(yīng)是廣泛存在的，盡管這個(gè)觀點(diǎn)對(duì)以往的結(jié)論提出了挑戰(zhàn)，但這不是CRISPR/Cas9系統(tǒng)的危機(jī)，相反，這是研究者在使用新技術(shù)時(shí)檢測(cè)脫靶效應(yīng)的助力。

倫理問(wèn)題是研究者在實(shí)際應(yīng)用CRISPR/Cas9相關(guān)技術(shù)之前無(wú)法避免的問(wèn)題。迄今為止，大多數(shù)國(guó)家都允許研究者編輯基因組，用于提高糧食產(chǎn)量其他生物用途。然而，關(guān)于操縱人類(lèi)的卵子和精子等仍然非常具有爭(zhēng)議。首先，CRISPR/Cas9技術(shù)仍是一個(gè)尚不成熟的基因編輯技術(shù)，遺傳改造對(duì)后代的長(zhǎng)期影響知之甚少，一旦發(fā)生錯(cuò)誤或脫靶效應(yīng)，將導(dǎo)致嚴(yán)重的后果。其次，CRISPR/Cas9技術(shù)可以編輯想要的任何基因組，如果將CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用于反進(jìn)化和反人類(lèi)，將會(huì)帶來(lái)巨大的社會(huì)沖突。盡管存在分歧，但筆者樂(lè)觀地認(rèn)為，研究者將會(huì)就這個(gè)問(wèn)題與倫理學(xué)家和法律達(dá)成共識(shí)。

盡管CRISPR/Cas9系統(tǒng)仍然存在各種各樣的局限性和障礙，但相信將來(lái)隨著技術(shù)的逐漸成熟，能夠有助于藥物發(fā)現(xiàn)、癌癥治療及基因疾病的治愈。

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