何琳琳

陜西理工大學(xué) 1生物科學(xué)與工程學(xué)院，2維生素D生理與應(yīng)用研究所（陜西漢中 723000）

經(jīng)血源性干細(xì)胞（menstrual blood?derived stem cells，MenSCs）是2007年首次發(fā)現(xiàn)的一種來源于女性經(jīng)血的成體干細(xì)胞［1］，其來源豐富、易于獲得、免疫原性很低、無致瘤性，具有多向分化潛能，目前已成為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)成體干細(xì)胞的研究熱點(diǎn)之一。本文對MenSCs的增殖能力、分離純化、分化潛能、臨床前研究和臨床應(yīng)用方面的研究進(jìn)展作一系統(tǒng)綜述，以期為推進(jìn)MenSCs的基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。

1 MenSCs的增殖能力

22～30歲女性MenSCs和19～32歲女性骨髓源性間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow?derived mesenchymal stem cells，BMSCs）在24孔板的倍增時間分別為20.5 h和40.1 h，表明MenSCs的增殖能力很強(qiáng)［2］，與MENG等［3］報道19.4 h的倍增時間基本一致。30～40歲女性MenSCs在12孔板和24孔板的倍增時間為55.5 h和62 h，40～50歲女性MenSCs在12孔板和24孔板的倍增時間為70.4 h和72.4 h［4］，表明MenSCs的增殖能力隨年齡增大顯著降低。

2 MenSCs的分離純化

MenSCs的分離純化主要采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法，少數(shù)采用貼壁培養(yǎng)法。

2.1 密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法 采用無菌杯收集女性月經(jīng)血，在含有抗生素的PBS緩沖液中洗滌，F(xiàn)icoll密度梯度離心分離單核細(xì)胞，接種后通過更換培養(yǎng)液移除非貼壁細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)獲得 MenSCs［2-3，5?20］。

2.2 貼壁培養(yǎng)法 將經(jīng)血直接接種在培養(yǎng)基中［21-22］，或加入紅細(xì)胞裂解液去除經(jīng)血中紅細(xì)胞［23］，或用含有抗生素的PBS緩沖液將經(jīng)血離心［1］，或?qū)㈦x心后經(jīng)血在含有抗生素的PBS緩沖液中離心［24-25］，接種在培養(yǎng)基中，通過更換培養(yǎng)液移除非貼壁細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)獲得MenSCs。

3 MenSCs的分化潛能

3.1 骨細(xì)胞分化 MenSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色有鮮艷的紅色鈣結(jié)節(jié)形成［3?4，25］，表明成骨分化潛能較高。然而也有 MenSCs在成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色［2，18，26］或 von Kossa染色［26］較弱，表明成骨分化潛能較低。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加人血小板來源的生長因子或人血小板釋放物，可增強(qiáng) MenSCs成骨分化能力［2，18］。

3.2 軟骨細(xì)胞分化 MenSCs經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)后免疫染色顯示表達(dá)Ⅱ型膠原［5］。在普通培養(yǎng)皿或二維培養(yǎng)系統(tǒng)中MenSCs經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)，阿爾新藍(lán)染色顯示其具有較強(qiáng)的成軟骨分化能力［22?25］。在含有特定生長因子和分化因子的納米纖維支架上MenSCs可向軟骨細(xì)胞方向分化，阿爾新藍(lán)染色顯示成軟骨分化很強(qiáng)，可作為軟骨組織工程的候選細(xì)胞［6，27］。

3.3 脂肪細(xì)胞分化 MenSCs經(jīng)成脂肪誘導(dǎo)后油紅O染色脂滴呈鮮紅色，表明其向脂肪細(xì)胞方向分化能力強(qiáng)，可作為軟組織損傷治療的干細(xì)胞替代物［3，23，28］，然而也有研究顯示其向脂肪細(xì)胞方向分化能力較弱［26］。

3.4 肌肉細(xì)胞分化 MenSCs成肌誘導(dǎo)后表達(dá)α?輔肌動蛋白［3］，表明其具有成肌分化潛能。MenSCs成肌肉細(xì)胞分化潛能很強(qiáng)，體內(nèi)或體外誘導(dǎo)可分化為肌肉細(xì)胞，甚至無誘導(dǎo)也表達(dá)骨骼肌分化標(biāo)志物，可用于肌肉損傷和慢性肌肉疾病的細(xì)胞治療［1］。

3.5 心肌細(xì)胞分化 MenSCs向心肌細(xì)胞分化［3，23］，比BM?SCs的心肌細(xì)胞分化潛能更高［21，29］，含有大量心肌前體樣細(xì)胞，體外誘導(dǎo)可分化為自發(fā)性搏動的心臟前體細(xì)胞［29。

3.6 神經(jīng)細(xì)胞分化 MenSCs向神經(jīng)細(xì)胞方向誘導(dǎo)，表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特有的表面標(biāo)志［3，24，30］。MenSCs經(jīng)成神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)后可分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞、成熟神經(jīng)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞［23］，也可分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞［20］；MenSCs可合成腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，易于向神經(jīng)細(xì)胞方向分化［31］，在體外先后分化成神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)樣細(xì)胞［19］，對未來神經(jīng)系統(tǒng)疾病的干細(xì)胞治療有一定應(yīng)用前景。

3.7 肝細(xì)胞分化 MenSCs向肝細(xì)胞導(dǎo)表達(dá)成熟肝細(xì)胞表面標(biāo)志且誘具有一定的肝細(xì)胞功能［3，5，7］，可用于肝臟疾病的細(xì)胞治療。MenSCs比BMSCs肝細(xì)胞分化潛能強(qiáng)，是一種安全的可用于慢性肝臟疾病干細(xì)胞治療的BMSCs替代物［8］。種植在納米纖維支架上的MensSCs可分化為肝細(xì)胞，表明納米纖維支架和MenSCs可為肝臟疾病治療提供肝細(xì)胞來源［9］。

3.8 髓核樣細(xì)胞分化 與髓核（nucleus pulposus，NP）細(xì)胞共培養(yǎng)的MenSCs分化為NP樣細(xì)胞，可作為未來治療椎間盤退變種子細(xì)胞的新來源［32］。

3.9 其他細(xì)胞分化 MenSCs可向呼吸道上皮細(xì)胞［3］、胰腺細(xì)胞［3］、表皮細(xì)胞［11］、顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞［10］、生殖細(xì)胞［33］方向進(jìn)行分化。缺氧環(huán)境與阿基里斯腱細(xì)胞共培養(yǎng)的MenSCs向腱細(xì)胞方向分化，可用于阿基里斯腱炎治療［34］。

4 MenSCs臨床前研究

4.1 用于心肌梗死治療 實(shí)驗(yàn)性誘導(dǎo)心肌梗死大鼠移植的MenSCs在梗死部位高效分化成心肌細(xì)胞，使心肌纖維化面積減少且左心室收縮功能恢復(fù)，是一種無創(chuàng)傷且有效的心肌疾病細(xì)胞治療的新的干細(xì)胞來源［21］。將MenSCs通過心肌內(nèi)注射移植給冠狀動脈結(jié)扎心肌梗死模型大鼠，其在梗死區(qū)域內(nèi)顯著保護(hù)存活心肌且明顯增強(qiáng)心臟功能，表明其可作為異體心肌再生醫(yī)學(xué)的干細(xì)胞來源［35］。心肌梗死后心肌纖維化與內(nèi)皮細(xì)胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（endothelial to mesenchymal transition，EndMT）相關(guān)，將MenSCs心肌內(nèi)注射給永久結(jié)扎冠狀動脈的急性MI模型大鼠，發(fā)現(xiàn)大鼠左心室顯著增厚，梗死面積顯著減少，心肌膠原沉積顯著減少，至少部分原因是由于抑制TGF?β/Smad誘導(dǎo)的心肌梗死部位 EndMT［36］。

4.2 用于膠質(zhì)瘤、卵巢癌和肺癌治療 顱內(nèi)膠質(zhì)瘤小鼠靜脈注射MenSCs可減少約50%腫瘤體積，可能由其抗血管生成引起［37］。腺病毒感染獲得分泌型腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（secretable tumor necrosis factor?related apoptosis?inducing ligand，sTRAIL）過表達(dá)的 MenSCs即MenSC?sTRAIL，其在體外可顯著抑制U?87 MG增殖并誘導(dǎo)其凋亡，注射在體內(nèi)可顯著抑制皮下U?87 MG移植瘤生長，表明其可作為細(xì)胞治療基因運(yùn)載工具用于治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和其他腫瘤［38］。新型腫瘤腺病毒AR2011在體外可溶解卵巢腫瘤細(xì)胞系和惡性腫瘤細(xì)胞，然而腹水液體中的抗體抑制其活性，預(yù)先加入MenSCs可解除這種抑制作用，MenSC?AR可抑制裸鼠卵巢癌腫瘤生長，表明MenSCs可用于解除腹水液體對病毒抗卵巢腫瘤效應(yīng)的抑制［39］?；煾深A(yù)的A549肺癌小鼠移植MenSCs，可使小鼠雙肺濕重、腫瘤轉(zhuǎn)移率及腫瘤轉(zhuǎn)移個數(shù)顯著降低，抑制轉(zhuǎn)移率為71.8%，表明MenSCs協(xié)同化療對抑制小鼠肺癌腫瘤轉(zhuǎn)移有一定效果［40］。

4.3 用于中風(fēng)治療 大鼠原代神經(jīng)元細(xì)胞與MenSCs共培養(yǎng)或在MenSCs產(chǎn)生的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，可極顯著減少神經(jīng)細(xì)胞死亡，這是由于MenSCs釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子引起的；實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)缺血性中風(fēng)的成年大鼠大腦內(nèi)或靜脈內(nèi)移植Men?SCs，可導(dǎo)致其行為障礙和組織學(xué)損傷極顯著降低，表明MenSCs可作為中風(fēng)治療的干細(xì)胞來源［30］。

4.4 用于1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）治療 T1DM小鼠靜脈注射MenSCs，可逆轉(zhuǎn)高血糖和體重減少，延長生存期并增加胰島素產(chǎn)生，恢復(fù)胰島結(jié)構(gòu)和增加β細(xì)胞數(shù)量，大多數(shù)MenSCs遷移進(jìn)入受損胰腺組織且位于胰島、胰管和外分泌組織中，表明MenSCs治療T1DM不是通過分化為胰島素產(chǎn)生細(xì)胞，而是通過促進(jìn)內(nèi)在前體細(xì)胞分化從而刺激β細(xì)胞再生［12］。

4.5 用于卵巢功能早衰（premature ovarian failure，POF）治療 環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)小鼠POF卵巢移植的MenSCs可至少存活14 d，卵巢表達(dá)更高水平的卵巢標(biāo)志物抗苗勒管激素（anti?Müllerian hormone，AMH）、抑制素（inhibin）a/b和促卵泡激素受體（follicle?stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR），表達(dá)增殖標(biāo)志物Ki67，卵巢重量、血清雌二醇（estradiol，E2）水平和正常卵泡數(shù)量增加，表明MenSCs是干細(xì)胞移植治療POF的理想種子細(xì)胞［13］。移植MenSCs可使甲磺酸丁二醇二酯和環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的POF小鼠體重增加，發(fā)情周期改善和絕育小鼠生育能力恢復(fù)，表明MenSCs可作為自體干細(xì)胞用于恢復(fù)受損的卵巢功能［41］。MenSCs移植腹腔注射順鉑構(gòu)建的POF小鼠，體質(zhì)量逐漸增加，食欲增強(qiáng)，活動增多，移植后第10天FSH濃度顯著降低，E2濃度顯著升高，原始卵泡、生長卵泡及成熟卵泡數(shù)顯著增多，卵巢間質(zhì)纖維化程度減輕，表明MenSCs移植對卵巢組織結(jié)構(gòu)及內(nèi)分泌功能起修復(fù)作用［42］。

4.6 用于Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥（Duchenne muscular dystrophy，DMD）、重癥阿謝曼氏綜合征（Asherman′s syndrome，AS）、急性后肢缺血治療 DMD小鼠肌肉移植MenSCs，可誘導(dǎo)部分骨骼肌更新，其肌肉修復(fù)作用是基于小鼠肌細(xì)胞和表達(dá)肌萎縮蛋白的MenSCs之間的細(xì)胞融合［1］。自體移植MenSCs可顯著增加重癥AS女性的子宮內(nèi)膜厚度，顯著增加其胚胎移植受孕和自發(fā)懷孕的概率［43］。急性后肢缺血模型小鼠移植MenSCs可顯著改善后肢缺血，表明經(jīng)血是一種很有前途的用于分離治療后肢體缺血的干細(xì)胞來源［14］。

4.7 用于肝纖維化、暴發(fā)性肝衰竭（fulminant hepatic fail?ure，F(xiàn)HF）、急性肝衰竭、急性肺損傷（Acute lung injury，ALI）、坐骨神經(jīng)損傷治療 四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化小鼠移植的MenSCs可遷移到損傷部位，移植后2周內(nèi)可顯著改善肝臟功能，減少膠原沉積，抑制活化的肝星狀細(xì)胞，表明MenSCs可通過靶向肝星狀細(xì)胞改善小鼠肝纖維化，可能是慢性肝臟疾病的替代治療方法［15］。MenSCs來源的外分泌體可顯著改善肝臟功能，提高生存率，移植后6 h抑制肝細(xì)胞凋亡，可能是治療FHF的替代治療方法［44］。四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠移植MenSCs或BMSCs后肝臟有一定程度再生，MenSCs治療組的肝臟生化標(biāo)志物恢復(fù)、肝標(biāo)志物mRNA水平變化及炎癥標(biāo)志物的抑制比BMSCs治療組更顯著，表明MenSCs是一種治療急性肝衰竭的BMSCs替代干細(xì)胞［45］。脂多糖誘導(dǎo)的ALI小鼠移植Men?SCs，可提高肺微血管通透性，降低組織病理損傷，使支氣管肺泡灌洗液中IL?1下調(diào)和IL?10上調(diào)，增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表達(dá)增加，caspase?3表達(dá)減少，表明MenSCs是一種有前途的ALI治療策略［16］。將MenSCs移植入人工合成的導(dǎo)管可改善坐骨神經(jīng)損傷大鼠的功能恢復(fù)，表明其具有神經(jīng)再生效果，可作為外圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病細(xì)胞治療的選擇［46］。

5 MenSCs臨床應(yīng)用

MenSCs的臨床應(yīng)用較少，僅有3例報道，1例是Men?SCs移植，2例為MenSCs和其他干細(xì)胞混合移植。2009年ZHONG等［17］將臨床制備級別的MenSCs靜脈內(nèi)和鞘內(nèi)移植給4例多發(fā)性硬化癥男性患者，隨訪1年多未出現(xiàn)任何免疫排斥反應(yīng)和治療相關(guān)不良反應(yīng)，這是首例MenSCs臨床應(yīng)用報道，表明MenSCs用于臨床移植治療的可行性。2010年ICHIM等［47］將MenSCs和CD34臍血細(xì)胞靜脈注射移植給充血性心力衰竭患者，患者射血分?jǐn)?shù)增加，腦鈉肽前體蛋白（pro?brain natriuretic peptide，Pro?BNP）顯著降低，隨訪約2年未發(fā)現(xiàn)任何和治療相關(guān)的不良反應(yīng)和副作用。同年ICHIM等［48］將MenSCs和CD34臍血細(xì)胞混合細(xì)胞注射給1例DMD患者，再注射胎盤基質(zhì)來源間充質(zhì)干細(xì)胞，無任何副作用且患者肌肉強(qiáng)度增加。

6 小結(jié)與展望

目前成體干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)應(yīng)用較廣［49］，Men?SCs作為一種重要的成體干細(xì)胞，其增殖能力強(qiáng)，具有多向分化潛能，可向骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、髓核樣細(xì)胞、呼吸道上皮細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、表皮細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞、生殖細(xì)胞、腱細(xì)胞方向進(jìn)行分化。MenSCs已被成功應(yīng)用于動物模型研究其對多種疾病如心肌梗死、膠質(zhì)瘤、卵巢癌、肺癌、中風(fēng)、T1DM、DMD、AS、急性后肢缺血、肝纖維化、FHF、急性肝衰竭、ALI和坐骨神經(jīng)損傷的治療潛力。MenSCs可用于臨床異體移植有效治療多發(fā)性硬化癥、充血性心力衰竭和DMD，迄今沒有發(fā)現(xiàn)任何移植后相關(guān)的不良反應(yīng)。隨著更多的MenSCs臨床前和臨床數(shù)據(jù)積累，隨著其應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)的作用分子機(jī)制研究的深入，相信不久的將來MenSCs會在再生醫(yī)學(xué)的舞臺上大放光彩。

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