趙雅楠，王 穎,2，張東杰,*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319）

作物品種鑒定是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)必不可少的關(guān)鍵步驟，是保證品種優(yōu)良遺傳性狀能夠充分發(fā)揮的重要舉措，同時(shí)也是名優(yōu)品種保護(hù)、防止種子混雜退化的有效手段[1]。傳統(tǒng)的品種鑒定方法主要是根據(jù)幼苗、植株的形態(tài)特征及農(nóng)藝性狀差異，但觀察周期較長(zhǎng)，且易受環(huán)境影響，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性不高[2]。同時(shí)，由于許多品種的育種親本更傾向于集中在少數(shù)優(yōu)良品種上，導(dǎo)致所育品種的植物學(xué)性狀比較相似，品種間差異越來越小，傳統(tǒng)方法已無法滿足鑒定需求。隨著品種貿(mào)易的快速發(fā)展，在品種引進(jìn)及推廣過程中假冒偽劣、以次充好、種苗混雜等情況屢禁不止，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大損失[3]。DNA指紋圖譜技術(shù)具有豐富的多態(tài)性和顯著的個(gè)體特異性，能夠在分子水平上識(shí)別品種間差異，不易受外界環(huán)境影響，可快速、準(zhǔn)確的完成品種鑒定[4-6]，主要包括限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）等。其中RFLP技術(shù)研究起步較早，可區(qū)分純合型基因或雜合型基因，但操作復(fù)雜，且需要使用放射性同位素，有害身體健康；RAPD檢測(cè)成本低、靈敏度高，但檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，重復(fù)性較差；AFLP技術(shù)檢測(cè)范圍廣，結(jié)果重復(fù)性好，但實(shí)驗(yàn)成本較高且操作復(fù)雜[7-9]。而SSR分子標(biāo)記技術(shù)，因其數(shù)量豐富、多態(tài)性高、穩(wěn)定性強(qiáng)等顯著特點(diǎn)已成為DNA指紋圖譜構(gòu)建及品種鑒定的重要途徑[10-12]。Kumar等[13]利用39 對(duì)SSR引物對(duì)印度54 份小麥進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建，為小麥品種鑒定提供重要參考；郭照東等[14]利用2 對(duì)SSR引物構(gòu)建了22 個(gè)越橘品種的指紋圖譜，建立了一套相對(duì)完善的越橘品種鑒定體系；姚全勝等[15]利用14 對(duì)SSR引物構(gòu)建了11 個(gè)芒果品種的指紋圖譜，利用其中4 對(duì)引物即可將參試品種全部區(qū)分；蔣林峰等[16]構(gòu)建了我國(guó)21 個(gè)鴨茅主栽品種的DNA指紋圖譜，具有唯一性，可用于鴨茅品種真?zhèn)舞b定，為其種權(quán)保護(hù)提供理論依據(jù)。

綠豆是起源于我國(guó)的優(yōu)勢(shì)雜糧作物，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，富含多種維生素和礦物元素，具有清熱解毒、抗癌、降血壓血脂等功效，是一種廣受歡迎的藥食同源性作物[17]。近些年，隨著人們生活水平的提高及膳食營(yíng)養(yǎng)意識(shí)的增強(qiáng)，綠豆以其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值深受青睞，品種數(shù)量逐年上升，但因?yàn)榉N種因素導(dǎo)致種子質(zhì)量管理混亂，品種真實(shí)性難以得到保證。而DNA指紋圖譜可用于綠豆品種真?zhèn)舞b定，為綠豆名優(yōu)品種保護(hù)、原產(chǎn)地溯源管理等提供科學(xué)依據(jù)[18-20]。截至目前，關(guān)于利用SSR熒光標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建綠豆DNA指紋圖譜進(jìn)行品種鑒定的研究鮮有報(bào)道?；诖?，本研究利用SSR技術(shù)構(gòu)建了遼寧地區(qū)48 份綠豆品種的指紋圖譜及分子身份證，將品種間DNA水平上的差異可視化，以期建立一種高效、準(zhǔn)確的綠豆品種真?zhèn)舞b定方法，為我國(guó)綠豆品種保護(hù)及新品選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取遼寧省大連市、阜新縣等21 個(gè)不同市縣的48 份綠豆品種，均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供，供試綠豆詳情見表1。

表1 遼寧地區(qū)48 份參試綠豆品種信息Table 1 Information about 48 mung bean samples tested in this study

植物基因組DNA提取試劑盒、Taq DNA聚合酶、Low MW DNA Marker-A、Mg2+、dNTPs、Buffer、瓊脂糖 北京天根生物技術(shù)有限公司；15 對(duì)SSR引物由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供，普通引物由深圳華大基因公司合成，熒光引物由美國(guó)ABI公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

ABI Prism 3730XL型基因分析儀 上海創(chuàng)萌生物科技有限公司；Bio-rad T100 PCR儀 北京伯邁生物科技有限公司；智能核酸蛋白檢測(cè)儀 上海嘉鵬科技有限公司；Biorad GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng) 上海旦鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

采集室溫條件下種植15 d左右的新鮮嫩葉，利用TIANGEN Plant Genomic DNA Kit提取綠豆基因組DNA，1%瓊脂糖檢測(cè)DNA提取質(zhì)量，核酸檢測(cè)儀測(cè)定DNA濃度，最后將母液稀釋成30 ng/μL保存于4 ℃環(huán)境中備用。

1.3.2 SSR-PCR體系及毛細(xì)管電泳檢測(cè)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）體系為20 μL，包括30 ng/μL DNA模板2 μL，2 μmol/L引物0.6 μL，2.5 U/μL Taq酶0.2 μL，10 mmol/L dNTP 0.4 μL，20 mmol/L MgCl21 μL，Buffer 2 μL，其余用ddH2O補(bǔ)齊。PCR程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火溫度54 ℃，退火時(shí)間35 s，72 ℃延伸40 s，共35 個(gè)循環(huán)；最終72 ℃延伸3 min；4 ℃保存。在Bio-rad T100 PCR儀上進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

15 對(duì)SSR引物在48 份綠豆材料中共擴(kuò)增出58 個(gè)等位基因，每對(duì)引物檢測(cè)到2～7 個(gè)不等，平均為3.9 個(gè)；有效等位基因數(shù)介于1.135 0～5.113 4之間，平均為1.983 5；Nei’s基因多樣性指數(shù)介于0.118 9～0.576 8之間，平均為0.428 1。多態(tài)信息含量（polymorphic information content，PIC）變幅介于0.114 5（GBssr-MB91）～0.776 4（X55）之間，平均為0.378 4。其中引物GBssr-MB91、P3-581、P3-627、P3-765為低度多態(tài)性位點(diǎn)（0＜PIC＜0.25），多態(tài)性較差，X55（0.776 4）、X46（0.513 2）為高多態(tài)性位點(diǎn)，PIC大于0.5，多態(tài)性較豐富，具有較強(qiáng)的檢測(cè)能力，可作為遼寧地區(qū)綠豆品種遺傳分析的骨干引物。其余9 對(duì)引物均為中度多態(tài)位點(diǎn)（0.25＜PIC＜0.5）。具體信息見表2。

表2 15 對(duì)SSR引物多態(tài)性信息Table 2 Genetic diversity of mungbean germplasm based on 15 SSRs

2.2 指紋圖譜構(gòu)建及品種鑒定

圖1 遼寧地區(qū)48 份綠豆品種的標(biāo)準(zhǔn)化SSR擴(kuò)增指紋圖譜Fig. 1 Standardized fingerprint of SSR amplification for mung bean varieties

表3 48 個(gè)品種在15 個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記上的指紋數(shù)據(jù)及分子身份證Table 3 Fingerprint database and molecular identity of mung bean varieties at 15 SSR loci

續(xù)表3

依據(jù)15 對(duì)引物對(duì)48 份綠豆品種的擴(kuò)增結(jié)果構(gòu)建SSR指紋圖譜，如圖1所示。圖1中橫向序號(hào)表示參試的48 個(gè)綠豆品種，縱向序號(hào)表示按表2順序的15 對(duì)引物的擴(kuò)增條帶分子質(zhì)量。其中黑色條帶處代表在該位點(diǎn)檢測(cè)到等位基因，每個(gè)品種的指紋圖譜均與表3中的指紋數(shù)據(jù)及分子身份證相對(duì)應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)模式圖甄別能力較強(qiáng)，表現(xiàn)直觀，根據(jù)圖譜呈現(xiàn)出的差異性，可快速在基因水平上實(shí)現(xiàn)綠豆品種的區(qū)分鑒定。如綠豆（C3823）和綠豆（C3832），在引物GBssr-MB87的第3個(gè)等位基因位點(diǎn)（276 bp）處存在唯一差異，可作為區(qū)分這2 個(gè)品種的標(biāo)志性位點(diǎn)；大綠豆（C0668）和綠豆（C0672）在引物P3-627的第1個(gè)等位基因位點(diǎn)（155 bp）、P3-627的第3個(gè)等位基因位點(diǎn)（164 bp）和X34的第1個(gè)等位基因位點(diǎn)（141 bp）上的區(qū)分較為明顯，可用于品種鑒別?？v向比較發(fā)現(xiàn)，15 對(duì)引物檢測(cè)到的等位基因可作為參試樣品的特異性位點(diǎn)。如標(biāo)記X20是明綠與暗綠（C0664）和小綠豆（C0669）的特異性引物，分別在195 bp和211 bp處檢測(cè)到二者的特異性位點(diǎn)，可與其他品種相區(qū)分；X46分別在107、113、115、121、123、125 bp處檢測(cè)到等位基因，其中107 bp和123 bp 2 個(gè)位點(diǎn)僅分別在小綠豆（C3838）和小綠豆（C3809）中檢測(cè)到，為其特異性位點(diǎn)，具有品種標(biāo)志性。整體分析可知除攖哥豆（C0784）、綠豆（C3807）、綠豆（C3823）和綠豆（C3826）、綠豆（C3837）外，15 對(duì)引物可將所有參試品種完全區(qū)分，區(qū)分率為89.68%，但沒有任何一對(duì)引物可將參試品種全部區(qū)分，故采用引物組合鑒定法。根據(jù)每對(duì)引物的區(qū)分效率（表4），選取鑒別能力較強(qiáng)的標(biāo)記X20、X46、X55、X62及X148進(jìn)行組合。標(biāo)記X46、X55、X148組合時(shí)，品種聚類區(qū)分率為43.75%，增加標(biāo)記X20，區(qū)分率增加至56.25%，5 個(gè)標(biāo)記組合到一起時(shí)區(qū)分率達(dá)75%?？梢?，SSR指紋圖譜應(yīng)具備可擴(kuò)充性，當(dāng)品種數(shù)量增多或鑒別能力不足時(shí)可增加引物數(shù)量以保證品種間的區(qū)分效率，避免身份識(shí)別錯(cuò)誤的情況。

表4 各標(biāo)記擴(kuò)增條帶信息Table 4 Information about amplified bands

2.3 SSR指紋數(shù)據(jù)及分子身份證構(gòu)建

圖2 明綠豆（C0787）在位點(diǎn)X55（A）和小綠豆（C0789）在位點(diǎn)X87（B）座位上的毛細(xì)管電泳峰圖Fig. 2 SSR fingerprint patterns of the cultivars Minglüdou (C0787) (A)and Xiaolüdou (C0789) (B) using primer X87

利用15 對(duì)SSR引物對(duì)48 份綠豆材料進(jìn)行擴(kuò)增，部分毛細(xì)管電泳結(jié)果如圖2所示。在同一峰值處有帶記為1，無帶記為0，建立起0/1形式的遼寧地區(qū)綠豆品種SSR指紋圖譜。按表2引物順序，將每對(duì)引物在參試綠豆品種中檢測(cè)的變異位點(diǎn)按片段大小升序排列、依次編號(hào)，將編號(hào)依次串聯(lián)，即得到由15 位數(shù)字（有雜合帶時(shí)多于15 位）構(gòu)成的分子身份證。

2.4 親緣關(guān)系分析

表5 部分綠豆品種間的遺傳相似系數(shù)Table 5 Genetic similarity coefficients among selected mung bean varieties

48 份綠豆種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)變幅介于0.517 2～1.000 0之間，平均為0.76。其中小綠豆（C0669）和綠豆（C3839）間遺傳相似系數(shù)最小，為0.517 2，說明二者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；綠豆（C3832）和綠豆（C3807）間遺傳相似系數(shù)較大，為0.982 8，說明二者間遺傳距離較小，親緣關(guān)系較近。部分品種間遺傳相似系數(shù)如表5所示。通過用非加權(quán)組平均法利用遺傳相似系數(shù)對(duì)48 份遼寧地區(qū)綠豆種質(zhì)資源材料進(jìn)行聚類分析，如圖3所示。在遺傳相似系數(shù)為0.73的閾值處，可將48 份綠豆分為4 個(gè)類群，第1類群由鸚哥綠（C0661）、小綠豆（C0663）、綠豆（C0665）等41 份品種組成，第2類群由大綠豆（C0668）、綠豆（C0672）、毛綠豆（C3840）、綠豆（C3812）、綠豆（C0673）組成，而小綠豆（C0669）和綠豆（C3839）單獨(dú)聚為一類，分別組成第3、4類群?？梢娦【G豆（C0669）和綠豆（C3839）與該地區(qū)其他品種間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。在遺傳相似系數(shù)為1.0水平上，攖哥豆（C0784）、綠豆（C3806）、綠豆（C3823）和綠豆（C3826）、小綠豆（C3838）聚為一類，并沒有被完全區(qū)分，考慮可能是因?yàn)? 組品種間遺傳背景相似，遺傳相似性較高，15 個(gè)標(biāo)記并沒有檢測(cè)到品種間的差異性位點(diǎn)，但也不排除“同名異種”的情況。

圖3 基于SSR標(biāo)記的48 份綠豆聚類分析Fig. 3 Dendrogram for 48 mung bean samples generated by SSR markers

3 討 論

SSR分子標(biāo)記技術(shù)操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性強(qiáng)，已逐漸發(fā)展為各作物指紋圖譜構(gòu)建和品種區(qū)分鑒別的有效手段，如山茶樹[21]、黃麻[22]、油菜[23]、水稻[24]等遺傳多樣性分析和品種鑒定等，SSR技術(shù)具有較好的應(yīng)用價(jià)值。目前，SSR-PCR大多采用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，但該法效率較低，在數(shù)據(jù)收集和整合的過程中容易產(chǎn)生誤差。SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管檢測(cè)技術(shù)，以DNA測(cè)序儀為平臺(tái)，可準(zhǔn)確讀出檢測(cè)片段大小，自動(dòng)化程度高，能夠識(shí)別1～2 個(gè)堿基片段間差異[25]。王瑞[26]、宋偉林[27]、徐雷鋒[28]等在高粱、油菜、百合研究中發(fā)現(xiàn)熒光標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)效率高，結(jié)果精確，更加適用于高通量材料的SSR指紋圖譜構(gòu)建。本研究采用SSR熒光標(biāo)記毛細(xì)管檢測(cè)技術(shù)，獲得的指紋數(shù)據(jù)更加精確，可識(shí)別出差異較小品種間的特異性位點(diǎn)，鑒別能力較強(qiáng)。

SSR引物篩選是構(gòu)建高效SSR指紋圖譜的重要步驟[29]，選用多態(tài)性豐富、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好的引物進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建，可簡(jiǎn)單高效地進(jìn)行品種鑒定，而遵循原則之一就是要利用少數(shù)的標(biāo)記鑒定盡量多的品種，即要求引物的多態(tài)性要高。Lestari等[30]利用30 對(duì)引物對(duì)83 份綠豆品種進(jìn)行分析，平均等位基因數(shù)為2.77，平均PIC為0.33；王麗俠等[31]利用26 對(duì)小豆SSR引物檢測(cè)了國(guó)內(nèi)外60 個(gè)綠豆品種，獲得的等位基因數(shù)從2～7 個(gè)不等，平均為2.9 個(gè)，PIC從0.02～0.69不等，平均為0.36。本研究篩選得到15 對(duì)SSR引物用于指紋圖譜構(gòu)建及品種鑒定，共擴(kuò)增出58 個(gè)等位基因，每對(duì)引物檢測(cè)到2～7 個(gè)不等，平均為3.9；PIC介于0.114 5～0.776 4之間，平均為0.378 4，獲得的PIC均高于前人研究，但與Sangiri等[32]獲得平均等位基因數(shù)為7.3的結(jié)果相比略低，標(biāo)記的等位基因數(shù)與PIC變化趨勢(shì)不一致，這一方面可能與所選用的SSR標(biāo)記數(shù)量有關(guān)，另一方面可能與參試種質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)有關(guān)[33-35]。因此，在篩選構(gòu)建SSR指紋圖譜的核心引物時(shí)，盡可能選取多態(tài)性高且具有物種特異性的引物。

SSR指紋圖譜的終極目標(biāo)是具備特異性和唯一性，然而由于受到研究對(duì)象基因結(jié)構(gòu)、遺傳基礎(chǔ)及所選引物數(shù)量和多態(tài)性水平等因素影響，1 對(duì)引物往往不能實(shí)現(xiàn)完全區(qū)分，因此通常采用引物組合法進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建及品種鑒定。本研究篩選得到15 對(duì)SSR引物，共擴(kuò)增出58 個(gè)條帶，多態(tài)性條帶比率為100%，其中包含特異條帶13 條，占總數(shù)的22.4%。同時(shí)，各引物的品種聚類區(qū)分效率各不相同，選取5 對(duì)鑒別能力較強(qiáng)的引物進(jìn)行組合，區(qū)分率可達(dá)75%。但15 對(duì)引物并不能將所有參試品種全部區(qū)分，區(qū)分率僅為89.68%，其中攖哥豆（C0784）、綠豆（C3807）、綠豆（C3823）和綠豆（C3826）、綠豆（C3837）的指紋圖譜并不具有唯一性，不能完全區(qū)分鑒別，這可能是因?yàn)? 組品種間的遺傳背景相似，DNA水平上的差異較小，15 個(gè)標(biāo)記沒有檢測(cè)到品種間的差異性位點(diǎn)，但不排除“ 同種異名”的情況。因此，當(dāng)參試品種數(shù)量增加或鑒別能力不足時(shí)應(yīng)選擇不同的引物組合或篩選新的核心引物進(jìn)行區(qū)分鑒別，以擴(kuò)充和拓展SSR指紋圖譜，保證其鑒別準(zhǔn)確性。

隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展，SSR指紋圖譜身份證廣泛應(yīng)用，已發(fā)展成為一種種質(zhì)鑒定的重要手段，其在SSR指紋圖譜基礎(chǔ)上將品種的基因型特征數(shù)字化，使每個(gè)品種具有唯一的數(shù)字代碼，更加簡(jiǎn)單明了地進(jìn)行品種區(qū)分鑒定。陸徐忠等[36]利用12 對(duì)SSR引物構(gòu)建了安徽省127 份水稻品種的分子指紋圖譜，并與各品種的基本商品信息相結(jié)合，形成了具有品種特異性的分子身份證和條碼標(biāo)志，為水稻品種的產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供支持；陳亮等[37]利用7 對(duì)SSR引物構(gòu)建了吉林省大豆品種的SSR分子身份證，具有唯一性，完善了大豆品種指紋圖譜身份證技術(shù)體系。本研究利用15 對(duì)SSR引物在48 個(gè)綠豆品種中檢測(cè)到的等位基因構(gòu)建了0/1形式的指紋數(shù)據(jù)庫(kù)，并將其數(shù)字化，形成分子身份證，將品種間DNA水平上的差異具體化、數(shù)字化，具有高度的遺傳穩(wěn)定性及個(gè)體特異性，對(duì)綠豆品種的科學(xué)追溯、快速鑒定和規(guī)范管理具有重要意義。此外，指紋數(shù)據(jù)庫(kù)及分子身份證的構(gòu)建還可為品種親緣關(guān)系分析提供參考。如攖哥豆（C0784）和綠豆（C3832）的分子身份證分別為122323133224232和132323133224332，相似度較高，而二者間的遺傳相似系數(shù)也較大，為0.982 8（文中未體現(xiàn)），表明其遺傳背景相似，親緣關(guān)系較近。

4 結(jié) 論

本研究以遼寧地區(qū)48 份綠豆品種為試材，利用篩選得到的15 對(duì)SSR引物對(duì)其進(jìn)行分析，以擴(kuò)增出的變異位點(diǎn)為依據(jù)進(jìn)行編碼，構(gòu)建了SSR指紋圖譜及分子身份證，數(shù)據(jù)精確、檢測(cè)效率高、鑒別能力強(qiáng)、結(jié)果直觀清晰，為綠豆品種真?zhèn)舞b定、種權(quán)保護(hù)供了有力保障。目前，分子標(biāo)記所擴(kuò)增的序列具體與農(nóng)作物的哪個(gè)性狀相關(guān)聯(lián)尚不清楚[37]，且分子標(biāo)記的數(shù)字化具有局限性，不能反映一個(gè)品種的全部信息[38]，因此在今后的研究中應(yīng)將指紋圖譜與田間觀察的表現(xiàn)型相結(jié)合，同時(shí)增加品種的其他重要商品屬性信息，以不斷完善綠豆品種鑒定技術(shù)體系，使品種的身份信息更加詳細(xì)、準(zhǔn)確，為綠豆優(yōu)良品種保護(hù)、溯源管理等提供理論依據(jù)。

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