韓小東，符兆英，郭姝彤，張正祥

延安大學醫(yī)學院(延安 716000)

·綜述·

核酸適配體篩選方法研究進展*

韓小東，符兆英，郭姝彤，張正祥△

延安大學醫(yī)學院(延安 716000)

*國家自然科學基金資助項目(81760732)

陜西省科學技術(shù)研究發(fā)展計劃項目(2016SF-280)

△通訊作者

指數(shù)富集的配基數(shù)系統(tǒng)進化(SELEX)技術(shù)的基本過程是用化學方法合成一個單鏈寡核苷酸庫，將之于與靶標物質(zhì)混合，寡核苷酸鏈與靶標物質(zhì)結(jié)合形成復合物，去除未結(jié)合的核酸鏈后，再將結(jié)合的核酸分子與靶標物質(zhì)分離，以此寡核苷酸分子為模板進行PCR擴增，用其產(chǎn)物進行下一個循環(huán)的篩選。經(jīng)過數(shù)次循環(huán)，即可得到能與靶標物質(zhì)高親和力高特異性結(jié)合的核酸適配體分子。本文綜述了SELEX技術(shù)篩選核酸適配體技術(shù)的一些研究進展。

自從上世紀90年代L. Gold 和J.W. Szostak創(chuàng)立了用指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)技術(shù)或體外篩選(In vitro selection)技術(shù)制備寡核苷酸適配體(Aptamer)以來，適配體或核酸適配體的研究與應用已經(jīng)成了醫(yī)學、藥學、生物學、化學等多學科廣泛交叉關(guān)注的一個領(lǐng)域[1-3]。核酸適配體領(lǐng)域的快速發(fā)展，離不開適配體篩選方法的不斷進步。在傳統(tǒng)技術(shù)的基礎(chǔ)上，近年來已經(jīng)改良、優(yōu)化或發(fā)展出了多種不同的SELEX篩選技術(shù)和自動化SELEX技術(shù)。本文對核酸適配體篩選方法的進展作一綜述。

1 SELEX基本技術(shù)SELEX技術(shù)首先是構(gòu)建一個隨機的寡核苷酸庫，寡核苷酸鏈的長度為20～40 nt，庫容量為 1014～1015條寡核苷酸鏈；其所包含的各種不同種立體構(gòu)象，幾乎可以與自然界存在的所有種類的靶分子結(jié)合。將隨機寡核苷酸庫與靶分子混合，在一定條件下進行一段時間反應，寡核苷酸鏈即可與相應的靶分子結(jié)合形成復合物，根據(jù)二者之間親和力的不同結(jié)合的牢固程度不同。將未結(jié)合的和結(jié)合不牢固的寡核苷酸鏈洗脫掉，并將寡核苷酸鏈與靶分子分離，把初步篩選富集起來的寡核苷酸鏈用PCR進行擴增并分離純化后，進行下一輪的篩選。如此反復，經(jīng)過數(shù)輪或十多輪的篩選，即可把與靶分子結(jié)合親和力最高的寡核苷酸分子篩選出來。所得到的寡核苷酸文庫要進行測序和克隆，有時需要進行特異性修飾，最后得到的能與靶分子高特異性高親和力結(jié)合的寡核苷酸鏈即是所要篩選的適配體[4-6]。由于SELEX技術(shù)所用的PCR聚合酶的保真度低，每一次的合成產(chǎn)物都會有一些變異體，所以寡核苷酸庫的容量在篩選過程中實際上得到了增加。以上得到的是DNA適配體，如果是制備RNA適配體，則需要把起始的DNA寡核苷酸庫轉(zhuǎn)錄為RNA寡核苷酸庫，再進行篩選。在篩選過程中，需要用RT-PCR法，將每次篩選得的RNA鏈逆轉(zhuǎn)錄成DNA并擴增，然后將擴增所得的DNA再轉(zhuǎn)錄為RNA，再進行下一輪的結(jié)合與篩選[7-8]。

2細胞SELEX技術(shù)細胞SELEX技術(shù)(Cell-SELEX)是用整個細胞(包括細菌、真菌和動物細胞)與寡核苷酸庫作用，篩選出的適配體能與細胞表面分子結(jié)合[9]。用Cell-SELEX篩選到的適配體除了可以用于診斷及實驗研究外，特別是可以用于藥物導向輸送，比如用腫瘤細胞篩選出的適配體與細胞毒性藥物等偶聯(lián)結(jié)合后就可以把藥物導向于腫瘤細胞可用于治療腫瘤。Cell-SELEX技術(shù)的優(yōu)點是省去了靶分子(蛋白)的純化步驟，并保留了細胞表面靶分子的自然構(gòu)象。但是，因為細胞表面含有許許多多的能與寡核苷酸鏈結(jié)合的靶分子，所以需要用一定的方法去除能與非特異的細胞表面分子結(jié)合的寡核苷酸鏈，以獲得所需要的只與自己所需的靶分子結(jié)合的適配體。目前的Cell-SELEX技術(shù)用不表達或低表達自己所需靶分子的細胞進行反篩選或消減篩選，一般是用這些細胞從篩選得到的次級文庫中去除非特異的寡核苷酸鏈[10-12]。

3毛細管電泳SELEX技術(shù)將靶標分子與寡核苷酸鏈結(jié)合形成的復合物與未結(jié)合的寡核苷酸鏈進行分離是SELEX技術(shù)的關(guān)鍵步驟之一。靶標分子與核酸鏈在自由溶液中的相互作用能夠模擬體內(nèi)環(huán)境，也有利于保持二者的天然結(jié)構(gòu)，因此在自由溶液中實現(xiàn)靶標分子與寡核苷酸庫的結(jié)合和分離是一種理想的方法。用毛細管電泳SELEX法可以使靶標分子與寡核苷酸鏈在自由溶液中相互結(jié)合并可使遷移速率有明顯差異的靶標分子與寡核苷酸鏈結(jié)合形成的復合物和游離的寡核苷酸鏈實現(xiàn)分離(復合物的遷移率比游離核酸分子的遷移率慢)，在毛細管出口端可以定時收集靶標分子-寡核苷酸鏈復合物[13]。用毛細管電泳SELEX，只需2～4 輪循環(huán)即可篩選出能結(jié)合大分子靶標分子如蛋白質(zhì)的適配體。毛細管電泳SELEX技術(shù)極大地縮短了SELEX篩選過程、提高了SELEX的篩選效率，用這種技術(shù)，已經(jīng)篩選得到了能結(jié)合多種靶標物質(zhì)的適配體[14-15]。但由于毛細管電泳儀價格昂貴、實驗成本高，所以限制了其大面積使用。

4磁珠SELEX技術(shù)SELEX的篩選方法主要可以分為電泳分離和固相偶聯(lián)兩大類。毛細管電泳技術(shù)屬于電泳分離法；固相偶聯(lián)法主要有磁珠法、硝酸纖維素膜法、親和柱層析法和微流芯片法等，它們的基本原理是將靶標分子共價或非共價結(jié)合于一個固相載體，液相中的寡核苷酸分子通過自由擴散，遇到固相載體表面的相對應的靶標分子即可與其結(jié)合，除去未結(jié)合或結(jié)合弱的寡核苷酸分子，將結(jié)合在靶標分子上的寡核苷酸鏈洗脫/分離后進行PCR擴增和下一輪循環(huán)[16]。磁珠法是比較新和比較常用的一種SELEX篩選方法，該方法的優(yōu)勢在于具有球形的展示面便于靶標物質(zhì)的充分展示，利用磁性進行分離操作簡便快速，能節(jié)省靶分子的用量，此外磁珠分離可用于自動化的篩選。磁珠載體的表面修飾形式種類較多，如鏈霉親和素包被磁珠、氨基修飾磁珠、羧基修飾磁珠、環(huán)氧基活化磁珠和甲苯磺酰基修飾磁珠等[17]。用磁珠SELEX法進行篩選，一般需經(jīng)10輪上下的循環(huán)可得到相應的適配體。

5自動化SELEX技術(shù)Cox等人于2001年首次建立了自動化的SELEX篩選技術(shù)，并篩選得到了溶菌酶的適配體，他們用的自動化工作臺包括機械性操控、PCR熱循環(huán)、磁珠分離、酶冷卻、多屏真空過濾、自動移液等裝置。其SELEX篩選流程都是通過預設(shè)好的程序自動化進行，包括：①用鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)將生物素化的靶蛋白固定于磁珠，②寡核苷酸鏈與靶蛋白分子的特異性結(jié)合，③靶蛋白與寡核苷酸鏈的分離，4RT-PCR 擴增和轉(zhuǎn)錄。最后篩選得到適配體分子被克隆到載體中進行測序和特性鑒定。用這種自動化篩選技術(shù)，在2 d內(nèi)就能完成12輪的篩選[18]。該自動化工作臺的不足之處是需要用純化的蛋白質(zhì)作為靶標，因而限制了其應用。鑒此，他們后來對自動化工作臺做了改進：在體外轉(zhuǎn)錄翻譯合成靶蛋白時，向基因的 5′末端引入T7啟動子和生物素蛋白連接酶的識別序列(標簽)，向基因的 3′末端引入生物素蛋白連接酶基因及T7終止子，轉(zhuǎn)錄后得到兩個順式mRNA，翻譯后得到的目的蛋白含有生物素蛋白連接酶和一個生物素蛋白連接酶識別序列標簽。當加入游離的生物素時，生物素蛋白連接酶和生物素蛋白連接酶識別標簽，將生物素共價結(jié)合到目的蛋白上，便于將靶蛋白固定在鏈霉親和素包被的磁珠上[19]。2005年，Stoltenburg等在以上改進的固定靶分子于磁珠原理的基礎(chǔ)上，增加了熒光標記法，用于DNA定量，進一步發(fā)展了自動化SELEX技術(shù)，能夠快速地篩選不同特性和不同大小的靶標分子[20]。

6微流控SELEX技術(shù)微流控SELEX技術(shù)是將微流控微陣列技術(shù)與SELEX結(jié)合的一種適配體篩選方法，具有高效、快速的特點，分為基于溶膠-凝膠的微流控SELEX和基于磁珠篩選的微流控SELEX?；谌苣z凝膠的微流控SELEX將靶標物質(zhì)包被于由硅酸鹽玻璃制成的溶膠凝膠中，該溶膠凝膠具有納米多孔結(jié)構(gòu)，寡核苷酸分子通過納米多孔結(jié)構(gòu)擴散并與靶標物質(zhì)結(jié)合。有研究人員用基于溶膠凝膠的微流控SELEX，經(jīng)7個循環(huán)的篩選即得到了可結(jié)合小分子靶標黃嘌呤的核酸適配體?；诖胖榈奈⒘骺豐ELEX將靶標物質(zhì)固定于磁珠微球，接下來用微流體微陣列，比如MMS微陣列進行篩選富集。MMS微陣列系統(tǒng)應用了能夠被外部磁體磁化的鐵磁材料制作的微通道，使分離效率得到了提高，解決了此前的微陣列有可能出現(xiàn)的微陣列通道內(nèi)部微氣泡導致的流體扭曲問題和磁珠在微通道內(nèi)的堆集問題。MMS微陣列經(jīng)改良增加了正篩選和負篩選單元后，經(jīng)7個循環(huán)的篩選，得到了可結(jié)合肌紅蛋白的核酸適配體。將MMS微陣列系統(tǒng)進行改良，增加競爭性微陣列以檢測寡核苷酸和靶標物質(zhì)結(jié)合的特異性和親和力，篩選獲得了可結(jié)合胎兒甲種蛋白的核酸適配體。將SELEX篩選程序中寡核苷酸與靶標物質(zhì)的結(jié)合、分離和DNA擴增整合于一個微陣列，能明顯提高篩選效率，每次篩選循環(huán)僅需1 h左右的時間[21-23]。

7高通量SELEX技術(shù)傳統(tǒng)的SELEX篩選，有可能使一些具有高親和力的寡核苷酸序列被丟失。由于每次循環(huán)是依賴于PCR擴增次級文庫，因PCR存在的偏好性或優(yōu)勢擴增特性，會使初始文庫中親和力很高但頻次低的寡核苷酸序列隨篩選而丟失，所以最后得到的序列不一定就是具有最高親和能力的序列。利用高通量測序技術(shù)對每一輪的篩選結(jié)果進行高通量的序列測定與分析，能夠?qū)崿F(xiàn)對篩選富集過程的全程監(jiān)測，這不僅僅可以及時地調(diào)整篩選壓力以提高篩選的效率和減少篩選的盲目性，同時還可以更進一步地解析核酸適配體的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系[23-24]。有研究人員利用微流控SELEX篩選血小板衍生生長因子的適配體，在篩選時引入了高通量測序技術(shù)，經(jīng)3輪篩選即得到了解離常數(shù)小于3 nMol的核酸適配體。與傳統(tǒng) SELEX相比，所得適配體的親和力提高了3～8倍、特異性提高了2～4倍。還有研究人員結(jié)合表面等離子共振和微流體芯片做X盒結(jié)合蛋白1(XBP-1)適配體的高通量篩選，用表面等離子共振裝置對每一輪篩選的結(jié)果進行親和力測定，經(jīng)過4 輪篩選后，觀測到了表面等離子信號的明顯改變，經(jīng)6輪篩選后得到了解離常數(shù)為8 nMol的靶向XBP-1的核酸適配體[25]。

8高保真SELEX技術(shù)高保真SELEX技術(shù)于2015年首次建立，該技術(shù)具有以下特點：1傳統(tǒng)的SELEX技術(shù)有一缺陷是兩端的固定序列會對寡核苷酸鏈的空間折疊產(chǎn)生影響而降低起始文庫的多樣性，高保真SELEX技術(shù)在起始文庫中使用了一種封閉元件(與寡核苷酸鏈兩端的固定序列互補的序列)，從而增加了起始文庫的多樣性。2高保真SELEX技術(shù)將靶標物質(zhì)固定在涂有吸附鈍化的聚乙二醇和表面活性劑的微量滴定板上，這一操作不僅能顯著地減少非特異性結(jié)合、增加靶標物質(zhì)與寡核苷酸鏈結(jié)合的特異性，還可以在寡核苷酸鏈和鄰近靶標物質(zhì)之間起一個橋接作用。3DNA擴增時使用數(shù)字聚合酶鏈反應，從而使擴增更具特異性并能實現(xiàn)絕對定量。有研究人員用這種新的高保真SELEX技術(shù)，篩選了凝血酶α、人凝血因子IXa、人因子凝血X和補體D因子的核酸適配體，經(jīng)過3輪篩選后，就得到了與靶分子結(jié)合的親和力(解離常數(shù))達到納摩爾級水平的核酸適配體[26]。

9小結(jié)SELEX技術(shù)自從建立至今已經(jīng)歷經(jīng)20多年的發(fā)展歷程，期間篩選方式出現(xiàn)了多樣化，篩選結(jié)果得到了快速化，并出現(xiàn)了自動化的篩選。SELEX的靶標物質(zhì)也從金屬離子、有機小分子、小分子藥物、核酸和蛋白質(zhì)等，拓展到了細胞和組織等復雜靶標。但目前尚未建立可針對任意靶標的SELEX技術(shù)，也沒有建立起一個標準化的篩選流程，此外，SELEX 篩選也不能保證必能得到所想得到的適配體。SELEX篩選的成功受眾多因素的制約，如寡核苷酸文庫的設(shè)計、篩選技術(shù)的選擇尤其是分離技術(shù)的針對性、靶分子的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)、篩選緩沖液及其離子種類等均影響篩選效果。發(fā)展篩選效率更高和針對的靶標更為普遍的篩選手段是SELEX技術(shù)今后需要致力研究的方向。

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(收稿：2017-11-20)

@指數(shù)富集的配基數(shù)系統(tǒng)進化 @核酸適配體 寡核苷酸類 篩選

R392.1

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2018.03.043