邵妍麗，任軍輝，德 央

(1.西藏職業(yè)技術(shù)學(xué)院；2.西藏自治區(qū)羅布林卡管理處，拉薩 850000)

木本植物在生態(tài)、經(jīng)濟(jì)、社會(huì)等領(lǐng)域中發(fā)揮著重要的作用，隨著對(duì)木本植物需求量的迅速增加，離體培養(yǎng)作為一種重要的快速繁殖技術(shù)在木本植物的繁殖過程中得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用[1]，但在離體培養(yǎng)過程中成熟效應(yīng)會(huì)對(duì)植物體造成很多不良影響，如植物體內(nèi)細(xì)胞、組織、器官等幼態(tài)特征部分或完全消失[2-4]，植物體迅速的衰老死亡等，嚴(yán)重影響了木本植物離體培養(yǎng)的繁殖效率[5]；但通過一些特定的形態(tài)學(xué)、生理生化標(biāo)記及分子生物學(xué)等研究方法的應(yīng)用可以找到木本植物成熟效應(yīng)發(fā)生的原因，加之目前通過在離體培養(yǎng)過程中的條件控制，為下一步克服成熟效應(yīng)找到更為有效的方法。

1 離體培養(yǎng)過程中各類研究方法的應(yīng)用

1.1 形態(tài)學(xué)研究

為了使成熟材料的復(fù)幼有一個(gè)統(tǒng)一明確的質(zhì)量及數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)，通過形態(tài)學(xué)標(biāo)記是一個(gè)最直觀方法。在最近幾十年，很多學(xué)者就通過芽的萌發(fā)率、增殖率、生根率來(lái)比較成齡樹和幼齡樹的離體培養(yǎng)時(shí)的生理成熟程度，結(jié)果表明萌發(fā)率、增殖率、生根率各項(xiàng)指標(biāo)均較低的成齡樹的生理成熟程度較高，后期在器官分化的過程中分化能力較差[6]。

黃發(fā)新等[7]選取10株20 a生杉木上部枝條與樹干基部新萌生枝條進(jìn)行離體培養(yǎng)，分別以芽分化數(shù)量、嫩梢數(shù)量、嫩梢長(zhǎng)度、生根率、根長(zhǎng)等作為形態(tài)標(biāo)記，結(jié)果發(fā)現(xiàn)成年樹樹干基部新萌生枝條在經(jīng)過離體培養(yǎng)后對(duì)杉木有明顯的復(fù)壯作用。董勝君等[8]對(duì)山杏的離體培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，隨著取材母樹樹齡從10 a、4 a、1 a的不斷降低，其組培苗的株高、葉長(zhǎng)、葉寬、根系數(shù)量及根系長(zhǎng)度的指標(biāo)值依次升高。張世紅等[9]在毛白楊離體培養(yǎng)成熟效應(yīng)的研究結(jié)果中表明，成年毛白楊由上部、中部、下部、直到基部的頂芽，隨著幼化程度的不斷加深，其在分化系數(shù)和生長(zhǎng)量?jī)身?xiàng)指標(biāo)的數(shù)值呈上升趨勢(shì)。Lyrene[10]選擇了以芽直徑及葉形態(tài)作為櫟屬植物的形態(tài)標(biāo)記。Arnauld等[11]將成齡再生植株芽的正向或斜向生長(zhǎng)作為一種形態(tài)學(xué)標(biāo)記。Hess[12]將生根能力作為一些木本植物幼齡材料的形態(tài)標(biāo)記。Mcgowrna等[13]通過歐洲栓皮櫟和紅櫟的成齡及幼齡材料的離體培養(yǎng)，確定出一系列的形態(tài)學(xué)標(biāo)記，包括增殖莖芽與水平面角度、每個(gè)莖芽增殖的綠葉數(shù)、葉面積、增殖莖芽總數(shù)、每個(gè)外植體增殖莖芽數(shù)、增殖莖芽上部直徑、增殖莖芽中部直徑、增殖莖芽下部直徑等，并通過建立一個(gè)統(tǒng)一的數(shù)學(xué)模型為櫟屬植物的形態(tài)學(xué)標(biāo)記提供量化依據(jù)。

1.2 生理及生化研究

同工酶是一種十分有效的生理生化標(biāo)記，可以將酯酶和過氧化物酶(POD)等標(biāo)記離體培養(yǎng)時(shí)材料的成熟度[14]。在成熟材料的組織培養(yǎng)復(fù)幼過程中，與成熟度相關(guān)的酯酶和過氧化物酶并不能被檢測(cè)到，但是在新萌出的莖芽中這些酶被證實(shí)具有活性，相比之下，在櫟屬植物誘導(dǎo)生根的早期，過氧化物酶是不能作為生化標(biāo)記的；確切的說(shuō)，成齡和幼齡材料不同的生根能力證明生根過程與總的過氧化物酶活有關(guān)而與特定的過氧化物酶的活性的變化無(wú)關(guān)[15]。Fernandez等[16,17]對(duì)歐洲栓皮櫟不同成熟度繁殖材料的離體培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，多酚類物質(zhì)也可以作為櫟屬植物莖段離體培養(yǎng)時(shí)繁殖材料成熟程度的生化標(biāo)記。成齡和幼齡材料生根過程中多酚類物質(zhì)含量的不同是由于外植體內(nèi)單寧、黃酮醇等物質(zhì)含量的差異造成的，這同時(shí)也表明兩種材料在生根能力方面有差異。譚建暉等[18]通過測(cè)定桉樹離體培養(yǎng)后的葉綠素、可溶性蛋白、MDA(丙二醛)、PRO(游離脯氨酸)的各物質(zhì)含量及POD(過氧化物酶)、CAT(過氧化氫酶)、SOD(超氧化物歧化酶)活性，指出離體培養(yǎng)1代的抗衰能力最強(qiáng)，而8代、15代、28代的抗衰退能力相對(duì)較弱。

可溶性糖的含量變化可以在一些樹木的體細(xì)胞胚胎發(fā)生的成熟過程中被檢測(cè)出來(lái)，在云杉體細(xì)胞胚成熟的過程中，LiparskaH等指出，在體胚成熟過程中的可溶性糖在體細(xì)胞胚成熟的過程中,體胚細(xì)胞內(nèi)部的可溶性含量整體上呈現(xiàn)緩慢減少的趨勢(shì),其中蔗糖和其他糖類的比例發(fā)生明顯改變,特別是發(fā)育到后期時(shí),葡萄糖含量幾乎已經(jīng)不存在,蔗糖和果糖雖然能被檢測(cè)到,但是果糖含量較低[19]。李冬梅[20]在對(duì)龍眼的體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究中發(fā)現(xiàn)，在高濃度蔗糖及黑暗條件下，隨著體胚的成熟葡萄糖和果糖的含量先增加后減少再增加，呈“雙峰”變化趨勢(shì)。但可溶性糖類是否可以作為體胚發(fā)生過程中一種成熟效應(yīng)的生理生化標(biāo)記還未見報(bào)道。

采用生理、生化標(biāo)記可以在離體培養(yǎng)時(shí)的形態(tài)變化前，在細(xì)胞水平上反應(yīng)外植體的變化，從而確定外植體的成熟狀態(tài)。Istv＇an Kir＇aly1等[21]對(duì)歐洲白櫟離體培養(yǎng)生根過程光合作用的研究中指出，不同成熟度的外植體在生根時(shí)添加激素方式的不同，植株CO2的固定效率是不同的。Vidal等[22]研究歐洲白櫟不同成熟度的繁殖材料生根時(shí)，通過添加不同激素促生根，在細(xì)胞學(xué)水平觀察發(fā)現(xiàn)，幼齡材料會(huì)在生根時(shí)細(xì)胞發(fā)生分生化，而成齡材料并未發(fā)生此類現(xiàn)象。

1.3 基因表達(dá)及調(diào)控研究

大量研究表明，植物體的生理衰老是一個(gè)高度程序化的過程[23]。李坤霞[24]對(duì)毛白楊成熟材料的組織培養(yǎng)復(fù)幼，通過在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)mRNA差異顯示的重復(fù)對(duì)比試驗(yàn)，并結(jié)合分子雜交，對(duì)樹冠部453bp的cDNA片段的鑒定發(fā)現(xiàn)，成熟效應(yīng)可能與其有關(guān)。同時(shí)序列分析結(jié)果表明，該片段與茶樹的NADHI和NADHV有較低的同源性，僅有32個(gè)堿基同源，它可能是一個(gè)新基因，但其編碼的氨基酸的序列及其功能尚不清楚。目前其他木本植物離體培養(yǎng)的成熟效應(yīng)與基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)系還未見報(bào)道。

2 木本植物離體培養(yǎng)過程中減少成熟效應(yīng)發(fā)生的方法

2.1 采用幼齡材料進(jìn)行離體培養(yǎng)

植物的營(yíng)養(yǎng)繁殖能力與幼態(tài)因素相關(guān)。一般材料愈年幼營(yíng)養(yǎng)繁殖就愈容易，幼態(tài)組織比老態(tài)組織具有較高的形態(tài)發(fā)生能力。由于成齡材料的擴(kuò)繁很難成功，許多樹種最先通過胚或幼齡材料為外植體。馮金玲等[25]學(xué)者在對(duì)木本植物錐栗進(jìn)行研究時(shí),選取胚、葉片、腋芽、韌皮部、莖段作為外植體,結(jié)果發(fā)現(xiàn)胚與其他外植體相比最容易消毒,其不定芽誘導(dǎo)率也是最高的,誘導(dǎo)效果最佳, 這是由于幼年態(tài)的它們?nèi)菀追只霸俜只?。葉片的取材部位對(duì)木本植物組織培養(yǎng)的成敗與否影響也很大,但通常來(lái)說(shuō)都是越幼嫩的葉片越容易分化,越靠近葉片中脈處的組織越易形成愈傷沮織。趙政陽(yáng)等[26]在對(duì)蘋果(Maluspumila)葉片離體培養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn),當(dāng)年抽枝的新梢頂端處剛展開的幼葉最易分化,其再生能力最強(qiáng),同時(shí)葉片的中部靠近葉脈出的部分葉片比頂部或基部更易于再生.

在芽和莖段的培養(yǎng)中，最早都是以幼齡材料為外植體進(jìn)行植物器官培養(yǎng)的研究。直到1987 年，法國(guó)科學(xué)家 J.M.Favre 和 B.Juncker[27]以 1～7月生的歐洲白櫟實(shí)生幼苗和成年樹(150 a生)萌條扦插的莖段作為外植體，研究得出未木質(zhì)化的嫩枝對(duì)芽的萌發(fā)效果最好。這是以成齡材料為最初外植體進(jìn)行器官培養(yǎng)探索的開端，在此之后，Manzanera和 Pardos[28]相繼進(jìn)行了成齡樹離體培養(yǎng)的研究。他們的研究結(jié)果表明：來(lái)自成齡樹的材料與幼齡材料相比較，芽的萌發(fā)率、增殖率、生根率均較差。成齡樹的生理成熟度較高，即便是成齡樹的嫩枝也比一年生的實(shí)生苗的半木質(zhì)化枝的器官分化能力弱。同時(shí)，他們?cè)趯?shí)驗(yàn)中通過對(duì)成齡材料的反幼處理，如修剪、誘導(dǎo)根萌條、室內(nèi)培養(yǎng)等一系列前期管理措施，以及對(duì)插條噴施 BA 獲得幼化材料等方法來(lái)降低櫟屬植物的生理成熟度，能夠有效地提高成齡材料的增殖率和生根率。李芳東等[29]通過對(duì)白花泡桐優(yōu)樹組織培養(yǎng)幼化過程中發(fā)現(xiàn)，優(yōu)樹嫁接新萌發(fā)的嫩芽、優(yōu)樹成熟枝條水培嫩芽和優(yōu)樹成熟枝條休眠芽在萌發(fā)率和生長(zhǎng)狀況方面，作為幼齡材料的優(yōu)樹嫁接新萌發(fā)嫩芽組培幼化的效果最好。

2.2 不同培養(yǎng)基配方對(duì)繁殖材料的影響

基本培養(yǎng)基種類不同會(huì)對(duì)不同植物體的離體培養(yǎng)復(fù)幼產(chǎn)生影響。黃健秋等[30-31]對(duì)云南松成熟胚的體胚發(fā)生的研究中指出，改良的P6培養(yǎng)基對(duì)成熟合子胚的發(fā)生有很強(qiáng)的促進(jìn)作用，DCR培養(yǎng)基及MS培養(yǎng)基并不適合，但DCR培養(yǎng)基可以作為馬尾松成熟胚的發(fā)生的最適培養(yǎng)基。劉淑蘭等[32]選擇核桃(Juglansregia)的葉片、葉柄切段、節(jié)間、葉脈、莖尖、胚、子葉為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)，基本培養(yǎng)基采用MS、WPM、K、B6、White，雖然所有種類的外植體都能產(chǎn)生愈傷組織，但經(jīng)過篩選，僅在MS和WPM上莖尖和胚能分化出多芽。

培養(yǎng)基中不同營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)成熟效應(yīng)也有一定的控制作用。闕國(guó)寧等[33]在杉木的組培復(fù)壯過程分析中發(fā)現(xiàn)，在MS基本培養(yǎng)基中添加BA和IBA，從1年生母樹上采集的莖段經(jīng)離體培養(yǎng)后，產(chǎn)生的嫩梢數(shù)量均高于從5年生、10年生的母樹上采集的莖段。 Franclet 等[34]在對(duì)花旗松離體培養(yǎng)的復(fù)壯過程研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞分裂素類物質(zhì)(主要是BA)對(duì)外植體的刺激能夠促進(jìn)其組織幼化，但培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)出現(xiàn)玻璃化或枯死的現(xiàn)象。Manzanera等[28]同時(shí)通過對(duì)歐洲栓皮櫟不同基因型的幼齡(3個(gè)月實(shí)生苗莖段)及成齡材料(30、110 a生成齡母株莖段)的增殖培養(yǎng)方式，包括培養(yǎng)基種類、激素配比、培養(yǎng)時(shí)間等，生根培養(yǎng)的最佳激素組合及濃度配比等的研究指出，成齡材料可以通過離體培養(yǎng)添加BA來(lái)達(dá)到復(fù)幼的目的；Favre J M等[27]在歐洲白櫟的離體培養(yǎng)研究中，選擇一年生實(shí)生苗及150 a生成齡母株的成熟材料進(jìn)行離體培養(yǎng)，在含有木炭的培養(yǎng)基中，幼齡材料出現(xiàn)了階段性的生長(zhǎng)，生根正常，但產(chǎn)生葉數(shù)卻明顯減少，而成齡材料則全部死亡；采用含有較低濃度的BA培養(yǎng)基后，幼齡材料的階段性生長(zhǎng)消失，但未生根，成齡材料則生長(zhǎng)良好；同時(shí)Favre J M等在成齡及幼齡的離體培養(yǎng)研究也發(fā)現(xiàn)，低鹽濃度的培養(yǎng)基，如SH，有利于離體培養(yǎng)的進(jìn)行，BA對(duì)增殖培養(yǎng)的進(jìn)行是必須的，添加低濃度的NAA可以提高增殖效率，特別是對(duì)成齡材料，激素的種類是生根的最重要因素，添加低濃度的IBA對(duì)生根效果最好，同時(shí)較高濃度的蔗糖有助于生根。

2.3 利用合適培養(yǎng)方式降低成熟效應(yīng)

培養(yǎng)方式的不同會(huì)對(duì)成熟效應(yīng)的發(fā)生以及持續(xù)的時(shí)間產(chǎn)生一定的影響。Bonga J M等[35]將取自500 a生北美紅杉的外植體在高濃度BAP的培養(yǎng)基上經(jīng)反復(fù)繼代培養(yǎng)復(fù)壯后可以誘導(dǎo)出組培苗，張世紅等[9]通過對(duì)毛白楊的組培苗進(jìn)行多次繼代，也發(fā)現(xiàn)隨著繼代次數(shù)的增加，組培苗生長(zhǎng)不斷加快，株高有所增加，成熟組織被進(jìn)一步幼化。Vieitez等[36]研究歐洲白櫟成齡繁殖材料的離體培養(yǎng)時(shí)指出，當(dāng)繁殖材料垂直放置在培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)時(shí)，隨著增殖次數(shù)的增加增殖能力會(huì)下降，但是水平放置的繁殖材料增殖能力會(huì)得到加強(qiáng)，并且增殖周期也會(huì)相應(yīng)縮短，同時(shí)指出，生根能力與外植體本身的基因型有關(guān)，但是在生根培養(yǎng)前的5 d進(jìn)行暗培養(yǎng)，可以有效提高生根能力。

在盡可能采用外植體小型化的同時(shí)盡量減少傷害脅迫(外植體增大受損傷程度會(huì)導(dǎo)致幼態(tài)程度下降)，有利于其器官發(fā)生。Franclet[34]在研究花旗松、北美紅杉和胡桃等離體培養(yǎng)時(shí)外植體小型化過程中發(fā)現(xiàn)，小型化的處理能夠促進(jìn)外植體的復(fù)壯。Monteuuies[37]在誘導(dǎo)100 a生巨杉離體培養(yǎng)復(fù)幼中也發(fā)現(xiàn)，樹體萌芽前后取材足夠小是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。

3 展望

目前對(duì)于木本植物離體培養(yǎng)的成熟效應(yīng)的控制僅僅是通過一些培養(yǎng)條件的控制，并未從成熟效應(yīng)的發(fā)生機(jī)理上給予有效的控制，在今后的研究中，可以根據(jù)與衰老相關(guān)的各種氧化酶、各類生理活性物質(zhì)的變化研究減少成熟效應(yīng)途徑，特別是對(duì)于成熟效應(yīng)的基因表達(dá)方面，可以通過特定基因的表達(dá)調(diào)控克服成熟效應(yīng)的發(fā)生。