蔡 漢，劉艷紅，殷婷婕，周建平，霍美蓉

(中國(guó)藥科大學(xué)天然藥物活性組分與藥效國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009)

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程。早在1889年，科學(xué)家就針對(duì)腫瘤提出了“種子與土壤”假說(shuō)[1]，即腫瘤與腫瘤微環(huán)境是一個(gè)不可分割的整體，腫瘤細(xì)胞作為種子，其增殖、侵襲、黏附、血管生成以及抗放化療都依賴(lài)于腫瘤微環(huán)境這個(gè)土壤環(huán)境。此前，人們對(duì)于腫瘤的治療一般將思路局限于腫瘤細(xì)胞本身，利用抗腫瘤藥物和靶向制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷。然而，近年來(lái)越來(lái)越多的科學(xué)家開(kāi)始將治療策略逐步關(guān)注到腫瘤微環(huán)境上，旨在調(diào)控腫瘤細(xì)胞的土壤環(huán)境，同時(shí)輔以腫瘤細(xì)胞靶向治療，形成腫瘤深入治療的新策略[2]。

腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(tumor-associated fibroblasts,TAFs)是腫瘤微環(huán)境眾多細(xì)胞中的主成分，系由正常成纖維細(xì)胞受到腫瘤細(xì)胞分泌的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β[3-4](transforming growth factor，TGF-β)、血小板衍生因子(PDGF)[5-6]等生長(zhǎng)因子的招募和激活作用分化而成[7]。與靜息狀態(tài)的正常成纖維細(xì)胞相比，TAFs在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能蛋白表達(dá)等方面均發(fā)生了顯著的變化。在形態(tài)學(xué)上，TAFs呈現(xiàn)梭形、體積較大，胞質(zhì)中存在多種收縮細(xì)絲和張力纖維絲，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富[3]；在功能蛋白表達(dá)方面，TAFs表面高表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和波形蛋白(vimentin)[4]。其形態(tài)學(xué)特征和蛋白表達(dá)方面的差異性成為T(mén)AFs鑒別的重要依據(jù)。

作為腫瘤微環(huán)境的主要基質(zhì)細(xì)胞，TAFs主要分布于腫瘤侵襲的前沿或腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的周?chē)?圖1)，與腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞保持相互作用，進(jìn)而在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起著重要的調(diào)控作用。近年來(lái)，已有大量研究報(bào)道對(duì)TAFs與腫瘤之間的作用關(guān)系進(jìn)行了闡明，為以TAFs作為腫瘤治療的新靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)[8-9]。其作用機(jī)制主要包括：(1)細(xì)胞-細(xì)胞直接接觸途徑TAFs可與其臨近的腫瘤細(xì)胞直接接觸，促使腫瘤自原發(fā)部位向遠(yuǎn)端進(jìn)行轉(zhuǎn)移。有研究表明[10]將TAFs與乳腺癌細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí)，兩者通過(guò)直接接觸激活RANKL/OPG信號(hào)，使乳腺癌的轉(zhuǎn)移明顯加快。(2)旁分泌途徑TAFs可以分泌多重可溶性的細(xì)胞因子，主要包括趨化因子配體12(CXCL12)[11-12]，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)[13-14]和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)[15-16]，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。(3)免疫調(diào)控途徑TAFs通過(guò)抑制免疫細(xì)胞的募集及分泌免疫抑制相關(guān)因子從而促進(jìn)腫瘤逃避的免疫應(yīng)答[17]。(4)胞外基質(zhì)(ECM)重塑途徑TAFs通過(guò)分泌各種基質(zhì)酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)或成纖維細(xì)胞活化蛋白(FAP)等，主要參與ECM的重建和產(chǎn)生致密的胞外基質(zhì)[18]。

基于以上機(jī)制的研究基礎(chǔ)，研究者從腫瘤微環(huán)境的調(diào)控角度出發(fā)，構(gòu)建靶向TAFs的藥物制劑，旨在破壞TAFs的活性或擾亂其功能，打破腫瘤細(xì)胞賴(lài)以生存的微環(huán)境平衡，弱化TAFs與腫瘤細(xì)胞之間構(gòu)建的聯(lián)系，削弱TAFs對(duì)腫瘤細(xì)胞的促生長(zhǎng)和遷移作用。此外，可有效降低TAFs生成的致密的胞外基質(zhì)密度，可能加強(qiáng)藥物制劑對(duì)腫瘤組織的深層遞送，更高效地達(dá)到遏制腫瘤發(fā)生發(fā)展的目的。本文將對(duì)靶向TAFs的腫瘤治療策略作一綜述，并對(duì)該領(lǐng)域的發(fā)展前景進(jìn)行展望。

Figure1 Distribution characteristics of tumor-associated fibroblasts(TAFs)in the tumor microenvironment

1 酶激活式前體藥物治療策略

酶激活式前藥系統(tǒng)由前藥和相應(yīng)的靶向酶組成，其主要策略是將細(xì)胞毒性藥物與酶特異性底物偶聯(lián)，屏蔽其活性基團(tuán)，從而形成暫時(shí)無(wú)活性的前體藥物。前體藥物進(jìn)入體內(nèi)后，以非活化形式輸送至靶部位，繼而利用靶部位的選擇性激活機(jī)制使活性藥物得以釋放。鑒于FAPα特異性高表達(dá)于90%的TAFs表面，又兼具二肽酶和膠原酶的活性，能特異性裂解N-末端被封閉且第2位氨基酸由脯氨酸和其他氨基酸或小分子形成的肽鍵(Pro-X)，而體內(nèi)正常組織中所廣泛存在的二肽基肽酶Ⅳ(DPP-Ⅳ)則無(wú)此活性[19-20]。因此，F(xiàn)APα可作為靶向酶,設(shè)計(jì)能夠被其特異性激活的前體藥物，該前體藥物能夠被TAFs靶向性激活從而釋放出治療藥物并對(duì)TAFs進(jìn)行殺傷。

Huang等[21]將FAPα特異性裂解的二肽(Z-Gly-Pro)與細(xì)胞毒性藥物阿霉素(DOX)偶聯(lián)構(gòu)成FAPα特異性激活的前體藥物，使之能有效靶向到TAFs并被FAPα特異性激活，Z-Gly-Pro斷裂進(jìn)而釋放DOX殺傷TAFs。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)該前藥在體外高質(zhì)量濃度(5 μg/mL)FAPα的作用下，24 h便能有效釋放85.36%的DOX。為進(jìn)一步考察該前藥在腫瘤組織中的激活情況，將其與高表達(dá)FAPα的小鼠乳腺癌(4T1)腫瘤組織勻漿孵育，4 h即釋放50%的DOX，12 h時(shí)DOX已釋放完全；然而在血漿、心、肝等組織勻漿中，檢測(cè)不到游離DOX的存在，表明該前體藥物在高表達(dá)FAPα腫瘤中釋放，而在正常組織中可穩(wěn)定存在，幾乎不被激活。

除了以Z-Gly-Pro為骨架制備FAPα激活式前藥外，還有多種FAPα特異性裂解的多肽可以作為酶激活式前體藥物的骨架。Brennen等[22]以3種FAPα特異性裂解肽(μASGPAGPA、μDSGETGP、μERGETGP)為基本骨架，將其與細(xì)胞毒性藥物毒胡蘿卜素(TG)偶聯(lián)成功構(gòu)建成了3種酶激活式前體藥物(μASGPAGPA-A12ADT、μDSGETGP-A12ADT、μERGETGP-S12ADT)。乳腺癌(MCF-7)細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這3種前體藥物體外抗腫瘤效果顯著，其IC50分別為3.42、3.18和3.13 nmol/L。通過(guò)免疫熒光標(biāo)記法定量分析給藥后裸鼠乳腺癌移植瘤的TAFs數(shù)量，數(shù)據(jù)結(jié)果表明，3種酶激活式前體藥物均能降低腫瘤組織70%以上的TAFs。由于TAFs數(shù)量的減少，腫瘤細(xì)胞的增殖受到影響，3種酶激活式前體藥物在體內(nèi)具有顯著的抗腫瘤活性。同理，Lebeau等[23]將一個(gè)由26個(gè)氨基酸組成的蜂毒肽與FAPα特異性裂解肽偶聯(lián)合成了一類(lèi)前體蛋白毒素。該前體蛋白毒素可被FAPα選擇性激活，釋放蜂毒前導(dǎo)肽殺傷TAFs。裸鼠體內(nèi)藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，相較于不含F(xiàn)APα特異性裂解肽的制劑，瘤內(nèi)注射FAPα激活式前體蛋白毒素能顯著抑制人乳腺癌和前列腺癌移植瘤的生長(zhǎng)。

為進(jìn)一步提高FAPα酶激活式前藥的抗腫瘤效率，最新一篇研究報(bào)道稱(chēng)[24]以FAPα裂解肽(Thr-Ser-Gly-Pro)為連接臂，將光敏分子鋅酞菁(ZnPc)與抗腫瘤藥物DOX共同偶聯(lián)至連接臂上得到一種FAPα激活式前藥，以期發(fā)揮光動(dòng)力學(xué)療法與化療的協(xié)同抗腫瘤作用。該前藥在生理環(huán)境下，鋅酞菁的光敏活性和DOX的細(xì)胞毒性均受到抑制，表現(xiàn)出較低的抗腫瘤活性。而通過(guò)外界合適的光線照射和FAPα的激活作用，連接臂斷裂進(jìn)而觸發(fā)光敏劑鋅酞菁和DOX的同時(shí)釋放，鋅酞菁產(chǎn)生的活性氧簇(ROS)和DOX的細(xì)胞毒性作用均能顯著誘導(dǎo)TAFs發(fā)生凋亡，兩者聯(lián)合使用能有效殺傷TAFs，去除腫瘤細(xì)胞賴(lài)以生存的“土壤條件”進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，其抗腫瘤效果優(yōu)于酶激活式單一化療前體藥物的治療。

綜上所述，利用TAFs自身特異性高表達(dá)的FAPα來(lái)激活前體藥物，導(dǎo)致連接臂斷裂，藥物快速釋放，使藥物能夠有針對(duì)性地殺死腫瘤微環(huán)境細(xì)胞中的TAFs，消除腫瘤細(xì)胞賴(lài)以生存的“土壤環(huán)境”，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖以達(dá)到抗腫瘤的目的。

2 納米載體靶向TAFs治療策略

酶激活式前體藥物除了構(gòu)建能特異性識(shí)別TAFs表面受體的連接臂外，對(duì)治療劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)及偶聯(lián)量皆具有特殊的要求。相較于酶激活式前藥，納米載體具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、載藥量高、表面易于功能化等優(yōu)勢(shì)，在抗腫瘤藥物遞送領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。目前，靶向TAFs的納米載體的構(gòu)建主要基于“被動(dòng)靶向”和“主動(dòng)靶向”兩種設(shè)計(jì)思路。被動(dòng)靶向通常是利用腫瘤血管的高通透性和高滯留效應(yīng)(enhanced permeability and retention,EPR)，使得具有一定尺度的納米載體(10～200 nm)經(jīng)靜脈注射后透過(guò)腫瘤血管壁，脫靶分布至靠近腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的TAFs；主動(dòng)靶向則是利用受體與配體或抗原與抗體間的相互識(shí)別作用將納米載體主動(dòng)靶向至TAFs，從而實(shí)現(xiàn)納米載體在TAFs中的特異性蓄積[25]。

2.1 被動(dòng)靶向至TAFs

研究人員將多烯紫杉醇和聚乙二醇分子通過(guò)酯鍵共價(jià)偶聯(lián)至羧甲基纖維素骨架上，進(jìn)而自組裝形成粒徑約為120 nm的納米粒，該粒子通過(guò)EPR效應(yīng)透過(guò)腫瘤血管壁后，脫靶分布于TAFs[26-27]。在原位鼠乳腺癌腫瘤(4T1)和原位人乳腺癌腫瘤(MDA-MB-231)模型中，通過(guò)免疫熒光標(biāo)記對(duì)TAFs的標(biāo)志物α-SMA進(jìn)行染色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該納米粒能分別減少82%和70%的TAFs表達(dá)量，而游離的多烯紫杉醇對(duì)TAFs表達(dá)量幾乎沒(méi)有作用。此外，研究結(jié)果也證實(shí)該納米制劑通過(guò)殺傷TAFs，下調(diào)了TAFs所分泌的膠原蛋白的表達(dá)，改善了腫瘤通透性，利于治療劑向腫瘤內(nèi)部的深層次遞送，使得多烯紫杉醇的抑瘤率高達(dá)70%。納米載體亦可將兩種或兩種以上的藥物靶向遞送到腫瘤部位，通過(guò)其脫靶分布?xì)⑺繲AFs并發(fā)揮其協(xié)同殺傷腫瘤作用。Guo等[28]將化療增敏劑雷帕霉素和抗腫瘤藥物順鉑共同包載于聚乙二醇-聚乳酸羥基乙酸(PEG-PLGA)膠束的疏水內(nèi)核，該共載納米膠束粒徑約為50 nm且分布均一，靜脈注射后脫靶分布于TAFs，通過(guò)殺死TAFs，兩藥共遞送能抑制腫瘤組織80%的膠原表達(dá)，而單順鉑僅能減少約50%的膠原成分，聯(lián)合用藥后的腫瘤通透性顯著增加，藥物得以向腫瘤內(nèi)部進(jìn)行深度遞送，抗腫瘤效果顯著提高。

鑒于TAFs在腫瘤分布位置的優(yōu)越性，即靠近腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，且具有旁分泌功能[29]，可分泌多種細(xì)胞因子及蛋白進(jìn)入腫瘤微環(huán)境中，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，侵襲和轉(zhuǎn)移起著重要的調(diào)控作用。Miao等[30]利用TAFs的上述兩種特點(diǎn)，將分泌型腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(sTRAIL)DNA與帶正電的魚(yú)精蛋白通過(guò)靜電作用壓縮形成納米粒，并將該納米粒包載在脂質(zhì)體中，其體內(nèi)過(guò)程如圖2所示，該載體通過(guò)脫靶效應(yīng)被TAFs所攝取，(sTRAIL)DNA在TAFs中通過(guò)轉(zhuǎn)錄、翻譯形成大量的sTRAIL蛋白，借助于TAFs的旁分泌功能，分泌至腫瘤微環(huán)境中，并穿過(guò)層層基質(zhì)屏障，與腫瘤細(xì)胞表面的死亡受體結(jié)合，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。

Figure2 Off-target uptake of nanoparticles to TAFs[30]

2.2 主動(dòng)靶向至TAFs

盡管上述文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道了納米載藥制劑通過(guò)脫靶效應(yīng)被動(dòng)靶向到TAFs，進(jìn)而釋放藥物殺傷TAFs，削弱腫瘤組織的胞外基質(zhì)屏障，提高納米粒的深層次遞送，增加化療藥的抗腫瘤效果。然而，該類(lèi)型的納米制劑并非由TAFs特異性攝取，大部分納米粒通過(guò)EPR效應(yīng)將會(huì)被腫瘤細(xì)胞所攝取，從而降低了納米載藥制劑在TAFs中的富集濃度，影響了其對(duì)TAFs的殺傷效果。TAFs表面通常高表達(dá)成纖維細(xì)胞激活蛋白(fibroblast activation protein，F(xiàn)AP)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、波形蛋白(vimentin)、血小板生長(zhǎng)因子受體(PDGFR)等[3-4]，將靶向此類(lèi)分子的配體通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)或物理吸附到納米載體的表面，構(gòu)建主動(dòng)靶向到TAFs的納米載體，可顯著提高TAFs對(duì)其的攝入量。

Chen等[31-33]成功合成了表面修飾有FH多肽的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000-FH)納米脂質(zhì)體，用于負(fù)載小分子胞毒類(lèi)藥物Navitoclax(Nav)。該FH多肽可與TAFs主要分泌的肌腱蛋白C(Tenascin C，TNC)特異性結(jié)合，以達(dá)到主動(dòng)靶向至TAFs的目的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在小鼠肝癌模型中，F(xiàn)H-DSPE-PEG2000-Nav與對(duì)照組(DSPE-PEG2000-Nav)相比可顯著殺傷TAFs，其TAFs的減少量是對(duì)照組的1.4倍，由于TAFs數(shù)量的下降，導(dǎo)致了TAFs所分泌的膠原蛋白受到抑制，減少了致密的細(xì)胞外基質(zhì)，降低腫瘤間質(zhì)壓，從而達(dá)到重塑腫瘤微環(huán)境的目的。此外，該課題組還將該載藥納米脂質(zhì)體與靶向腫瘤細(xì)胞的負(fù)載DOX的納米粒(7pep-SSL-DOX)聯(lián)合使用，旨在提高DOX的抗腫瘤效果[34]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，基于FH-DSPE-PEG2000-Nav對(duì)腫瘤微環(huán)境基質(zhì)屏障的破壞作用，減少了細(xì)胞外基質(zhì)，使得7pep-SSL-DOX在實(shí)體瘤中的穿透能力增強(qiáng)且增加了其在腫瘤深部的蓄積量，提高了DOX的抗腫瘤效果。

FAPα是特異性表達(dá)于TAFs表面的一種抗原分子[35]，可用于設(shè)計(jì)主動(dòng)靶向至TAFs的納米載體。Ji等[36]以FAPα敏感的多肽Ac-ATKDATGPAKTA-NH2作為親水鏈段，偶聯(lián)上疏水性的C18鏈，最終得到兩親性多肽偶聯(lián)物CAP(Ac-ATK(C18)DATGPAK(C18)TA-NH2)。CAP通過(guò)自組裝將抗腫瘤藥物DOX包封于其疏水內(nèi)核，最終形成粒徑約為100 nm的膠束。體外釋放實(shí)驗(yàn)表明該膠束在FAPα作用下連接臂斷裂，僅3 h即可完全釋放其所包載的DOX，而不含F(xiàn)APα敏感多肽連接臂的對(duì)照組作用48 h僅釋放40%的DOX。Ji等還通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)考察了該納米膠束在FAPα高表達(dá)的TAFs中的攝取情況，結(jié)果表明，膠束和TAFs相互作用4 h后即可在胞內(nèi)觀察到明顯的DOX熒光信號(hào)；而與FAPα陰性的人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)孵育24 h，胞內(nèi)仍未見(jiàn)明顯的DOX熒光信號(hào)。該課題組還成功制備了九聚精氨酸-膽固醇兩親性偶聯(lián)物，將DOX負(fù)載于疏水性內(nèi)核形成表面帶正電的聚合物膠束，然后通過(guò)靜電吸附作用在該膠束表面包覆上靶向FAPα的單克隆抗體(mAb)[37]。該策略將主動(dòng)靶向技術(shù)和穿膜技術(shù)相結(jié)合，能夠更加有效地殺死TAFs，從而打破基質(zhì)屏障，改善藥物在腫瘤組織的滲透和分布。荷瘤動(dòng)物活體成像結(jié)果表明，該納米載體尾靜脈注射6 h后即可大量富集于腫瘤部位，24 h后處死小鼠分析其瘤內(nèi)活體染料的熒光強(qiáng)度是非靶向?qū)φ罩苿┙M的10倍。

3 總結(jié)與展望

TAFs作為腫瘤微環(huán)境的主要細(xì)胞類(lèi)型，在腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移中具有重要作用。通過(guò)酶激活式前體藥物和納米載體制劑的構(gòu)建成功靶向于TAFs，殺傷和干擾TAFs的功能，從而抑制腫瘤部位新生血管的生成和重塑細(xì)胞外基質(zhì)，促使腫瘤微環(huán)境“正?；保M(jìn)而徹底破壞腫瘤細(xì)胞賴(lài)以生存的“土壤環(huán)境”，提升化療藥物對(duì)腫瘤的治療作用。不單單是TAFs，TAFs與腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞，細(xì)胞外基質(zhì)和內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用的過(guò)程涉及多種因子的參與，亦可作為腫瘤治療的新靶點(diǎn)，然而其作用過(guò)程復(fù)雜，機(jī)制尚不明確，有待將來(lái)更進(jìn)一步的研究與探索。

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