鄭九嘉，陳霞，張李雅，金建遠(yuǎn)，楊旭，黃學(xué)鋒，費(fèi)前進(jìn)

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，溫州 325000)

精子冷凍技術(shù)在輔助生育技術(shù)中具有重要地位，對(duì)于某些重度少精子癥患者的精子保存以及一些患者在進(jìn)行可能損傷生育力的治療(如需接受放、化療治療的年輕未生育患者)前進(jìn)行精子冷凍保存，可使患者仍然保留自己生育的權(quán)利。因此，精子冷凍保存的研究對(duì)于生殖醫(yī)學(xué)的發(fā)展具有重要意義[1]。

利用超低溫保存精子時(shí)，在冷凍和復(fù)蘇過程中細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成和溶液效應(yīng)造成對(duì)精子的損傷，最為明顯的是精子解凍后的復(fù)蘇率和活動(dòng)力下降。由于在凍融過程中會(huì)引起精子頭部漿膜廣泛腫脹、破損，精子膜結(jié)構(gòu)不完整率增加，在胞內(nèi)產(chǎn)生的過量活性氧(ROS)易導(dǎo)致精子DNA、蛋白質(zhì)以及膜損傷等[2-4]。同時(shí)，精子在低溫保存時(shí)精漿對(duì)精子的保護(hù)能力非常有限，因此有必要在凍融過程中通過添加外界有效的物質(zhì)來保護(hù)精子。維生素E(Vit E)是機(jī)體中重要的抗氧化劑，其能抑制細(xì)胞內(nèi)一系列ROS的形成，減少和消除ROS對(duì)精子的不良作用。Ball等[5]和羅海玲等[6]在馬和羊的精液中添加Vit E后低溫保存，與不添加Vit E的對(duì)照組相比，添加Vit E后的精子具有較高的活力和頂體完整率。Vit B12是另一種相對(duì)重要的維生素類物質(zhì)，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一含有金屬鈷元素的維生素，鈷能夠減少組織的耗氧量，從而提高機(jī)體對(duì)氧的耐受性，增加機(jī)體組織在缺氧環(huán)境中的活力。有研究發(fā)現(xiàn)，Vit B12作為一種生理活性物質(zhì)，還具有改善精子外在環(huán)境，改進(jìn)精子活力等作用[7]。本研究主要通過在精子冷凍保護(hù)劑中添加適當(dāng)濃度的Vit E和B12，探索其對(duì)精子的冷凍保護(hù)作用，為精子的長(zhǎng)期有效保存提供一定的理論基礎(chǔ)，也為輔助生殖治療中精子的質(zhì)量提供保障。

資料與方法

一、研究對(duì)象

收集在本中心進(jìn)行健康體檢的32例正常男性志愿者精液標(biāo)本，所有受試者均知情同意并簽署知情同意書。受試者禁欲3～5 d，手淫法收集精液標(biāo)本。所有入選男性經(jīng)檢查未發(fā)現(xiàn)睪丸、染色體、激素水平等異常，同時(shí)排除細(xì)菌、支原體、衣原體感染等可能影響精子質(zhì)量的因素，排除器質(zhì)性及功能性不育患者。

二、研究分組

選取無白細(xì)胞污染，精子濃度>50×106/ml且a+b級(jí)≥50%的正常標(biāo)本32例，每1例精液標(biāo)本分為3份，按添加維生素(添加劑量參照之前文獻(xiàn)[8-9])的不同分為3組：對(duì)照組：精液中只添加常規(guī)冷凍保護(hù)劑；Vit E組：精液中添加常規(guī)冷凍保護(hù)劑和10 mM的Vit E[8]；Vit B12組：精液中添加常規(guī)冷凍保護(hù)劑和1.0%的Vit B12[9]。

三、主要方法

1.精子濃度及活動(dòng)力檢測(cè)：收集到的精液標(biāo)本在37℃ 20～30 min完全液化后按世界衛(wèi)生組織《人類精液及精子宮頸黏液相互作用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊(cè)》(第5版)行精液常規(guī)檢查，采用西班牙MLCRORTICS.L公司的計(jì)算機(jī)輔助精子自動(dòng)分析系統(tǒng)(SCA2002)檢測(cè)精子濃度和活動(dòng)力指標(biāo)。

2.配制含Vit E、B12的精子冷凍保護(hù)液：1.5 g葡萄糖、1.3 g檸檬酸三鈉二水加滅菌水至65 ml，加入15 ml甘油和1.3 g甘氨酸，完全溶解后用0.45 μm微孔濾器過濾，加入20 ml新鮮卵黃制成懸浮液，分別添加10 mM Vit E和1.0% Vit B12后于56℃水浴滅活40 min，調(diào)整pH至6.8～7.2，在超凈臺(tái)中將溶液以2 ml為單位分裝成對(duì)照組、Vit E組、Vit B12組，-80℃保存?zhèn)溆?。所有試劑均?gòu)自美國(guó)Sigma公司。

3.精子冷凍及解凍：精子冷凍：冷凍保護(hù)劑與精液按1：1混合(Vit E終濃度為5 mM，Vit B12終濃度為0.5%)。室溫平衡10 min，4℃冰箱放置30 min，-20℃冰箱30 min，-80℃冰箱30 min，最后投入液氮(-196℃)保存72 h后復(fù)蘇。精子解凍：將液氮中的精液標(biāo)本取出后立即投入37℃水浴，使之迅速?gòu)?fù)溫解凍。

4.檢測(cè)精子存活率：按照世界衛(wèi)生組織《人類精液及精子宮頸黏液相互作用實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)手冊(cè)》(第5版)[10]推薦的伊紅Y染色法檢測(cè)精子存活率。

5.精子染色質(zhì)擴(kuò)散(SCD)法檢測(cè)精子DNA完整性：SCD檢測(cè)采用Halosperm試劑盒(Halotech DNA SL，西班牙)，按試劑盒說明書步驟操作，簡(jiǎn)要步驟如下：精液標(biāo)本調(diào)濃度為1×107/ml，60 μl加入溶解的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠混勻，取20 μl精子凝膠混合液于預(yù)處理載玻片上，4℃冰箱水平放置5 min。酸性DNA變性液中室溫避光孵育7 min，避光裂解23 min；去殘余裂解液后依次在70%、90%和100%乙醇中各脫水2 min。晾干后染色10～15 min。400倍光鏡下觀察，比較精子核和核周圍暈輪大小，評(píng)價(jià)精子DNA碎片率(SDF)。

精子DNA損傷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)暈輪直徑與精子頭部橫徑的比例不同，分為大、中、小和無暈輪4個(gè)等級(jí)：暈輪直徑/精子頭橫徑≥2/3為大暈輪；1/4 <暈輪直徑/精子頭橫徑<2/3為中暈輪；暈輪直徑/精子頭橫徑≤1/4為小暈輪；觀察不到暈輪為無暈輪。大和中暈輪表示精子DNA完整無損傷；小和無暈輪表示精子DNA有一定程度損傷。

精子DNA暈輪直徑測(cè)量：400倍光鏡下不同視野隨即選取50條精子，在顯微測(cè)量尺下測(cè)量每條精子的暈輪直徑，計(jì)算平均暈輪直徑。

6.精子頂體酶活性檢測(cè)：使用深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司的頂體酶試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。正常精子頂體酶活性為48.2～218.7 μIU/106/精子。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、添加Vit E和B12對(duì)冷凍復(fù)蘇后精子活動(dòng)力和存活率的影響

在液氮中冷凍保存72 h的精液標(biāo)本取出后立即于37℃水浴復(fù)蘇，分別比較添加Vit E和Vit B12對(duì)精子活動(dòng)力、存活率及頂體酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)Vit E組(a+b)%精子數(shù)和精子存活率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，d%精子數(shù)顯著低于對(duì)照組(P<0.01)；Vit B12組的(a+b)%精子數(shù)和精子存活率有高于對(duì)照組的趨勢(shì)，但無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 3組精子復(fù)蘇后精子活動(dòng)力和存活率比較(-±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

二、添加Vit E和B12對(duì)冷凍復(fù)蘇后精子頂體酶活性的影響

比較3組精子頂體酶活性發(fā)現(xiàn)，Vit E組頂體酶活性為(101.8±4.5)μIU/106/精子，Vit B12組為(101.7±4.80)μIU/106/精子，雖然都稍高于對(duì)照組的(99.38±4.57)μIU/106/精子，但組間比較無顯著性差異(P>0.05)(圖1)。

圖1 3組精子頂體酶活性的比較

三、添加Vit E和B12對(duì)冷凍復(fù)蘇后SDF的影響

Vit E組和Vit B12組的SDF均顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，Vit E組和Vit B12組中代表精子DNA完整性的大暈輪精子百分?jǐn)?shù)也顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，而代表精子DNA發(fā)生損傷的小暈輪精子百分?jǐn)?shù)在Vit E和Vit B12組中顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(表2)。

顯微測(cè)量尺下隨機(jī)測(cè)量精子DNA的暈輪直徑見圖2，Vit E組的精子暈輪平均直徑[(6.76±0.14)μm]顯著高于對(duì)照組[(6.09±0.18)μm](P<0.01)，Vit B12組與對(duì)照組比較則無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

1：大暈輪精子；2：中暈輪精子；3：小暈輪精子；4：無暈輪精子圖2 精子DNA擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)

討 論

精子冷凍保存技術(shù)發(fā)展至今已有200多年的歷史，近年來國(guó)內(nèi)外研究均發(fā)現(xiàn)，影響人類精子凍融前后效果的主要因素有冷凍方法、冷凍保護(hù)劑的成分及凍存時(shí)間等[11]。研究表明，經(jīng)過冷凍解凍處理后精子活動(dòng)力、復(fù)蘇率、頂體酶活性均會(huì)受到不同程度的影響，并且會(huì)加劇精子DNA損傷，導(dǎo)致精子凍融后質(zhì)量及受精率的降低[12-13]，這一直是困擾精子受精能力的一個(gè)重要問題。精子在冷凍和解凍過程中形成冰晶、產(chǎn)生過量ROS以及精子細(xì)胞膜的過氧化反應(yīng)都會(huì)對(duì)精子活動(dòng)力、復(fù)蘇率、畸形率、DNA完整性和精卵融合造成不利影響。因此，要提高冷凍精子的能量代謝，獲得較高的精子復(fù)蘇率和活動(dòng)力，必須保護(hù)細(xì)胞膜的完整和通透性的穩(wěn)定，這是防止精子冷凍損傷的重要環(huán)節(jié)。

表2 3組精子復(fù)蘇后SDF及暈輪情況的比較(-±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

目前普遍認(rèn)為，精子細(xì)胞的凋亡[14]及氧自由基的過量產(chǎn)生[15]是影響精子常規(guī)參數(shù)和DNA損傷的主要因素。同時(shí)，精子DNA被認(rèn)為是評(píng)價(jià)精子功能的一項(xiàng)重要指標(biāo)，精子DNA損傷加劇會(huì)降低體外受精中的精子受精能力和胚胎發(fā)育潛能，降低臨床妊娠率和增高流產(chǎn)率[16]。精子在冷凍和解凍過程中冰晶的形成會(huì)引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，并且該過程中大量ROS的產(chǎn)生使精子細(xì)胞膜發(fā)生過氧化反應(yīng)以及對(duì)精子DNA完整性造成嚴(yán)重的破壞。目前觀點(diǎn)認(rèn)為，在精子冷凍保護(hù)劑中添加適當(dāng)濃度的維生素可有效減少ROS對(duì)精子的不良作用，一些研究也已經(jīng)證實(shí)了這個(gè)觀點(diǎn)[17-18]。

Vit E對(duì)漿膜的磷脂有著特殊的親和性，能預(yù)防或阻止脂質(zhì)過氧化，使過氧化脂質(zhì)無法生成，防止精子細(xì)胞膜氧化反應(yīng)的發(fā)生，保護(hù)精子膜的功能，從而提高精子冷凍后的復(fù)蘇率及活動(dòng)力[17]。一些研究已經(jīng)證實(shí)，通過在精子冷凍保護(hù)液中添加Vit E，可使解凍后的精子活動(dòng)力及DNA損傷得到顯著改善[19]。相對(duì)于Vit E在精子冷凍方面的研究，Vit B12在精子冷凍保護(hù)方面的研究相對(duì)較少。Neild等[20]研究發(fā)現(xiàn)，含Vit B12的精漿中谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)釋放量明顯下降，這可能是提高精子活動(dòng)力的一個(gè)重要因素，因?yàn)樵诶鋬龊徒鈨鲞^程中，精子中的GOT會(huì)釋放出來，從而導(dǎo)致精子的頂體腫脹和損壞，影響精子功能。迄今為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)Vit B12在人類精子冷凍保護(hù)中的作用研究相對(duì)較少，僅見一些學(xué)者在動(dòng)物精子冷凍方面的研究，在動(dòng)物研究中已發(fā)現(xiàn)Vit B12對(duì)精子冷凍確實(shí)有一定的保護(hù)作用，在精子冷凍保護(hù)液中添加Vit B12，具有維持精子頂體完整率、延長(zhǎng)精子體外存活時(shí)間和提高解凍后精子活動(dòng)力的作用[21-22]。

目前，維生素類物質(zhì)對(duì)精子冷凍保護(hù)作用主要集中在動(dòng)物精子的研究以及畜牧業(yè)中的應(yīng)用，在人類精子冷凍保護(hù)方面的研究相對(duì)較少；同時(shí)，在眾多的精子抗氧化冷凍保護(hù)劑中維生素的毒副作用相對(duì)較小。因此，維生素在精子冷凍保護(hù)中的應(yīng)用研究具有一定前景，對(duì)于提高輔助生殖中的精子受精率也有非常重要的意義。本研究分析在精子冷凍保護(hù)劑中分別添加適當(dāng)濃度的Vit E和Vit B12，液氮凍存72 h后復(fù)蘇精子的活動(dòng)力、存活率及SDF等各項(xiàng)指標(biāo)變化，結(jié)果顯示，Vit E能顯著改善復(fù)蘇后精子活動(dòng)力、存活率及DNA完整性；而對(duì)于精子頂體酶活性的改善不是很明顯，其原因可能是各組精子均在液氮超低溫環(huán)境下保存，而酶主要是由蛋白質(zhì)構(gòu)成，超低溫環(huán)境對(duì)蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)及活性本身就有很好的保護(hù)作用，因此對(duì)酶的活性影響較少，單純從頂體酶活性的角度考慮可能無太大差異；而添加Vit B12僅在改善精子DNA完整性方面有較明顯效果，我們推測(cè)這與人類精子中的GOT釋放及頂體結(jié)構(gòu)和功能與動(dòng)物精子存在一定的差異有關(guān)；另一方面，本研究納入樣本數(shù)較少可能也對(duì)研究結(jié)果存在一定的影響。

通過本研究，我們初步得出在精子冷凍保護(hù)劑中添加適當(dāng)濃度的Vit E可以緩解凍融過程對(duì)精子造成的傷害，在一定程度上提高凍融后精子活動(dòng)力、存活率及精子DNA完整性；雖然Vit B12組的精子活動(dòng)力、存活率等指標(biāo)略高于對(duì)照組但組間比較無顯著性差異，提示Vit B12在精子冷凍保護(hù)方面的作用尚不明顯。后續(xù)，我們將在以上結(jié)論的基礎(chǔ)上繼續(xù)探索Vit E和Vit B12對(duì)人類精子冷凍和復(fù)蘇過程的保護(hù)作用，尤其是對(duì)弱精子癥患者凍融后線粒體呼吸和氧化磷酸化功能的研究，為精子的長(zhǎng)期有效保存提供一定的理論基礎(chǔ)，也為實(shí)施輔助生殖精子的質(zhì)量提供保障。

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