王宇彤，邵鈺柔，陳利娜，朱永平，王繼剛

（1.南京中醫(yī)藥大學藥學院 南京 210023；2.中國中醫(yī)科學院青蒿素研究中心 北京 100700）

青蒿素是從黃花蒿中提取的一種倍半萜烯內脂化合物，在臨床上長期被用于治療瘧疾[1,2]。自19世紀70年代被中國科學家屠呦呦發(fā)現(xiàn)以來，青蒿素已經拯救了成千上萬人的生命，尤其是感染了早期瘧疾、治療藥物奎寧耐藥的惡性瘧原蟲的病人，屠呦呦也因此獲得了2015年的諾貝爾醫(yī)學或生理學獎。青蒿用于抗瘧治療在中國早有記載，東晉時期的葛洪在《肘后備急方》中首次提到青蒿對于瘧疾有潛在的治療作用，明朝的李時珍在《本草綱目》中也有提及。自二戰(zhàn)以來，人們一直使用氯喹治療瘧疾[3]，在當時也取得了良好的效果，然而，隨著氯喹耐藥瘧原蟲株的出現(xiàn)，全世界的抗瘧形式變得岌岌可危。在這種形勢下，屠呦呦臨危受命，其團隊根據(jù)中國古方記載，在數(shù)萬余種草藥中篩選并發(fā)現(xiàn)青蒿中提取的青蒿素具有顯著的抗瘧效果[4,5]。為了增強療效和預防青蒿素耐藥，科學家們以青蒿素的分子結構為基礎，開發(fā)了一系列青蒿素的衍生物，同樣具有良好的抗瘧效果[6,7]，包括二氫青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚等。直至現(xiàn)在，青蒿素及其衍生物依然是臨床上用于瘧疾治療的首選藥物。

伴隨著青蒿素的發(fā)現(xiàn)，大量的科學家開始研究青蒿素的作用機制，并以此為基礎，優(yōu)化青蒿素的抗瘧效果和開發(fā)其它的抗瘧藥物，以防止出現(xiàn)耐藥性的瘧原蟲株。令人意想不到的是，人們在青蒿素機制的研究上遇到了難題，迄今為止，對于青蒿素到底如何殺傷瘧原蟲這一問題，在學術界依然存在爭議。然而，從2008年開始，陸續(xù)有報導表明出現(xiàn)了具有青蒿素耐藥的耐藥瘧原蟲株[8]，令青蒿素的藥理機制研究變得異常緊迫，人們需要從青蒿素的作用機制中尋找到瘧原蟲的治療靶點，從而去開發(fā)新型抗瘧藥物。

1 青蒿素的結構與功能

青蒿素是一種具有過氧橋結構的倍半萜內酯類化合物[9]，純凈的青蒿素味苦，為針狀無色晶體?？茖W家們?yōu)榱搜芯壳噍锼亟Y構與功能的關系，設計并合成了大量青蒿素的類似物[10,11]，通過對類似物抗瘧活性的測定，發(fā)現(xiàn)青蒿素結構中的過氧橋對于青蒿素的抗瘧活性至關重要，失去了過氧橋結構的類似物相應地失去了抗瘧活性，而保留了過氧橋結構的類似物大多保留了青蒿素的抗瘧活性。由于青蒿素既不溶于水，又不溶于有機溶劑，導致青蒿素難于被有機體利用，因此科學家們基于青蒿素的構效關系，開發(fā)了一系列青蒿素的衍生物其中二氫青蒿素和青蒿琥酯易溶于水，而蒿甲醚和青蒿乙醚易溶于有機溶劑。這些青蒿素衍生物同樣作為臨床抗瘧藥物的有效成分在抗瘧斗爭中起了巨大作用。

2 青蒿素的機制研究

雖然近年來很多科學家就青蒿素的抗瘧機理進行了大量的研究，但是青蒿素具體如何作用于瘧原蟲仍存在爭議，有兩個關鍵問題亟待解決：1是用于激活青蒿素的鐵源來自哪里；2是被激活的青蒿素到底有哪些蛋白靶點。近年來，陸續(xù)出現(xiàn)了青蒿素耐藥的瘧原蟲株[12,13]，闡明青蒿素的作用機制并進一步研究產生青蒿素抗性的主要因素變得迫在眉睫。在本篇綜述中，我們總結了在青蒿素機制研究中具有代表性的研究成果，包括青蒿素的激活劑研究、青蒿素的靶點研究以及青蒿素抗性機制研究，并基于這些研究成果提出了我們自己的看法。

2.1 青蒿素的激活

青蒿素的結構中存在過氧橋結構，而青蒿素要發(fā)揮抗瘧活性又必須通過還原劑打破過氧橋結構，從而使青蒿素分子內電子重組形成自由基，進而導致瘧原蟲蛋白的烷基化，最終實現(xiàn)瘧原蟲死亡[14]。由于Fe2+可以催化過氧化物產生自由基，而且瘧原蟲中富含豐富的Fe2+，所以科學家一直認為具有抗瘧活性的青蒿素是通過Fe2+催化激活的。然而，鐵元素的來源也多種多樣，包括氯高鐵血紅素、亞鐵血紅素、游離的鐵離子等等，到底用于激活青蒿素的鐵來源于哪里，在青蒿素的研究過程中存在過巨大的爭議。

最早期的研究認為，游離的非血紅素鐵是青蒿素的激活劑[15,16]。Meshnick等人在1993年發(fā)現(xiàn)鐵離子螯合劑可以抑制青蒿素的類似物蒿乙醚對于瘧原蟲的殺傷作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，鐵離子的螯合劑可以顯著抑制青蒿素產生自由基，所以研究者得出結論，游離的鐵離子對于青蒿素殺傷瘧原蟲至關重要。但是，該實驗無法排除血紅素鐵激活青蒿素的可能性。Meshnick研究小組在隨后的研究中推翻了他們之前的結論，他們發(fā)現(xiàn)只有在亞鐵血紅素存在的情況下，青蒿素才能結合其靶點蛋白，表明亞鐵血紅素可能是青蒿素的激活劑[17]。Paul等人發(fā)現(xiàn)，青蒿素在瘧原蟲中通過游離的鐵離子激活，從而介導瘧原蟲中靶標蛋白的烷基化，其研究結果表明青蒿素的激活是通過游離的鐵離子介導的[18]。

在隨后的研究中，人們開始將目光轉移到血紅素對于青蒿素的激活作用上來，更多的研究成果表明血紅素來源的鐵才是青蒿素的激活劑[19-21]。Cheng等人通過分子對接模擬技術發(fā)現(xiàn)氯高鐵血紅素有著與青蒿素及其類似物結合的潛在位點[22]。Messori研究小組通過液相色譜-質譜聯(lián)用技術檢測了氯高鐵血紅素和青蒿素以及青蒿素類似物（包括二氫青蒿素、青蒿素甲醚以及青蒿琥酯）的結合能力[23]。結果發(fā)現(xiàn)，青蒿素的類似物和青蒿素一樣，都可以和氯高鐵血紅素1∶1形成配合物，并導致化合物中過氧橋結構的破壞。基于此，研究者認為青蒿素的激活是由氯高鐵血紅素導致的。然而，研究者忽略了一個問題，本實驗中，青蒿素和氯高鐵血紅素的結合是在70℃的條件下檢測的，而非生理條件的37℃，而且根據(jù)實驗結果，青蒿素和氯高鐵血紅素在37℃下結合能力較弱，這使得人們對于氯高鐵血色紅素激活青蒿素這個結論仍持懷疑態(tài)度。

Zhang等人比較了氯高鐵血紅素、亞鐵血紅素、無機的鐵離子以及血紅蛋白對于青蒿素的激活效率[14]，結果表明，亞鐵血紅素相比于其它幾種潛在的激活劑具有更高的激活效率，暗示亞鐵血紅素可能是青蒿素的首要激活劑。然而，通過該實驗我們可以發(fā)現(xiàn)，氯高鐵血紅素雖然激活效率不如亞鐵血紅素，但是仍然可以激活青蒿素對于瘧原蟲的殺傷作用，所以該研究并不能充分說明亞鐵血紅素就是青蒿素的激活劑。

2015年，Wang研究小組利用化學生物學的方法明確了激活青蒿素的鐵來源，他們認為氯高鐵血紅素以及亞鐵血紅素對于青蒿素的激活至關重要，都是青蒿素的激活劑[24]。氯高鐵血紅素中的三價鐵可以被體內的還原劑例如谷胱甘肽、維生素C等還原為亞鐵血紅素，繼而破壞青蒿素中的過氧橋結構產生自由基，從而殺傷瘧原蟲。Wang等人首次基于青蒿素的活性結構合成了青蒿素探針，利用化學蛋白組學研究手段，通過該探針篩選青蒿素在瘧原蟲中的蛋白靶點，通過青蒿素探針和靶點蛋白結合的強弱判斷不同來源的鐵對于青蒿素是否有激活作用。研究發(fā)現(xiàn)，氯高鐵血紅素在有還原劑維生素C存在的情況下可以明顯加強青蒿素與其靶點蛋白的結合，而游離的無機鐵離子無此效應，且游離的鐵離子螯合劑對于青蒿素與靶點蛋白的結合基本沒有影響。以上結果表明，血紅素（包括氯高鐵血紅素和亞鐵血紅素）而不是游離的無機鐵在青蒿素的激活中起關鍵作用。

Xiao研究課題組在人宮頸癌Hela細胞株中的實驗結果也得到了與Wang課題組類似的結論[25]。Xiao組同樣利用化學生物學的方法設計并合成了青蒿素的分子探針。利用該探針，他們在Hela細胞中篩選青蒿素的蛋白靶點。他們發(fā)現(xiàn)，在氯高鐵血紅素存在的情況下，青蒿素探針可以結合更多的蛋白靶點，表明氯高鐵血紅素可以激活青蒿素。然而，他們認為亞鐵血紅素才是青蒿素的直接激活劑，氯高鐵血紅素之所以可以用于激活青蒿素是因為腫瘤細胞中豐富的巰基可以將氯高鐵血紅素還原為亞鐵血紅素，繼而激活青蒿素。雖然該結果是在腫瘤細胞中獲得的，但是青蒿素在瘧原蟲中的激活過程實際上和它在腫瘤中的激活過程是類似的，所以我們也能從這個結果中獲得青蒿素激活劑來源的啟發(fā)。

總結科學家們前期對于青蒿素激活劑的研究成果，多方面證據(jù)都表明血紅素（包括氯高鐵血紅素和亞鐵血紅素）是青蒿素發(fā)揮抗瘧作用的激活劑，而游離的無機鐵離子與青蒿素的激活無關。

2.2 青蒿素的靶點

自1971年發(fā)現(xiàn)青蒿素的抗瘧活性以來，科學家們做了大量的研究工作去探究青蒿素的作用機理，然而迄今為止，青蒿素到底如何有選擇性地殺死瘧原蟲的作用機制卻并不明確[4,8,26]。究其原因，主要是由于青蒿素復雜的分子結構以及多靶點的藥理特性，導致人們很難去明確青蒿素在瘧原蟲中的蛋白靶點，即使能夠發(fā)現(xiàn)某一靶點蛋白，也很難確定此靶點蛋白在青蒿素抗瘧活性中是否起關鍵作用。

翻譯控制腫瘤蛋白（TCTP）是最早被確認的靶點蛋白之一[27,28]。Bhisutthibhan等人發(fā)現(xiàn)，青蒿素的衍生物二氫青蒿素可以濃度梯度依賴性地與TCTP結合，并最終達到1∶1的比例[29]。研究者通過斯卡查德分析，確定了TCTP蛋白上有兩個可以與血紅素結合的位點，并基于此得出結論，TCTP在有血紅素存在的情況下可以和青蒿素結合并且自身也可以和血紅素結合。Bhisutthibhan等人的發(fā)現(xiàn)為青蒿素的機制研究奠定了一定的基礎。同樣的，Eichhorn等人運用結構生物學的方法首先確定了TCTP蛋白的分子結構，并通過質譜、生物信息學、表面等離子共振等技術發(fā)現(xiàn)TCTP上存在青蒿素的結合位點，而且這些結合位點與TCTP的生物學功能息息相關，猜測青蒿素可能是通過TCTP蛋白起作用殺死瘧原蟲的[30]。然而，后續(xù)的研究成果并沒有發(fā)現(xiàn)TCTP蛋白與瘧原蟲死亡之間的聯(lián)系，青蒿素和TCTP的結合似乎更像是一種偶然[8]。

相比較而言，心肌肌漿網Ca2+-ATP酶（PfATP6）的發(fā)現(xiàn)則讓人們對于青蒿素機制的研究更近了一步。2003年，Eckstein-Ludwig等人在Nature上發(fā)表論文，發(fā)現(xiàn)青蒿素可以顯著抑制PfATP6的活性[19]。進一步研究表明，PfATP6的特異性抑制劑毒胡蘿卜素也具有殺傷瘧原蟲的效果，而且不具有青蒿素抗瘧活性的一種青蒿素衍生物（失去了過氧橋結構）無法抑制PfATP6的活性。另一方面，在沒有鐵激活的情況下，青蒿素失去了抗瘧活性，同時也失去了抑制PfATP6的活性。以上種種結果都表明青蒿素通過抑制PfATP6的活性達到殺傷瘧原蟲的效果。另一個研究成果同樣也證明了PfATP6和青蒿素的結合[31]。Shandilya等人通過密度泛函理論計算、分子對接、分子動態(tài)模擬等方法發(fā)現(xiàn)青蒿素通過抑制PfATP6的磷酸化、核苷酸結合導致PfATP6活性的喪失，從而殺死瘧原蟲。然而，Arnou等人通過異源表達并純化了PfATP6蛋白[32]，通過體外結合實驗發(fā)現(xiàn)，異源表達的PfATP6與毒胡蘿卜素有著較低的親和性，PfATP6并不能結合青蒿素，而且青蒿素對于PfATP6也沒有抑制活性，這表明PfATP6作為青蒿素的蛋白靶點在青蒿素抗瘧活性中起關鍵作用還存在疑慮。

近期，有科學家發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇-3激酶（PfPI3K）也是青蒿素在瘧原蟲中的靶點之一[33]。Mbengue等人發(fā)現(xiàn)青蒿素以及它的衍生物二氫青蒿素可以顯著快速地抑制PfPI3K的活性。而且通過對于PfPI3K蛋白晶體結構的分子模擬，他們發(fā)現(xiàn)二氫青蒿素可以與Pf-PI3K分子上的疏水區(qū)域結合。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在青蒿素耐藥的瘧原蟲中，PfPI3K的上調與一種青蒿素耐藥標志物的基因突變相關。綜合以上結果，研究者認為PfPI3K是青蒿素殺滅瘧原蟲的關鍵靶標蛋白。

此外，清華大學的周兵研究組多年來以酵母作為模型，研究青蒿素和線粒體之間的關系[34,35]。他們發(fā)現(xiàn)，青蒿素可以導致線粒體去極化，線粒體既是青蒿素的靶標，也是青蒿素的激活劑。他們的發(fā)現(xiàn)將青蒿素的靶標和生理學效應相關聯(lián)，在一定程度上解釋了青蒿素的特異性以及作用機制。

隨著生物技術的發(fā)展，出現(xiàn)了一些用于鑒定化合物蛋白靶點的新方法。例如，Wang組和Xiao組都采用了化學生物學的手段分別在瘧原蟲中和腫瘤細胞中篩選了青蒿素的蛋白靶點[24,25]。Wang等人采用了一種無偏見的化學蛋白組學方法，在瘧原蟲中篩選青蒿素的蛋白靶點，通過靶點的分析，推測青蒿素可能的作用機制。其主要流程可概括如下：首先，基于青蒿素的分子結構以及活性基團，他們設計并合成了青蒿素的分子探針，該探針相較于青蒿素多了一個炔基標簽，用于后續(xù)的點擊化學反應及靶點蛋白的富集。待探針在瘧原蟲中與靶點蛋白充分結合后，通過“點擊化學反應”在探針-蛋白復合物修飾上生物素標簽。接著，通過親和富集的方式富集連接在探針上的靶點蛋白。最后通過液質聯(lián)用鑒定出了124種瘧原蟲中的青蒿素靶標蛋白，其中包括前面提到的PfATP6以及其它32種與抗瘧相關的蛋白。通過蛋白組學分析發(fā)現(xiàn)，這124種青蒿素靶點蛋白與瘧原蟲中一些關鍵生物進程相關，所以可以認為青蒿素通過與這些靶點蛋白結合干擾了瘧原蟲中的關鍵生理過程，進而導致瘧原蟲死亡。與Wang組類似的是，英國利物浦大學的Ismail等人也合成了類似的青蒿素分子探針，也篩選到了60多種青蒿素蛋白靶點（其中大多數(shù)靶點蛋白與Wang組的結果一致）[36]。

2.3 青蒿素的耐藥

耐藥是藥物在長期使用后常見的現(xiàn)象，關于瘧原蟲出現(xiàn)青蒿素耐藥的報導近年來開始出現(xiàn)。2009年，Dondorp等人在《新英格蘭醫(yī)學雜志》上發(fā)表文章，明確提出了某些地區(qū)的瘧原蟲開始出現(xiàn)青蒿素耐藥現(xiàn)象[12]。他們比較了青蒿素的衍生物青蒿琥酯對于柬埔寨和泰國不同地區(qū)的惡性瘧原蟲的清除效率，發(fā)現(xiàn)柬埔寨西部的瘧原蟲對于青蒿琥酯的敏感性明顯降低，而且青蒿琥酯對于瘧原蟲的清除效率也有明顯的下降。考慮到青蒿素及其衍生物在現(xiàn)代臨床抗瘧中的關鍵作用以及瘧疾治療對于青蒿素的依賴性，這種青蒿素耐藥瘧原蟲的出現(xiàn)和傳播必然會導致嚴重后果。因此，探究青蒿素耐藥的分子機制并基于此進一步優(yōu)化臨床抗瘧藥物的分子結構變得至關重要。

青蒿素耐藥現(xiàn)象從一開始就被認為與瘧原蟲的基因突變相關[37]，根據(jù)前期對于耐藥現(xiàn)象以及青蒿素機制的研究，Pfmdr1（與多種藥物耐藥相關的轉運體）和PfATP6（被確認為青蒿素的蛋白靶點）在早期曾被認為可能與青蒿素耐藥相關。然而，Imwong等人的研究結果表明這兩個基因似乎與青蒿素耐藥沒有聯(lián)系[38]。Cheeseman等人利用單核苷酸多態(tài)性分析比較了91種從柬埔寨、泰國和老撾不同地區(qū)獲得的瘧原蟲基因組，發(fā)現(xiàn)有33段基因組序列可能與耐藥性相關[39]。接著，他們用了同樣的技術在從泰國獲得的715種瘧原蟲株中比較這33段基因組序列，最終發(fā)現(xiàn)13號染色體突變與青蒿素耐藥關系密切。Ariey等人更進一步通過全基因組測序技術發(fā)現(xiàn)Kelch13（K13）基因的突變是青蒿素耐藥的標志[40]。以上研究為青蒿素耐藥的機制探索奠定了基礎，但是如何將K13突變與青蒿素耐藥聯(lián)系起來仍然是個難題。

Mok等人通過轉錄組學的方法分析了從病人身上提取了1043種瘧原蟲的分離株[41]，發(fā)現(xiàn)青蒿素耐藥與未折疊蛋白應答（UPR）通路相關，主要包含兩種復合物，分別是活性氧化應激復合物（PROSC）和TCP-1環(huán)裝復合體（TRiC）。這兩種復合物的mRNA水平不僅相互影響，而且與青蒿素耐藥相關。另外，上調UPR水平可以明顯提高瘧原蟲對于青蒿素的耐藥程度，并且同時損傷K13蛋白的功能。Mok等人的發(fā)現(xiàn)將K13突變與青蒿素耐藥聯(lián)系了起來，然而還是缺乏一些中間環(huán)節(jié)，而且無法確定是否有其它因素與K13突變及青蒿素耐藥相關。

另一方面，Mbengue等人發(fā)現(xiàn)青蒿素耐藥與青蒿素的靶點PfPI3K有關[33]。他們首先通過生物化學方法發(fā)現(xiàn)PfPI3K是青蒿素的靶點之一，接著對于耐藥瘧原蟲的研究發(fā)現(xiàn)，PfPI3K的上調與瘧原蟲中K13基因的C580Y位的突變相關。K13基因的突變阻止PfPI3K的多聚泛素化和與PfK13蛋白的結合，繼而限制了Pf-PI3K的水解以及其脂化產物PI3P的上調。他們還發(fā)現(xiàn)，PI3P的上調可以作為青蒿素耐藥的標志，而且PI3P導致的青蒿素耐藥并不依賴于K13基因的突變，但受K13突變的調控。以上結果表明，PI3P是青蒿素耐藥的關鍵調控因子，而PfPI3K是青蒿素與青蒿素耐藥相關的重要靶點。Mbengue等人的發(fā)現(xiàn)說明K13突變并不是青蒿素耐藥的唯一因素，青蒿素耐藥可能是多種因素或者多個基因突變共同造成的。

3 總結與展望

青蒿素自19世紀70年代發(fā)現(xiàn)以來，作為治療瘧疾的首選藥物已有近50年的歷史。迄今為止，大多數(shù)治療瘧疾的治療方法仍然以青蒿素或其衍生物作為基礎，可以說，青蒿素的發(fā)現(xiàn)拯救了千萬人的生命。雖然青蒿素自發(fā)現(xiàn)以來就獲得了大量的關注，人們對于青蒿素的作用機制也開展了大量的研究，然而對于青蒿素到底如何作用于瘧原蟲、為何青蒿素可以高效選擇性地殺傷瘧原蟲這些問題仍然存在爭議。由于青蒿素本身是原藥，必須經過激活后才能與蛋白結合，所以若要研究青蒿素的作用機制首要的問題就是用于激活青蒿素的鐵到底來源于哪里。關于這個問題，有的報導表明鐵來源于游離的鐵離子，有的報導表明鐵來源于血紅素，而且都提供了明確的證據(jù)。第二個核心問題是青蒿素在瘧原蟲中的作用靶點。早期科學家通過生物化學的方法發(fā)現(xiàn)了青蒿素的一些蛋白靶點，例如TCTP、PfATP6等，但是人們無法證明這些靶點與青蒿素的抗瘧活性相關，或者說無法將這些蛋白靶點與青蒿素殺傷瘧原蟲聯(lián)系起來。隨著生物技術的發(fā)展，出現(xiàn)了一些新型的技術手段，比如化學蛋白質組學手段，Wang研究團隊利用該方法不僅證明了血紅素是激活青蒿素的鐵來源，還在瘧原蟲中無差別地篩選到了124種青蒿素靶點蛋白，初步闡明了青蒿素的分子作用機制，為青蒿素的機制研究奠定了靶點基礎。隨著青蒿素的大量使用，不可避免地出現(xiàn)了一些青蒿素耐藥的瘧原蟲株，一旦傳播將會嚴重危害到了人類的健康。青蒿素作用機制的不明確給青蒿素耐藥的研究帶來了很大的困難，但是并不是毫無進展，科學家已經基本確定Kelch13（K13）基因的突變是青蒿素耐藥的標志，至于K13突變如何和青蒿素耐藥聯(lián)系起來仍然是一個難題。而根據(jù)上述的青蒿素多靶點作用理論，單個基因突變并不足以引起青蒿素耐藥，這種傳統(tǒng)耐藥機制似乎不能用于解釋青蒿素耐藥機制。因此，我們期待有更先進的新技術、新方法能夠運用到青蒿素機制研究中來，盡快揭秘青蒿素抗瘧及抗藥問題。