孔德志，任雷鳴，張 煒

（河北醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 石家莊 050017）

隨著高分辨質(zhì)譜技術(shù)的進(jìn)步，用質(zhì)譜對(duì)復(fù)雜蛋白樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，也用到了人類基因組研究項(xiàng)目中用到的“鳥(niǎo)槍法”（Shotgun）策略[1]。隨著電噴霧（ESI）高分辨串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的成熟，測(cè)定蛋白經(jīng)酶解后所形成多肽的質(zhì)荷比（質(zhì)量與電荷的比值，簡(jiǎn)稱質(zhì)荷比，m/z）和經(jīng)質(zhì)譜碰撞所產(chǎn)生的離子碎片，利用蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)的信息，計(jì)算機(jī)可以高通量快速地鑒定肽段并進(jìn)行蛋白質(zhì)的組裝。與常規(guī)二維電泳（2-DE）相比，避免了對(duì)疏水性、低豐度、分子量極大極小蛋白的偏向性，短時(shí)間內(nèi)可以鑒定上千種蛋白質(zhì)。小于100個(gè)氨基酸的膜蛋白通常很難檢測(cè)，而應(yīng)用基于質(zhì)譜的方法可以鑒定到很多小分子膜蛋白[2]。另外，質(zhì)譜技術(shù)不僅能夠檢測(cè)蛋白質(zhì)多肽的分子量和氨基酸序列，還能發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)被翻譯后序列的修飾情況[3]。但是，由于膜蛋白的疏水性、低豐度等特點(diǎn)，在進(jìn)行Shotgun質(zhì)譜分析前仍需要對(duì)樣品進(jìn)行一些特殊的處理，本文針對(duì)膜蛋白樣品的前處理及相關(guān)應(yīng)用研究的進(jìn)展做一綜述。

1 膜蛋白的樣品前處理

與常規(guī)Shotgun蛋白質(zhì)組學(xué)相似，應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)定性定量膜蛋白時(shí)同樣需要提取蛋白并進(jìn)行合適的酶切，以適應(yīng)質(zhì)譜的檢測(cè)。由于膜蛋白的特殊性，在膜蛋白的提取和酶切時(shí)應(yīng)該格外注意，對(duì)于膜蛋白樣品的前處理本文主要關(guān)注膜蛋白的富集和提取、酶切過(guò)程。至于膜蛋白提取后的還原烷基化過(guò)程一般與常規(guī)蛋白質(zhì)組學(xué)樣品的處理相同：用DTT（二硫蘇糖醇）或TCEP[三(2-羧乙基)膦]進(jìn)行二硫鍵的還原，再用IAM（碘乙酰胺）進(jìn)行烷基化處理[4]；為降低樣品的復(fù)雜性，增加蛋白的鑒定數(shù)量，可以將富集后的膜蛋白進(jìn)行預(yù)分離，如：依據(jù)等電點(diǎn)進(jìn)行蛋白的預(yù)分離，也可以將酶切后的肽段利用高pH條件下的反相C18柱、或離子交換柱進(jìn)行肽段的預(yù)分組；最后應(yīng)用納升液相（Nano LC）進(jìn)行肽段的分離、高分辨質(zhì)譜檢測(cè)，最近有文獻(xiàn)指出鑒于儀器靈敏度的提升，用微升液相（Micro LC）也能達(dá)到滿意的蛋白定性效果，但是由于微升液相的穩(wěn)健性更適合于蛋白的定量[5]。

1.1 膜蛋白的富集與提取

膜蛋白樣品既可以是動(dòng)植物或人體的不同組織，也可以是不同來(lái)源的培養(yǎng)細(xì)胞。但是，需要指出在體的細(xì)胞與培養(yǎng)的細(xì)胞在膜蛋白水平不能認(rèn)為等同，二者存在差異[6]。不管是什么來(lái)源的樣品，在提取膜蛋白之前，均需要一些處理，包括組織研磨、超聲、低滲、反復(fù)凍融等手段以裂解細(xì)胞。

1.1.1 分離純化細(xì)胞膜

利用細(xì)胞膜的特性，先將細(xì)胞膜與其它細(xì)胞器分離，再提取膜蛋白是經(jīng)典的膜蛋白制備方法。離心制備的細(xì)胞膜粗提物，可進(jìn)一步用傳統(tǒng)的密度梯度離心或兩相分離法純化細(xì)胞膜，但該過(guò)程不可避免的會(huì)受到胞質(zhì)蛋白的污染，故只能作為一種膜蛋白富集的手段[7]。Rui等介紹了一種用傳統(tǒng)的蔗糖密度梯度離心和兩相聚合物分離純化肝細(xì)胞膜蛋白的詳細(xì)方法[8]。細(xì)胞膜在破碎后會(huì)形成大片狀、小囊泡的結(jié)構(gòu)，大片狀的細(xì)胞膜易于同細(xì)胞核或未破碎的細(xì)胞粘附在一起，若離心棄沉淀會(huì)造成膜蛋白的流失。用堿性溶液（如Na2CO3溶液）清洗細(xì)胞膜可以去掉其表面粘附的胞質(zhì)蛋白，細(xì)胞膜此時(shí)易形成小囊泡狀的膜結(jié)構(gòu)，可減少初步離心棄沉淀所造成的損失，此時(shí)堿溶液的量要大于細(xì)胞體積的50倍以上[9]。既然用溫和的方法破膜，有利于形成大片狀的細(xì)胞膜，有文獻(xiàn)報(bào)道用低滲溶液結(jié)合液氮凍融法破碎細(xì)胞膜、用低滲溶液多次離心清洗，棄去含有胞質(zhì)等污染成分的上清，制備了包括細(xì)胞膜、核膜和線粒體膜的膜組分，用該法制備膜蛋白的重復(fù)性非常好，4次平行試驗(yàn)所提取的蛋白含量變異系數(shù)（CV）為7.7%，質(zhì)譜非標(biāo)定量（label-free quantification）法測(cè)定膜蛋白的含量，2次平行試驗(yàn)中99%的蛋白其CV值不大于30%[10]。

利用細(xì)胞膜的負(fù)電性，采用陽(yáng)離子納米顆粒包裹在細(xì)胞膜的表面，再用陰離子聚合物中和未與細(xì)胞膜結(jié)合的陽(yáng)離子納米顆粒，以防止陽(yáng)離子納米顆粒在細(xì)胞破碎后與其它膜組分結(jié)合。由于納米顆粒的結(jié)合，極大的增加了細(xì)胞膜的密度，使得細(xì)胞膜比其他任何亞細(xì)胞器的密度都大，這樣，細(xì)胞破碎后用較低的離心力離心，即可制備得到較為純凈的細(xì)胞膜，用這種方法也可以針對(duì)性的研究細(xì)胞的頂膜或基底膜。Choksawangkarn等考察了用3種不同密度的陽(yáng)離子納米顆粒（Al2O3、用Al2O3包裹的Fe3O4、用Al2O3包裹的SiO2）分離膜的效果，經(jīng)過(guò)Shotgun質(zhì)譜技術(shù)鑒定所得到的膜蛋白，結(jié)果表明密度最大的Fe3O4顆粒分離效果最好；另外，不同納米顆粒具有不同的選擇性，Al2O3顆粒傾向于富集堿性膜蛋白，而Fe3O4顆粒更傾向于富集疏水性的膜蛋白[11]。

針對(duì)感興趣的膜蛋白，還可以用另一種策略，可把所關(guān)心的膜蛋白封裝到一種人造納米膜盤（nanodisc）中，然后用質(zhì)譜技術(shù)分析人造納米膜所封裝的蛋白。用磷脂和骨架蛋白等組裝材料形成nanodisc，依據(jù)組裝材料的種類和比例不同可以封裝不同的膜蛋白，且能保持蛋白的活性。文獻(xiàn)報(bào)道以磷脂和His標(biāo)記的MSP1E3D1骨架蛋白形成的nanodisc，封裝了哺乳動(dòng)物細(xì)胞的膜蛋白，形成了細(xì)胞膜蛋白的功能納米膜盤庫(kù)（functional nanodisc library），經(jīng)過(guò)純化、拆卸nanodisc后，用質(zhì)譜進(jìn)一步分析所封裝的膜蛋白。需要指出的是，在進(jìn)行質(zhì)譜分析前須去除MSP1E3D1骨架蛋白，以防止其掩蓋待分析目標(biāo)蛋白的質(zhì)譜信號(hào)[12]。

1.1.2 膜蛋白的抽提

由于膜蛋白的疏水性，為了增加膜蛋白的溶解，需要加入表面活性劑、有機(jī)溶劑、離液劑（chaotropes）等溶劑，如Sodium dodecyl sulfate（SDS）、NP-40、Tween-20、Triton X-100、sodiumdeoxycholate（SDC）、乙腈、尿素等，有文獻(xiàn)[13，14]對(duì)這些膜蛋白提取劑的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。最近，Zhang等同時(shí)應(yīng)用了兩種膜蛋白復(fù)合提取劑DDM/CHS（n-dodecyl-β-D-maltopyranoside/cholesteryl hemisuccinate）以提高膜蛋白的提取效率[15]。由于膜蛋白鑲嵌在細(xì)胞膜的磷脂雙分子層中，脫脂可以增加膜蛋白的提取率，但脫脂本身也會(huì)造成膜蛋白的損失。Raimondo等用14倍體積的冰冷tributyl phosphate（TBP）/acetone/methanol mixture（1∶12∶1）脫脂，優(yōu)化后的方法可以使膜蛋白的鑒定數(shù)目增加50%[16]。文獻(xiàn)[17]在分析McA-RH7777細(xì)胞膜蛋白時(shí)也用甲醇進(jìn)行了脫脂處理。

盡管傳統(tǒng)的表面活性劑（如：SDS）在膜蛋白的提取中應(yīng)用非常廣泛，但是這些表面活性劑與質(zhì)譜的兼容性并不好，現(xiàn)在人們?cè)絹?lái)越關(guān)注研究新型質(zhì)譜兼容性的高效膜蛋白提取劑。Zhao等用質(zhì)譜兼容的離子液體 1-dodecyl-3-methylimidazolium chloride（C12Im-Cl）來(lái)提取膜蛋白，結(jié)果表明該離子液體比SDS、Rapigest、methanol提取后鑒定的膜蛋白數(shù)量要多，用該法研究大鼠腦組織的膜蛋白，所鑒定的內(nèi)在膜蛋白比用SDS多了1.4倍（251 vs 178）；且C12Im-Cl對(duì)胰蛋白酶的酶解活性無(wú)影響，更有利于疏水性肽段的溶解[18]。Amphipols（APols）是另一種質(zhì)譜兼容性的膜蛋白提取劑，亦不影響胰蛋白酶的活性，故酶解前無(wú)需去除，在質(zhì)譜分析前僅需要一步酸化和離心即可沉淀APols，Ning等[19]用APols建立了One-Step快速抽提膜蛋白的前處理方法，避免了傳統(tǒng)表面活性劑和離液劑的使用，減少了蛋白樣品的損失。

1.1.3 基于膜蛋白表面的特質(zhì)性進(jìn)行膜蛋白的提取

膜蛋白氨基酸序列的糖基化修飾非常普遍，是膜蛋白實(shí)現(xiàn)功能的必要修飾。可以依據(jù)膜蛋白上的糖基修飾[20,21]，特別是N-glycosylation進(jìn)行膜蛋白的富集，一方面利用糖結(jié)構(gòu)中的醛基和酮基，硼酸可與鄰近的兩個(gè)羥基形成非可逆硼酸環(huán)狀結(jié)構(gòu)；另一面可利用凝集素或標(biāo)記的凝集素與糖特異性的結(jié)合，凝集素的最大特點(diǎn)是可以識(shí)別糖蛋白和糖肽中復(fù)雜的碳水化合物結(jié)構(gòu)（即細(xì)胞膜表面的碳水化合物決定簇）。另外，不同的凝集素對(duì)糖基的識(shí)別也具有一定的選擇性，如刀豆凝集素易與α-D-吡喃糖基結(jié)合，麥芽凝集素易與N-乙酰糖胺結(jié)合，菜豆凝集素易與N-乙酰乳糖胺結(jié)合，而且凝集素具有多價(jià)態(tài)結(jié)合的能力，可以進(jìn)一步與生物素、酶、膠體金、鐵蛋白等結(jié)合，有利于下一步的分離與示蹤[22]。Strassberger等用生物素（EZ-link sulfo-NHS-LC-biotin）富集了髓性白血病細(xì)胞表面的320個(gè)膜蛋白，并針對(duì)發(fā)現(xiàn)的CD166/ALCAM蛋白設(shè)計(jì)了抗體，具有較好的腫瘤殺滅作用[23]。Soulet等用在體生物素結(jié)合非標(biāo)記蛋白定量的質(zhì)譜方法，首次研究了雞胚胎血管和基質(zhì)的膜蛋白質(zhì)組學(xué)[24]。關(guān)于糖蛋白的分離純化策略可見(jiàn)文獻(xiàn)[25]，基于凝集素的糖蛋白富集可進(jìn)一步參考相關(guān)綜述[26]，根據(jù)糖的性質(zhì)也可以使用其它策略，比如酶切后用二氧化鈦、HILIC材料富集糖肽[27]。

由于胞外區(qū)的蛋白序列具有信號(hào)傳遞、藥物結(jié)合、與宿主細(xì)胞結(jié)合的重要意義，故可以直接富集這些胞外區(qū)的蛋白序列[28]，忽略其跨膜區(qū)域的蛋白序列。除了用免疫親和的方法可以“剃去”（Shaving）細(xì)胞膜表面的蛋白，也可以用蛋白酶在細(xì)胞或細(xì)菌存活的狀態(tài)下“剃去”其表面的蛋白，鑒定這些胞外區(qū)的蛋白序列，該法尤其適合于致病微生物表面蛋白的研究[29]。

而一些市售的膜蛋白提取試劑盒（如Novagen TM-PEK，Sigma ProteoPrep?Membrane Extraction Kit，PIERCE Mem-PER?）一般利用膜蛋白的疏水特性進(jìn)行膜蛋白的提取，具有方便迅速的特點(diǎn)，但干擾蛋白也較多。

1.2 膜蛋白的酶解

胰蛋白酶（trypsin）是蛋白質(zhì)組學(xué)中最常使用的消化酶，然而膜蛋白跨膜區(qū)域中可供trypsin酶切的位點(diǎn)（賴氨酸和精氨酸）較少，酶切后易產(chǎn)生許多疏水性的大片段，不易溶解且不利于質(zhì)譜檢測(cè)，從而降低了膜蛋白的序列覆蓋度。進(jìn)一步提高酶解效率、增加膜蛋白序列的覆蓋度并減少酶切耗時(shí)是人們所關(guān)注的問(wèn)題。

有人采用兩步酶解法，首先用胰酶（1∶20）37℃酶解3.5 h，高速離心后將沉淀進(jìn)一步用糜蛋白酶和Trypsin過(guò)夜酶解，終止酶解后，將兩部分酶解后的肽段合并，以增加酶切位點(diǎn)，提高蛋白序列的覆蓋度[30]。將Trypsin固定到惰性顆粒表面，可以縮短酶解耗時(shí)，Chao等將Trypsin固定到疏水性聚合物和親水性聚合物的納米顆粒表面，用這種雙基質(zhì)固定的Trypsin酶解膜蛋白，不僅縮短了酶解時(shí)間，而且與溶液酶解相比，鑒定到的肽段數(shù)增加約2倍，提高了蛋白序列的覆蓋度[31]。雙酶酶解反應(yīng)器（bi-enzymatic reactor，糜蛋白酶和Trypsin均固定到硅膠納米顆粒）在大鼠肝臟膜蛋白的鑒定試驗(yàn)中，雙酶反應(yīng)器比單獨(dú)用糜蛋白酶或Trypsin反應(yīng)器鑒定的膜蛋白數(shù)量多了1倍（單獨(dú)用糜蛋白酶反應(yīng)器鑒定出了1010個(gè)，單獨(dú)Trypsin反應(yīng)器鑒定出了1184個(gè)，而雙酶組合反應(yīng)器鑒定出了2891個(gè)膜蛋白），同時(shí)也增加了所鑒定蛋白的序列覆蓋度，酶解時(shí)間也縮短到了1 min以內(nèi)[32]。

由于膜蛋白的疏水性，在酶解過(guò)程中可能形成沉淀，在酶解過(guò)程中加入含1.0%脫氧膽汁酸鈉（SDC）的NH4HCO3溶液，雖然沒(méi)有增加膜蛋白的鑒定數(shù)目，但增加了多肽的匹配數(shù)目[33]。在FASP（Filter-aided sample preparation）法中，Andrew[34]等認(rèn)為在含SDC的溶液中酶切，不能增加蛋白的鑒定數(shù)量，僅僅是對(duì)肽段有略微的選擇性差異，這與Erde[35]認(rèn)為SDC可以增加蛋白序列的覆蓋度和蛋白定量的回收率不相一致。Metthew等考察了8種商品化質(zhì)譜兼容性的表面活性劑[Invitrosol、PPS Silent Surfactant、Progenta anionic acidlabile surfactant(AALS)I、Progenta AALS II、Progenta cationicacid labile surfactant(CALS)I、Progenta CALS II、ProteaseMax、RapiGest SF]、甲醇乙腈兩種有機(jī)溶劑、尿素和鹽酸胍兩種離液劑對(duì)膜蛋白的酶解效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用Progenta陰離子表面活性劑時(shí)酶解效果較好，但當(dāng)用乙腈（20%）、鹽酸胍（1 mol·L-1）和表面活性劑（0.1%）組成復(fù)合試劑時(shí)，可最大化的增加酶解的特異性（＞90%），增加肽段的鑒定數(shù)目，增加蛋白序列的平均覆蓋度以及蛋白跨膜區(qū)域的覆蓋度[36]。

另外由于膜蛋白表面的糖基化修飾，不利于酶切，也不利于質(zhì)譜在正離子模式下的檢測(cè)，因此在酶切前，可用糖基肽酶（PNGase F）等去除膜蛋白表面的糖基化修飾。Jedrychowski在用質(zhì)譜測(cè)定irisin時(shí)，用Deglycosylation Mix去除其糖基化修飾，以增加irisin酶切后肽段的定量效果[37]。

不同的酶切方式也影響著膜蛋白的鑒定，Waeowalee等比較了膠內(nèi)酶切、溶液酶切及FASP酶切對(duì)骨髓瘤細(xì)胞膜蛋白的鑒定情況，采用膠內(nèi)酶切可以鑒定出106個(gè)至少包含一個(gè)跨膜區(qū)域的膜蛋白，而溶液酶切僅能鑒定出33個(gè)膜蛋白，F(xiàn)ASP酶切僅能鑒定出37個(gè)膜蛋白，認(rèn)為膠內(nèi)酶切的方式更適合膜蛋白的鑒定[38]。

2 膜蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用

2.1 與中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究

神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)機(jī)體生理功能活動(dòng)的調(diào)節(jié)十分重要，其細(xì)胞膜表面的蛋白發(fā)揮著重要的生理功能。Melo-Braga等用膜蛋白組學(xué)的方法比較了胚胎干細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞的區(qū)別，鑒定出了2910個(gè)具有跨膜區(qū)域或信號(hào)肽的膜蛋白，指出Crumbs 2可能為神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志物[39]。Dagley等研究了小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘膜蛋白質(zhì)組，采用18O標(biāo)記同時(shí)定性定量了超過(guò)1000種髓鞘蛋白，并發(fā)現(xiàn)了髓鞘中的標(biāo)志性蛋白[40]。

突觸體是由神經(jīng)細(xì)胞末梢的突觸前、突觸間隙、突觸后膜所組成的囊性結(jié)構(gòu)，能夠發(fā)揮突觸的基本功能，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)功能及其疾病的研究。Bosch等通過(guò)研究背側(cè)紋狀體的突觸蛋白質(zhì)組學(xué)，發(fā)現(xiàn)冰毒可使神經(jīng)保護(hù)（neuroprotection）、神經(jīng)可塑性（neuroplasticity）、細(xì)胞骨架（cell cytoskeleton）、能量調(diào)節(jié)（energy regulation）等相關(guān)的84個(gè)蛋白發(fā)生改變，確定amphiphysin與成癮相關(guān)[41]。Gy?rffy等通過(guò)脂多糖來(lái)激活孕期母體的免疫反應(yīng)，通過(guò)研究子代的突觸體蛋白的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突觸前的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（vesicle trafficking），突觸后的骨架蛋白（cytoskeleton）、參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（signal transduction）的蛋白也發(fā)生了改變，而這些蛋白均參與了精神分裂癥和自閉癥相關(guān)通路的調(diào)節(jié)，該研究證實(shí)了母體免疫激活（MIA）可能會(huì)增加子代患精神疾病的概率[42]。文獻(xiàn)[43]研究了抑郁小鼠突觸后致密層（PSD）的蛋白質(zhì)組學(xué)，共發(fā)現(xiàn)1500多個(gè)蛋白，其中74個(gè)膜蛋白與對(duì)照組相比表達(dá)量顯著增加，進(jìn)一步分析顯示這些致密層的膜蛋白參與了信號(hào)傳導(dǎo)及突觸功能的調(diào)節(jié)，發(fā)現(xiàn)了一系列與抑郁相關(guān)的包括NMDA受體亞單位NR2A在內(nèi)的膜蛋白，這些膜蛋白可能成為治療抑郁的新靶點(diǎn)。在突觸體的制備過(guò)程中，常常伴隨著神經(jīng)膠質(zhì)體（gliosomes）的產(chǎn)生，通過(guò)密度梯度離心可以進(jìn)一步純化神經(jīng)膠質(zhì)體，神經(jīng)膠質(zhì)體的蛋白質(zhì)組學(xué)[44]發(fā)現(xiàn)其富含不同種類的星形膠質(zhì)細(xì)胞蛋白（如VAMP3、Ezrin、Basigin）和G-蛋白介導(dǎo)的信號(hào)蛋白。

2.2 與腫瘤相關(guān)的膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究

腫瘤的早期診斷及治療是世界性難題，目前發(fā)現(xiàn)的腫瘤標(biāo)志物（maker）很多屬于蛋白質(zhì)，如甲胎蛋白（AFP）、血清癌胚抗原（CEA）、前列腺特異抗原（PSA）等，由于細(xì)胞膜表面存在特異性的抗原，針對(duì)特定腫瘤的靶向治療收到人們的廣泛關(guān)注，而基于質(zhì)譜的膜蛋白質(zhì)組學(xué)是促進(jìn)該研究的有力手段[45]。

Martinez-Pinna等比較了腹主動(dòng)脈瘤患者和正常人體內(nèi)紅細(xì)胞膜蛋白的差異，質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，有39個(gè)膜蛋白發(fā)生了顯著改變，包括膜的結(jié)構(gòu)蛋白（spectrins、ankyrin）、氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白（catalase、peroxiredoxin-2）等[46]。為表征膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的侵蝕性，Izabela等通過(guò)研究9種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的膜蛋白質(zhì)組學(xué)，發(fā)現(xiàn)了49種與腫瘤侵蝕密切相關(guān)的膜蛋白，包括與預(yù)后密切相關(guān)的 ITGA5（integrin alpha5）、CD97、ANXA1（annexin A1）[47]。通過(guò)提取大腸息肉組織、未轉(zhuǎn)移的大腸癌組織及轉(zhuǎn)移的大腸癌組織的膜組分，應(yīng)用Shotgun蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)其中的1567個(gè)蛋白至少含有一個(gè)跨膜區(qū)域，息肉與癌組織相比差異表達(dá)的膜蛋白有159個(gè)；而轉(zhuǎn)移與非轉(zhuǎn)移的癌組織相比，差異表達(dá)的膜蛋白有32個(gè)[48]。Gao等研究了胃癌組織及其癌旁組織的膜蛋白質(zhì)組學(xué)，用TMT標(biāo)記技術(shù)同時(shí)定性定量了135個(gè)細(xì)胞膜或膜相關(guān)蛋白，其中的82個(gè)膜蛋白發(fā)生了顯著變化，包括已知的annexin A6、caveolin 1、epidermal growth factor receptor、integrin beta 4等胃癌標(biāo)志物，指出flotillin 1可能是另一個(gè)潛在的胃癌標(biāo)志物[49]。采用兩相提取法提取ErbB2過(guò)表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞、3種ErbB2陰性癌細(xì)胞及良性乳腺細(xì)胞的膜蛋白，經(jīng)過(guò)Shotgun蛋白質(zhì)組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞與酪氨酸激酶、細(xì)胞粘附分子等相關(guān)蛋白的異常表達(dá)密切相關(guān)，是造成乳腺腫瘤細(xì)胞無(wú)限制生長(zhǎng)的重要原因[50]。Yan等比較了頭頸部鱗狀細(xì)胞腫瘤與周圍組織的膜蛋白差異，發(fā)現(xiàn)有123個(gè)膜蛋白上調(diào)或下調(diào)1.5倍以上，主要涉及CD166和CD44，而CD166更合適作為該腫瘤的marker[51]。Mermelekas[52]和Shukla[53]針對(duì)從膜蛋白中找到腫瘤標(biāo)志物的技術(shù)要點(diǎn)及存在的問(wèn)題進(jìn)行了進(jìn)一步的綜述。

惡性膠質(zhì)瘤，約占52%的原發(fā)性腦部惡性腫瘤，特別是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤干細(xì)胞（GSCs）對(duì)放療或化療均不敏感，且易于復(fù)發(fā)，而基于膜蛋白質(zhì)組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)了其表面的抗原或治療靶點(diǎn)，為GSCs的治療提供了新的放向[54]。對(duì)于染色體復(fù)雜易位的多發(fā)性骨髓瘤，t（4,14）異常的比例約占該類腫瘤的10～20%，針對(duì)該位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞膜表面的標(biāo)志物，隨后可有目的的設(shè)計(jì)小分子藥物或抗體，Zhi等研究了骨髓瘤細(xì)胞KMS11和敲低該基因的KMS11細(xì)胞的膜蛋白質(zhì)組學(xué)，發(fā)現(xiàn)了50個(gè)差異表達(dá)的膜蛋白，其中SLAMF7可以作為治療該腫瘤的藥物設(shè)計(jì)靶點(diǎn)[55]。通過(guò)比較人正常粒細(xì)胞與5種骨髓性白血病瘤細(xì)胞系膜蛋白的差異，在320個(gè)膜蛋白中，CD166/ALCAM蛋白在這5種腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)明顯增加，據(jù)此將多米卡新（duocarmycin）作為治療藥物，取得了較好的抗腫瘤效果[23]。

2.3 關(guān)于膜蛋白質(zhì)組學(xué)的其它應(yīng)用研究

外泌體是由多數(shù)細(xì)胞（包括細(xì)菌、真核生物等）所分泌的，一般為納米尺寸的微型囊泡膜結(jié)構(gòu)，發(fā)揮免疫調(diào)控、血管生成、細(xì)胞遺傳物質(zhì)和功能蛋白的轉(zhuǎn)移等功能，特別是其表面的膜蛋白參與了多種病理生理過(guò)程，是疾病檢測(cè)及治療的重要靶點(diǎn)[56]。Choi等研究了由銅綠假單胞菌（Pseudomonas putida）KT2440所產(chǎn)生的外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)，鑒定出了其表面的膜蛋白（OprC、OprD、OprE、OprF、OprH、OprG、OprW），該外泌體對(duì)培養(yǎng)的人來(lái)源肺細(xì)胞無(wú)明顯的毒性作用，可以作為治療藥物或抗體的載體以治療某些人類疾病[57]。

人們應(yīng)用膜蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)了很多有趣的現(xiàn)象，Van等研究不同腸段的膜蛋白差異，結(jié)果顯示多數(shù)膜蛋白在整個(gè)腸段的表達(dá)較穩(wěn)定，一些與細(xì)菌感應(yīng)（bacterial sensing）、陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)（cation transport）、O-糖基化（O-glycosylation）相關(guān)的蛋白的表達(dá)量從腸的近端至遠(yuǎn)端逐漸降低，而與微生物防御（microbial defense）和陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)（anion transport）相關(guān)蛋白的表達(dá)量卻逐漸增加[58]。通過(guò)研究分化和未分化HepaGR細(xì)胞的膜蛋白質(zhì)組學(xué)，發(fā)現(xiàn)了一些與乙肝病毒（HBV）感染相關(guān)的膜蛋白，為防止HBV感染提供了新的治療靶點(diǎn)[59]。Waeowalee等研究了小鼠嗅覺(jué)上皮細(xì)胞的纖毛膜蛋白，鑒定出了62個(gè)嗅覺(jué)受體蛋白，首次在嗅球纖毛中發(fā)現(xiàn)了NCKX2蛋白，進(jìn)一步研究指出4個(gè)膜聯(lián)蛋白ANXA1、ANXA2、ANXA5、S100A5參與了嗅覺(jué)的信號(hào)傳導(dǎo)[60]。Wang等研究了人晶狀體纖維細(xì)胞的膜蛋白及膜磷酸化蛋白，鑒定出的951個(gè)蛋白中有379個(gè)蛋白為跨膜蛋白或膜相關(guān)蛋白，這些蛋白參與了物質(zhì)代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及肌動(dòng)蛋白的調(diào)節(jié)；在TiO2富集的膜磷酸化蛋白中，在271個(gè)膜蛋白中找到了855個(gè)磷酸化位點(diǎn)，有455個(gè)磷酸化位點(diǎn)屬于首次被發(fā)現(xiàn)，PKA、PKC、CKII、p38MAPK、RSK為主要的磷酸化激酶[61]。

Liu等研究了腎臟血管內(nèi)皮的膜蛋白質(zhì)組學(xué)，他們先用灌流液灌流動(dòng)物腎臟，再注入二氧化硅納米顆粒的膠體溶液，從而富集到腎血管內(nèi)皮的細(xì)胞膜蛋白，此法共鑒定出了582個(gè)腎血管內(nèi)皮細(xì)胞的膜蛋白及1205個(gè)腎降解蛋白，包括16個(gè)內(nèi)皮標(biāo)志性蛋白（asintegrin beta-1、intercellular adhesion molecule-2(ICAM-2)等），8個(gè)新的內(nèi)皮標(biāo)志性蛋白（如Deltex 3-like protein、PICALM等）[62]。針對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的膜蛋白，Matta等以Triton X-114為溶劑進(jìn)行不同溫度下的兩相膜蛋白提取，結(jié)果指出，CD276、S100-A6、VDAC異構(gòu)體蛋白是該細(xì)胞的標(biāo)志性膜蛋白[63]。

3 展望與不足

近年來(lái)，為了增加膜蛋白的鑒定數(shù)目、增加定量的可靠性、縮短樣品的前處理時(shí)間，人們開(kāi)發(fā)了一些新的方法。被文獻(xiàn)稱之為Short GeLC-SWATH的方法，與膠內(nèi)裂解相比，處理時(shí)間大大縮短，但鑒定出的膜蛋白數(shù)目并不少，與SWATH數(shù)據(jù)采集方式相結(jié)合，提高了膜蛋白定量的重復(fù)性[64]。Zhou等采用了一種集膜蛋白提取、酶解、分組為一體的“Centrifugal Proteomic Reactor”，將該裝置用到大鼠肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體膜蛋白的鑒定中，發(fā)現(xiàn)了至少800種以往很難被鑒定到的膜蛋白[17]。Christoforou報(bào)道了一種被稱為hyperLOPIT的方法，該法基于蛋白的TMT標(biāo)記，肽段被碎裂后再同時(shí)選擇10個(gè)該肽段的二級(jí)碎片離子進(jìn)一步碎裂，用MS3的TMT標(biāo)簽進(jìn)行定量，與傳統(tǒng)的TMT MS2定量相比，可以達(dá)到傳統(tǒng)MS2定量的靈敏度，但消除了離子的抑制效應(yīng)，定量的準(zhǔn)確度大幅提高[65]。

基于質(zhì)譜的非依賴性數(shù)據(jù)采集（DIA）、多反應(yīng)監(jiān)測(cè)或選擇粒子監(jiān)測(cè)（MRM/SRM）、平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)（PRM）等蛋白的定量方法同樣適用于膜蛋白的定量[66,67]，如用SRM質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集的方式研究細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)體的含量變化，Qiu等概述了該法的詳細(xì)流程及要點(diǎn)[68]，隨著質(zhì)譜的廣泛應(yīng)用，基于質(zhì)譜的蛋白定量技術(shù)有望成為Western Blot檢測(cè)蛋白的替代技術(shù)。

基于質(zhì)譜的Shotgun膜蛋白質(zhì)組學(xué)還存在一些問(wèn)題，如非膜成分的污染、富集過(guò)程相對(duì)復(fù)雜、蛋白覆蓋度低、實(shí)驗(yàn)室間定量結(jié)果的可重復(fù)性差；還需要額外的手段（如：進(jìn)一步的富集）才能同時(shí)研究膜蛋白的糖基化、磷酸化等翻譯后修飾；另外，由于存在一定的假陽(yáng)性率，鑒定出的膜蛋白還需采用免疫共沉淀、Western Blot等手段進(jìn)行佐證。相信隨著儀器分析技術(shù)、生物信息學(xué)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、化學(xué)生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，基于質(zhì)譜的膜蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)也會(huì)進(jìn)一步縱向發(fā)展，解決更多的與膜蛋白相關(guān)的生命難題。