丁文波 楊 璐 宮兆奇 李明欣

(丹東市中心醫(yī)院骨外一科，遼寧 丹東 118000)

糖皮質(zhì)激素(以下簡稱“激素”)的過度使用，所造成的副作用是極其嚴重的。臨床上將該類由激素引起的股骨頭壞死統(tǒng)稱為激素性股骨頭壞死(SANFH)〔1〕。目前，SANFH機制尚無統(tǒng)一的結論，研究發(fā)現(xiàn)，使用激素處理成骨細胞及骨細胞可促進其凋亡，從而導致骨細胞數(shù)量減少，最終引起股骨頭壞死〔2〕。激素可能通過結合成骨細胞、破骨細胞及骨細胞的表面受體，從而調(diào)控細胞核內(nèi)某些基因轉(zhuǎn)錄和翻譯〔3〕。持續(xù)使用激素數(shù)周可顯著促進小鼠體內(nèi)成骨細胞凋亡，同時也可引起大量的皮質(zhì)骨干骺端的骨細胞凋亡，該凋亡過程可能是由于激素誘導了凋亡相關基因的表達〔4〕。他汀類藥物除降脂功能外，其抗感染作用，清除自由基，抗氧化作用，促血管生成及修復血管內(nèi)皮功能等功效也被廣泛報道〔5〕。他汀類藥物可以通過提高骨細胞中骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)2的表達以促進成骨作用，并降低破骨細胞的活性〔6，7〕；還可以通過抑制激素誘導的骨髓基質(zhì)干細胞的成脂化，最終促進成骨分化〔8〕。輔酶Q10又稱作癸烯醌、泛醌和維生素Q10，可以參與線粒體氧化磷酸化和ATP的產(chǎn)生，調(diào)控細胞氧化還原的環(huán)境；也可以在電子穿膜過程中攜帶還原電子進入囊泡內(nèi)或帶出到胞外，并參與內(nèi)膜和質(zhì)膜之間的質(zhì)子梯度的形成〔9，10〕。此外，在病變組織中加入外源性輔酶Q10，可有效緩解組織中輔酶Q10 缺乏的狀態(tài)，并且可以維持細胞膜上離子通道的完整，進而使細胞膜結構保持穩(wěn)定；同時輔酶Q10的脂溶特性還可以使其通過血腦屏障，抑制脂質(zhì)造成的細胞過氧化損傷，進而減少細胞凋亡〔11，12〕。本文擬分析輔酶Q10發(fā)揮輔助辛伐他汀治療兔SANFH的作用及可能機制。

1 資料與方法

1.1試劑及藥物 輔酶 Q10(30 mg/片，能氣朗)購自衛(wèi)才藥業(yè)有限公司，地塞米松磷酸鈉注射液購自焦作福瑞堂制藥有限公司，乙二胺四乙酸(EDTA)-Tris 緩沖液(100 g/L)購自上海士鋒生物科技有限公司，辛伐他汀分散片(辛可)購自廣州市南新制藥有限公司，0.9%氯化鈉注射液(250 ml)購自四川科倫藥業(yè)股份有限公司，10%中性甲醛溶液(0.1 mol/L，pH7.4)購自上海哈靈生物科技有限公司。

1.2構建兔SANFH模型 將健康成年新西蘭大白兔隨機分成空白對照組15 只和實驗組60只。向?qū)嶒灲M兔雙側(cè)臀大肌以20 mg/kg劑量左右交替注射地塞米松磷酸鈉，1次/w，持續(xù)6 w制備兔SANFH模型。6 w后將造模成功的45只兔隨機分成模型組、辛伐他汀組和辛伐他汀聯(lián)合輔酶Q10組各15只。分組方案及給藥情況如下：對照組左右交替通向大白兔雙側(cè)臀大肌注射0.9%氯化鈉注射液；注射6 w后用蒸餾水灌胃。造模成功后，模型組蒸餾水灌胃。辛伐他汀組以辛伐他汀10 mg·kg-1·d-1灌胃治療。辛伐他汀聯(lián)合輔酶Q10組以辛伐他汀 10 mg·kg-1·d-1和輔酶 Q10 30 mg/kg灌胃給藥。灌胃8 w后進行一系列實驗。

1.3一般情況觀察及骨細胞凋亡檢測 觀察記錄各組兔體重、精神狀況、飲食狀況及毛發(fā)變化(如光澤度)，為了避免兔子雙腿的負重，應適當降低飼養(yǎng)籠中飲水及飼料的高度，以有利于股骨頭壞死的治療。處死兔后，術區(qū)消毒、剪毛，逐層分離暴露髖關節(jié)嚢，切開關節(jié)嚢后取下股骨頭。之后對去除的股骨頭進行解剖，對股骨頭形態(tài)，光澤及軟骨顏色進行觀察。骨細胞凋亡的檢測采用原位末端標記法(TUNEL)。將組織切片染色后，當胞核出現(xiàn)黃色顆粒，即凋亡細胞，圖中以綠色熒光表示。

1.4實驗兔血清乳酸(LA)含量的測定 使用商業(yè)化試劑盒(購自武漢艾美捷科技有限公司)，嚴格按照廠商說明書中的步驟進行測定。

1.5實驗兔血清超氧化物歧化酶(SOD )活性的測定 使用商業(yè)化試劑盒(購自武漢艾美捷科技有限公司)，嚴格按照廠商說明書中的步驟進行測定。

1.6實時定量PCR測定BMP2的基因表達 組織剪碎至EP管，Trizol試劑法提取總RNA。最后用75%乙醇洗滌總RNA兩次，自然晾干，用焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解。紫外分光光度計測定A260/A280的比值，在1.8～2.1范圍內(nèi)視為總RNA純度較高，可以使用。反轉(zhuǎn)錄用 TaKaRa PrimeScript 試劑盒的 SYBR GreenAssay根據(jù)廠家說明書進行。反應體系如下：2 μl 5×PrimeScript緩沖液，Prime Script RT Enzyme，Oligo dT Primer和Random 6mers 各0.5 μl，總 RNA 定量到500 ng，加入不含RNase的雙蒸水，得到的終體系為10 μl。然后用得到的cDNA為模板采用 7300 Real-time PCR 系統(tǒng)進行實時定量PCR檢測。反應體系為：2 μl cDNA模板，上游引物和下游引物各0.5 μl，5 μl 2×混合緩沖液和2 μl雙蒸水。以2-ΔΔCt值進行結果分析其中ΔCt=Ct 基因-Ct內(nèi)參。

1.7Western印跡法測定BMP2蛋白及天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3的表達 向各組樣品中分別加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑，提取總蛋白后，使用BCA蛋白定量試劑盒(購自上海碧云天生物科技有限公司)進行蛋白濃度的測定，之后每個樣品中加入上樣緩沖液，沸水浴10 min使蛋白變性，然后進行下游實驗或放置-20℃儲存?zhèn)溆?。將上述所得樣品用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，然后將樣品轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。隨后將膜放入含有5%脫脂奶粉的Tween-20 Tris-磷酸鹽緩沖液(PBST)中，置于搖床室溫封閉2 h；之后用PBST洗膜3次，每次10 min。加一抗4℃搖床過夜(一抗溶于封閉液，1∶300稀釋)；第二天，Tween-20 Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h候，加入電化學發(fā)光(ECL)顯色液(購自上海碧云天生物科技有限公司)進行顯色。

1.8統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1一般情況及骨細胞凋亡檢測結果 對照組兔無異常表現(xiàn)，體重逐漸增加，反應較為靈敏，精神狀態(tài)好，飲食一切正常，毛發(fā)光澤度好。模型組兔明顯處于病態(tài)，反應較遲鈍，精神狀態(tài)萎靡不振，不喜歡行動，毛發(fā)光澤度差。辛伐他汀組兔實驗初期與模型組狀況類似，灌胃4 w后，活動量和體重均增加，精神狀態(tài)恢復，反應較靈敏，走路姿勢呈好轉(zhuǎn)趨勢，毛發(fā)光澤度好，脫落較少。辛伐他汀聯(lián)合輔酶Q10組情況較辛伐他汀組更好，治療效果更明顯。對照組兔股骨頭外形始終光滑完整，顏色正常；模型組兔股骨頭總體形態(tài)完整，但表面不光滑，色澤較暗，呈灰白色；辛伐他汀組兔股骨頭表面完整，基本光滑，顏色接近正常；辛伐他汀聯(lián)合輔酶Q10組較辛伐他汀組更好。對照組無顯著骨細胞凋亡，模型組細胞凋亡較多，辛伐他汀聯(lián)合輔酶Q10組及辛伐他汀組均有不同程度凋亡，但較模型組均有顯著改善；辛伐他汀聯(lián)合輔酶Q10組較辛伐他汀組更好，見圖1。

2.2SOD活性 和對照組相比，灌胃8 w后模型組SOD活性明顯降低，辛伐他汀組和辛伐他汀聯(lián)合輔酶Q10組較模型組SOD活性顯著增高，辛伐他汀聯(lián)合輔酶Q10組效果比辛伐他汀組顯著(P<0.05)，見表1。

2.3LA含量 和對照組相比，灌胃8 w后模型組LA明顯升高，辛伐他汀組和辛伐他汀聯(lián)合輔酶Q10組較模型組LA含量顯著降低，辛伐他汀聯(lián)合輔酶Q10組比辛伐他汀組更顯著(P<0.05)，見表2。

圖1 各組骨細胞凋亡檢測(×400)

表1 各組各時段SOD活性

與對照組相比：1)P<0.05；與模型組相比：2)P<0.05；與辛伐他汀組相比：3)P<0.05；表2同

表2 各組各時段LA含量

2.4BMP2 mRNA和蛋白水平 和對照組(1.0±0.1、1.5±0.4)相比，模型組BMP2 mRNA水平(0.4±0.1)和蛋白水平(0.9±0.2)明顯降低，辛伐他汀組(1.0±0.2、1.1±0.2)和辛伐他汀聯(lián)合輔酶Q10組BMP2 mRNA(0.8±0.1)和蛋白水平(1.3±0.2)顯著增加，辛伐他汀聯(lián)合輔酶Q10組效果比辛伐他汀組顯著(P<0.05)，見圖2。

2.5Caspase-3蛋白水平 和對照組(0.2±0.1)相比，模型組Caspase-3蛋白水平(0.8±0.2)明顯升高；辛伐他汀組(0.4±0.1)和辛伐他汀聯(lián)合輔酶Q10組Caspase-3蛋白水平(0.6±0.2)較模型組顯著降低，辛伐他汀聯(lián)合輔酶Q10組效果比辛伐他汀組顯著(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組BMP2與Caspase-3蛋白水平

3 討 論

股骨頭壞死是在一種骨科常見的對髖關節(jié)具有特殊破壞性的病變，一般來說，其病程較長，再加上其發(fā)病機制尚不明確，導致治療效果差，患者的致殘率很高。目前手術的方法很多，如帶血管蒂的排骨移植〔13〕、髓芯減壓〔13〕、血管束植入和表面置換〔14，15〕等，均可以取得一定療效，但都不可以徹底治療。

SANFH是股骨頭壞死的一個常見類型，該病往往以局部股骨頭的骨髓壞死及骨小梁破壞作為其基本臨床特征〔1〕，而這種現(xiàn)象的原因主要是由于濫用激素引起的股骨頭局部區(qū)域的供血障礙。目前，對于其發(fā)病機制的認識主要有以下幾種可能：細胞凋亡學說：有學者認為激素可以通過促進成骨細胞和骨細胞凋亡，引起骨細胞數(shù)量減少進而導致股骨頭壞死。而細胞凋亡信號的激活進一步引起細胞內(nèi)各種信號通路的激活，最終導致細胞的各種生物學行為的紊亂，從引起繼發(fā)性組織損傷〔4〕；間充質(zhì)干細胞(MSC)脂肪分化學說：MSC是一種最常見的干細胞，其具有包括成骨、成脂肪、成軟骨等多向分化潛能，Yin 等〔16〕從分子生物學角度證實了，激素可以誘導MSC向脂肪定向分化，而這樣的結果可能導致患者骨內(nèi)壓增加進而引起股骨頭壞死；而Wang等〔17〕的結果也證實導致股骨頭壞死的重要原因是激素誘導的MSC成脂分化。外源性輔酶Q10 能減少由于細胞脂質(zhì)過氧化損傷引起的細胞凋亡〔11，12〕。本研究表明，輔酶Q10可以輔助辛伐他汀緩解兔股骨頭壞死，但相應機制還不清楚。本文結果和關于輔酶Q10功能的報道一致〔9，10〕。研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥在體外及大鼠和小鼠體內(nèi)都可促進新骨生成并伴有BMP2表達的增加〔7〕。本文結果和關于輔酶Q10抑制凋亡的報道一致〔11，12〕。

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