馮 敏 劉 剛 徐大千

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科，河南 鄭州 450052)

膿毒癥是一種具有全身性的炎癥反應(yīng)綜合征，起病急，發(fā)展迅速，致死率高，常并發(fā)于嚴重創(chuàng)傷、燒傷、感染及大手術(shù)等多種應(yīng)激狀況，可誘發(fā)多器官病變，成為目前臨床急危重癥患者主要的死亡原因之一。約有17%的膿毒癥病人會并發(fā)急性腎衰竭，損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，發(fā)生電解質(zhì)紊亂，導致尿毒癥性肺部炎癥，最終引起呼吸衰竭、死亡〔1,2〕。膿毒癥的突出特征是炎癥反應(yīng)與抗炎反應(yīng)失控。白細胞介素(IL)-6、CD14、IL-18在膿毒癥發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用，參與免疫和炎性反應(yīng)的調(diào)控，可誘導急性期蛋白的合成，誘導炎癥反應(yīng)〔3～10〕。目前有關(guān)參附注射液對膿毒癥方面的研究報道較少。本實驗研究參附注射液對膿毒癥大鼠腎臟的保護作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品與試劑 烏司他丁注射液，廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，批號：國藥準字H20040506。尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)及谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)生化試劑(德國Prodia公司)，IL-6、CD14、IL-18試劑盒(美國Biosource公司),β2-免疫分析盒(北方生物技術(shù)研究所)，參附注射液(每毫升相當于生藥：紅參0.1 g，附片0.2 g，雅安三九藥業(yè)有限公司)。

1.1.2動物 健康雄性SD大鼠136只，購于廣東藥學院實驗動物中心，SPF級，體質(zhì)量(350±20)g，許可證號SCXK(粵)2015-0022。本實驗操作過程中及實驗結(jié)束后，對各大鼠的處理方法均符合2006年中華人民共和國科學技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2方法

1.2.1膿毒癥大鼠模型制備與分組 膿毒癥大鼠模型的制備方法參照文獻〔11～14〕：造模前SD大鼠禁食12 h，以7.5 mg/100 g鹽酸氯胺酮和2.0 mg/100 g賽拉嗪腹腔注射進行麻醉，固定于無菌操作臺上，用碘酊進行常規(guī)消毒，沿中下腹正中線進行1.5 cm切口，在大鼠盲腸中部進行結(jié)扎，用16號針貫穿盲腸一次(為防止針孔閉合，留一條橡皮片貫通盲腸)，將盲腸還納腹腔，縫合切口。術(shù)后立即注射5 ml 0.9%生理鹽水，放回鼠籠，自由飲食。

分為正常組(不作任何處理，n=8)，假手術(shù)組(不結(jié)扎不穿孔，只于相同部位進行切口及盲腸提出后再放回,n=8)，模型組(膿毒癥大鼠，n=40)，參附注射液中劑量組(膿毒癥大鼠，n=40)，參附注射液低、高劑量組(膿毒癥大鼠，n=8)，陽性藥組(膿毒癥大鼠，n=40)；前2組勻于尾靜脈注射等量生理鹽水，模型組于術(shù)后0、12、24、36、48 h經(jīng)尾靜脈注射等量生理鹽水，參附注射液中劑量組于相同時間點經(jīng)大鼠尾靜脈注射參附注射液，每次劑量4 ml/kg(參考臨床劑量)，低劑量組每次注射劑量為2 ml/kg，高劑量組每次注射劑量為6 ml/kg，陽性藥組于相同時間點經(jīng)大鼠尾靜脈以100 000 U/kg注射烏司他丁注射液；模型組與參附注射液組分別于各時間隨機取8只，采集標本。

1.2.2標本的采集與處理 SD大鼠麻醉、消毒后，無菌條件下開腹，剝離暴露出腹主動脈，采集腹主動脈血約5 ml，置于離心試管中，3 000 r/min低溫高速離心10 min，取上層清液，于-80℃冰箱中保存，用于血清生化指標的測定；同樣無菌操作下摘取腎組織，于-80℃冰箱中保存，用于組織形態(tài)學觀察；用2 ml注射器從膀胱采集尿液，于-80℃冰箱中保存。

1.2.3血清及尿液中生化指標的測定 利用自動生化分析儀測定血清中Cr、BUN、ALT、K+及尿液中N-乙酰β-D-葡萄糖苷酶(NAG)、Na+含量，計算尿鈉排泄分數(shù)(FENa)。

1.2.4血清中IL-6及腎組織中IL-6、CD14、IL-18蛋白含量檢測 將腎組織從-80℃冰箱中取出，稱重后置于EP管中，加入15倍生理鹽水，用勻漿器勻漿，以1 400 r/min低溫離心15 min，吸取上清液；從冰箱中取出血清，于室溫融化，采用Bio-rad蛋白檢測試劑盒測定提取蛋白，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測腎組織和血清中的IL-6、CD14、IL-18蛋白含量。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS16.0統(tǒng)計，計量資料進行t檢驗、方差分析及相關(guān)回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1各組腎功能指標比較 與正常組相比，模型組從12 h開始血清中BUN明顯升高(P<0.01)，雖然36 h呈現(xiàn)明顯降低，但到48 h又再次顯著升高(P<0.01)；同樣，與正常組比較，36 h和48 h模型組血清ALT顯著增加(P<0.05)；相較于血清中的BUN及ALT，大鼠血清中Cr含量增加緩慢，在48 h才表現(xiàn)出明顯增加(P<0.05)。與模型組比較，膿毒癥大鼠經(jīng)各劑量參附注射液治療12 h和48 h后，血清中BUN顯著降低(P<0.05)，治療36 h和48 h后血清中ALT顯著降低(P<0.05)，而Cr雖也有所降低，但降低緩慢，于48 h后才明顯降低(P<0.05)；與陽性藥組比較，參附注射液各劑量治療后效果明顯優(yōu)于陽性藥組。給藥48 h，參附注射液低劑量組治療效果最差，與中、高劑量組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明有一定的劑量依賴性，而中、高劑量組間相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明達到一定劑量后對治療并沒有表現(xiàn)出明顯的效果。與正常組相比，48 h后模型組血清中的K+含量明顯增加(P<0.05)；12 h后模型組血清β2微球蛋白明顯升高(P<0.01)，但48 h后顯著降低(P<0.01)。尿液指標檢測顯示，與正常組相比，12～36 h模型組的FENa均呈現(xiàn)降低(P<0.01)；而同時間點模型大鼠尿NAG含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與模型組相比，參附注射液各劑量組治療12 h后大鼠血清β2微球蛋白降低(P<0.01)，而治療組12～48 h FENa及NAG含量并沒有明顯變化；與陽性藥組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。不同給藥劑量數(shù)據(jù)結(jié)果分析，給藥48 h，參附注射液低劑量組治療效果與中、高劑量組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明有一定的劑量依賴性，而中、高劑量組間相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明達到一定劑量后對治療并沒有表現(xiàn)出明顯的效果。見圖1，圖2。

圖1 各組大鼠腎功能血清指標檢測結(jié)果

2.2各組IL-6蛋白水平比較 正常組與假手術(shù)組大鼠血清中均含有少量IL-6，組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。造模成功后12 h，與正常組相比，模型大鼠血清中IL-6蛋白表達水平明顯增加(P<0.05)，24 h達到最高(P<0.01)，而至36 h血清中IL-6蛋白表達水平下降顯著，接近于正常組，但48 h又明顯升高(P<0.01)；模型組腎臟組織中IL-6蛋白表達水平從12～36 h有緩慢升高表現(xiàn)，與正常組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而至48 h又下降至與正常組持平水平。與模型組相比，參附注射液治療后，各劑量組12～48 h大鼠血清中IL-6蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，12 h腎臟組織中IL-6水平卻無顯著變化，而24～36 h腎臟組織中IL-6蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)；膿毒癥大鼠經(jīng)參附注射液治療后，效果明顯優(yōu)于陽性藥組。參附注射液具有一定的劑量依賴性，且中、高劑量組間相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明達到一定劑量后對治療并沒有表現(xiàn)出明顯的效果。見圖3。

2.3各組腎臟組織中CD14、IL-18蛋白相對含量比較 模型組腎臟組織中CD14蛋白表達水平最高，而陽性組與參附注射液各劑量組腎臟組織中CD14蛋白表達水平與模型組相比明顯降低(P<0.01)。與對照組相比，模型組IL-18蛋白表達水平明顯增高(P<0.01)；與模型組相比，參附注射液高、中、低組腎臟組織中IL-18蛋白表達水平明顯減少(P<0.01)。見圖4。

圖2 各組大鼠腎功能尿液指標檢測結(jié)果

圖3 各組大鼠IL-6蛋白水平的檢測結(jié)果

圖4 大鼠腎臟組織中CD14、IL-18蛋白相對含量

3 討 論

炎癥反應(yīng)是引起多器官功能障礙的主要因素，炎細胞的持續(xù)活化與播散導致炎癥介質(zhì)過多產(chǎn)生與釋放，引起細胞乃至臟器損傷，嚴重者導致多臟器衰竭。研究顯示，通過激活炎癥因子可導致核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB活化入核，引起IL-6，IL-18等炎癥因子的合成與釋放。參附注射液由紅參、附子組成，人參皂苷和烏頭堿為主要活性成分，具有溫陽益氣養(yǎng)心、回陽救逆的藥效。研究顯示，參附注射液對膿毒癥患者或動物具有一定的改善及保護作用，調(diào)節(jié)膿毒癥免疫紊亂及維持機體炎癥平衡〔15,16〕。膿毒癥可引起多種器官損傷，腎臟損傷是其常引起的并發(fā)癥，本研究結(jié)果顯示，參附注射液對膿毒癥炎癥大鼠腎臟具有明顯的保護作用，其通過抑制血清與腎組織中的IL-6、CD14、IL-18蛋白表達水平，抑制炎癥因子的釋放，實現(xiàn)參附注射液對膿毒癥大鼠的腎臟保護作用。

1Mongardon N,Bouglé A,Geri G,etal.Pathophysiology and management of post-cardiac arrest syndrome〔J〕.Ann Fr Anesth Reanim,2013;32(11):779-86.

2Dellinger RP,Levy MM,Rhodes A.Surviving sepsis campaign:international guidelines for management of severe sepsis and septic shock:2012〔J〕.Crit Care Med,2013;41(2):580-637.

3Dejager L,Pinheiro I,Dejonckheere E.Cecal ligation and puncture:the gold standard model for polymicrobial sepsis〔J〕?Trends Microbiol,2011;19(4):198-208.

4Wu HP,Shih CC,Lin CY.Serial increase of IL-12 response and human leukocyte antigen-DR expression in severe sepsis survivors〔J〕.Crit Care,2011;15(5):R224.

5黃 慧,傅應(yīng)云,齊 暉.IL-6、IL-18和TPO等指標對預測膿毒癥預后的意義〔J〕.中國醫(yī)藥指南,2013;24:621.

6Peng Z,Pai P,Hong-Bao L,etal.The impacts of continuous veno-venous hemofiltration on plasma cytokines and monocyte human leukocyte antigen-DR expression in septic patients〔J〕.Cytokine,2010;50(2):186-91.

7項文娜,黃雨茅,吳 亮.早產(chǎn)兒感染診斷中檢測白介素-6、白介素-8、白介素-10的臨床價值〔J〕.中國醫(yī)刊，2013;48(5):91-2.

8Zeitlinger M,Marsik C,Steiner I.Immunomodulatory effects of fosfomycin in an endotoxin model in human blood〔J〕.J Antimicrob Chemother,2007;59(2):219-23.

9Mostafa Anower AK,Shim JA,Choi B,etal.Pretreatment with interleukin-6 small interfering RNA can improve the survival rate of polymicrobial cecal ligation and puncture mice by down regulating interleukin-6 production〔J〕.Eur J Pharmacol,2012;688(1-3):76-83.

10Li S,Bao HG,Han L,etal.Effects of adiponectin on mortality and its mechanism in a sepsis mouse model〔J〕.J Invest Surg,2012;25(4):214-9.

11Ozdemir S,Toplan S,Tanriverdi G.The effects of β-glucan on iron levels and lipid peroxidation in intra- abdominal sepsis in rats〔J〕.Gen Physiol Biophys,2011;30(2):138-44.

12Coelho CW,Jannig PR,Souza AB.Exercise training prevents skeletal muscle damage in an experimental sepsis model〔J〕.Clinics (Sao Paulo),2013;68(1):107-14.

13Morel J,Li JY,Eyenga P.Early adverse changes in liver microvascular circulation during experimental septic shock are not linked to an absolute nitric oxide deficit〔J〕.Microvasc Res,2013;90:187-91.

14Gille-Johnson P,Smedman C,Gudmundsdotter L,etal.Circulating monocytes are not the major source of plasma cytokines in patients with sepsis〔J〕.Shock,2012;38(6):577-83.

15江榮林,雷 澍,王靈聰,等.參附注射液對重度膿毒癥患者組織氧代謝的影響〔J〕.中華中醫(yī)藥雜志,2009;(7):965-7.

16邱澤亮,葉一萍,張 寧,等.參附注射液對嚴重膿毒癥免疫調(diào)節(jié)的前瞻性研究〔J〕.中華中醫(yī)藥學刊,2012;(2):363-6.