姚 瑤,霍元鵬,周 偉,葉佳穎,褚夢(mèng)真,朱森林,蔣紅英

(1.浙江師范大學(xué) 地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004;2.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院 農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院,浙江 金華 321007)

β-葡萄糖苷酶可水解結(jié)合在末端的非還原性β-D-葡萄糖苷鍵,同時(shí)釋放出葡萄糖體和配基[1],具有良好的增香釀造潛力[2],其在工業(yè)化制備、改善飲品風(fēng)味和酶解工程固化回收處理方面發(fā)揮重要的作用。然而天然酶活性較低往往阻滯了其大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。國(guó)內(nèi)外用于研究的β-葡萄糖苷酶主要來源于微生物,這與來源于植物的β-葡萄糖苷酶活性不高、穩(wěn)定性差、產(chǎn)量較低有關(guān)[3-4]。目前對(duì)β-葡萄糖苷酶的微生物來源研究較多[5-6],但不同微生物合成β-葡萄糖苷酶的能力有差異[7]；Wilkowska A等[8]也指出β-葡萄糖苷酶的活力普遍很低,產(chǎn)量不高。因此,尋找一種新的高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的真菌是極其必要的。

目前多數(shù)研究的采土樣點(diǎn)較為單一,對(duì)同一環(huán)境中不同地理位置的研究不多。本研究使用七葉苷平板法[9]對(duì)不同地區(qū)以及不同海拔高度的腐殖質(zhì)土壤中β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌進(jìn)行了篩選,考察了不同生長(zhǎng)環(huán)境中菌株產(chǎn)酶能力的差異,得到了β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌,并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到了利于產(chǎn)酶、成本較低、具有較大利用價(jià)值的培養(yǎng)基配方,可為β-葡萄糖苷酶的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌種來源:在金華曹宅山下洪村桔園以及金華北山不同海拔高度處采集長(zhǎng)期堆放稻草或覆蓋樹葉的地下5～25 cm土壤,從中分離篩選產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株。初篩培養(yǎng)基為孟加拉紅富集培養(yǎng)基[10];復(fù)篩培養(yǎng)基為剛果紅CMC-Na(羧甲基纖維素鈉)瓊脂培養(yǎng)基[11];發(fā)酵產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組分為麩皮4.0%、(NH4)2SO40.2%、NH4NO30.2%、MgSO4·7H2O 0.05%、KH2PO40.1%，pH自然,于121 ℃滅菌20 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的篩選

1.2.1.1 土樣的富集、分離及純化 取10 g土樣置于250 mL裝有小玻璃珠的三角瓶中,加入90 mL無菌水,于120 r/min轉(zhuǎn)速下振蕩10 min；在無菌環(huán)境下取0.1 mL的懸液涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基中,觀察微生物的長(zhǎng)勢(shì)；培養(yǎng)24 h后，從孟加拉紅培養(yǎng)基中挑取長(zhǎng)勢(shì)較好的菌株,在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基中進(jìn)行多次劃線分離，直至得到幾種不同的純化菌株。

1.2.1.2 目的菌株的初篩與復(fù)篩 將純化的菌株在28 ℃下培養(yǎng)3 d,向每個(gè)平板倒入20 mL剛果紅溶液(1 mg/mL),染色30 min后用1 mol/L NaCl溶液進(jìn)行反復(fù)洗滌,測(cè)量透明圈和菌落的直徑并計(jì)算兩者的比值；選擇兩者比值大的菌落直接進(jìn)行麥麩誘導(dǎo)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩,在28 ℃和轉(zhuǎn)速200 r/min的發(fā)酵條件下培養(yǎng)5 d[12]。

1.2.1.3 粗酶液的制備及酶活力的測(cè)定 將目的菌株在28 ℃培養(yǎng)5 d后的發(fā)酵培養(yǎng)液以13000 r/min離心20 min,收集得到的上清液即為粗酶液。取0.5 mL經(jīng)過適當(dāng)倍數(shù)稀釋的酶液,加入1.5 mL CMC-Na溶液，于40 ℃保溫30 min,再加入1.5 mL DNS試劑顯色,沸水浴煮沸5 min,冷卻后稀釋至25 mL,于540 nm處測(cè)OD值；以加熱滅活(100 ℃,5 min)的酶液按照同樣方法作空白處理。在上述條件下定義1 mL酶液1 min水解產(chǎn)生1 μmol葡萄糖的酶活力為一個(gè)酶活單位(IU/mL)，其計(jì)算公式如下:酶活力(IU/mL)=[葡萄糖含量(mg)×稀釋倍數(shù)×5.56]/[反應(yīng)液中酶液加入量(mL)×反應(yīng)時(shí)間(min)]。

1.2.2 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株液體發(fā)酵條件的優(yōu)化 分別對(duì)兩株菌株的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化(表1)。通過3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測(cè)定菌株所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的活力，從而確定菌株產(chǎn)酶的最佳條件。

在培養(yǎng)基優(yōu)化過程中,還需著重考慮培養(yǎng)基所用原材料的來源渠道、價(jià)格高低、質(zhì)量穩(wěn)定性等因素,將培養(yǎng)基優(yōu)化至最優(yōu)條件。

表1 菌株產(chǎn)酶條件優(yōu)化時(shí)相關(guān)參數(shù)設(shè)置

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的篩選

2.1.1 高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的初篩和復(fù)篩 經(jīng)過初篩和復(fù)篩,有14株菌株在篩選培養(yǎng)基上產(chǎn)生菌落。將這些菌株分別接種于剛果紅培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d,利用剛果紅染色法[13]篩選得到H2的透明圈直徑與菌落直徑比值(HC值)最高,H5次之(表2)。用DNS法測(cè)定產(chǎn)酶活力，得知H2和H5的初始酶活力居前2位,分別為0.026和0.023 IU/mL,這兩個(gè)菌株都來源于洪村桔園土壤。因此,本實(shí)驗(yàn)選用H2和H5作為進(jìn)一步發(fā)酵培養(yǎng)的研究對(duì)象。

2.1.2 目的菌株的鑒定 目的菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng),生長(zhǎng)很快,菌落起初為白色,圓形,背面褐色,培養(yǎng)5～7 d后直徑可達(dá)2.5～2.8 cm。菌株在分離純化培養(yǎng)皿上菌絲體產(chǎn)生大量長(zhǎng)短不一的分生孢子梗,分生孢子梗頂端膨大，形成近球型頂囊,分生孢子頭黑色、球形,有多分支的有隔菌絲。分生孢子壁光滑,菌絲體透明(圖1～圖2)。根據(jù)菌落形態(tài)和菌絲觀察,菌株H2和H5與標(biāo)準(zhǔn)黑曲霉菌株極為相似,可將這2個(gè)菌株初步鑒定為曲霉菌屬黑曲霉(Aspergillusniger)。

2.2 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株液體發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果及分析

2.2.1 培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

2.2.1.1 碳源對(duì)產(chǎn)酶活力的影響 H2和H5經(jīng)培養(yǎng)5 d后，酶活力分別達(dá)到2.65和2.26 IU/mL,較初始酶活力分別提高了100.9%和97.3%。對(duì)于H2菌株，碳源為蔗糖時(shí)酶活力最高,其次則是紅糖(圖3)，這可能與碳源中可生成還原糖的物質(zhì)總量有關(guān),因?yàn)榧t糖中還原糖含量略少于蔗糖。對(duì)于H5菌株,紅糖和蔗糖作碳源效果都比較好,紅糖作為碳源時(shí)酶活力更高。因此,H2以蔗糖作為產(chǎn)酶時(shí)最佳碳源,H5則用紅糖作為最佳碳源。

圖1 菌株H2的菌落形態(tài)及在顯微鏡下的形態(tài)

圖2 菌株H5的菌落形態(tài)及在顯微鏡下的形態(tài)

表2 目的菌株的菌落直徑、透明圈直徑及其比值和酶活力

2.2.1.2 氮源對(duì)產(chǎn)酶活力的影響 從圖4可以看出：當(dāng)?shù)礊榱蛩徜@+尿素(1∶1)時(shí),H2菌株所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的活力最大,為6.36 IU/mL,酶活力在最佳碳源的基礎(chǔ)上又提高了140%；H5的最佳氮源為硫酸銨+硝酸銨(1∶1),其酶活力又提高了196%。在所有供試氮源的條件下,H2的產(chǎn)酶活力均在3.50 IU/mL至4.66 IU/mL之間；除以硫酸銨+尿素(1∶1)、硫酸銨為氮源時(shí)H5的產(chǎn)酶活力在2 IU/mL以下外,其余也都達(dá)到3.5 IU/mL以上,優(yōu)化效果較為明顯。因此氮源種類對(duì)于菌株所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力的影響十分明顯,H2的最佳氮源為硫酸銨+尿素(1∶1),H5的最佳氮源為硫酸銨+硝酸銨(1∶1)。

圖3 碳源對(duì)H2和H5菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力的影響

2.2.2 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.2.2.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶活力的影響 H2和H5所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的活力隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加,在培養(yǎng)5 d時(shí)酶活力均達(dá)到最大，分別達(dá)到0.85和0.82 IU/mL,分別比初始酶活力增加了192%和113%；在培養(yǎng)5 d之后酶活力逐漸下降(圖5)。因此,本實(shí)驗(yàn)以5 d為培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

圖4 氮源對(duì)H2和H5菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力的影響

圖5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)H2和H5菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力的影響

2.2.2.2 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶活力的影響 培養(yǎng)溫度對(duì)H2和H5產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力的影響趨勢(shì)幾乎相同,在28 ℃下所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的活力均最高(圖6)。

2.2.2.3 pH值對(duì)產(chǎn)酶活力的影響 當(dāng)pH值為4.0和4.5時(shí),H2和H5分別顯示最高酶活力1.10和0.82 IU/mL(圖7)。該結(jié)果與Ruchi[3]和Paula等[5]的研究結(jié)果“產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株培養(yǎng)基的最適起始pH值介于4.0～5.0”一致。液體發(fā)酵培養(yǎng)基呈酸性,菌株從該培養(yǎng)基中復(fù)篩得到,因而也適應(yīng)酸性環(huán)境。

3 討論

本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在北山采集的腐殖質(zhì)土壤中大量存在產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株,并且只要采用適當(dāng)?shù)募兓昂Y選方法即可得到產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株；而桔園土壤由于受到人工施肥等因素的影響，從中篩選得到的產(chǎn)酶菌株種類少,這也說明β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌的研究充滿很多可能性。從腐殖質(zhì)土壤中篩選出來的菌株初始所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的活力比較低,一般都需要經(jīng)過發(fā)酵條件的優(yōu)化來初步提高其產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的活力。

圖7 pH值對(duì)H2和H5菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力的影響

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)于篩選出的兩株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株H2和H5,當(dāng)碳源為蔗糖,氮源為硫酸銨+尿素(1∶1),培養(yǎng)時(shí)間為5 d，培養(yǎng)溫度為28 ℃,pH值為4.0或4.5時(shí),其所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的活力最大。當(dāng)然不同因素對(duì)菌株所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力的影響程度不盡相同,例如在本次實(shí)驗(yàn)中,培養(yǎng)溫度對(duì)酶活力的影響最大，碳源種類、氮源種類、培養(yǎng)時(shí)間次之，這與劉小杰等的優(yōu)化分析結(jié)果[14]一致。而由于大多數(shù)酶在酸性范圍內(nèi)都具有較好的穩(wěn)定性,煙曲霉的相對(duì)活性在pH 3.0～6.0內(nèi)都很穩(wěn)定[16]，故本實(shí)驗(yàn)對(duì)pH值的優(yōu)化效果不太明顯。因此,在實(shí)際應(yīng)用中,應(yīng)選擇最適的培養(yǎng)溫度為主要優(yōu)化手段,這樣可以最大程度地提高β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)量。當(dāng)然,其他發(fā)酵條件的優(yōu)化也較重要。若能將發(fā)酵工藝條件進(jìn)一步優(yōu)化,則有望實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

4 結(jié)論

利用羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基,采用剛果紅染色法,并進(jìn)一步利用液體發(fā)酵培養(yǎng)基篩選得到黑曲霉2株。

H2菌株的最適產(chǎn)酶條件:液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為4 g/L蔗糖、0.4 g/L 1∶1混合的硫酸銨與尿素、0.3 g/L MgSO4、0.3 g/L CaCl2、4 g/L KH2PO4,初始pH 4.0。H5發(fā)酵培養(yǎng)基則以紅糖為最佳碳源，以硫酸銨+硝酸銨(1∶1)為最佳氮源,最佳初始pH值為4.5。在28 ℃下，發(fā)酵培養(yǎng)到第5天時(shí), H2和H5菌株所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的活力均最大，分別達(dá)到6.36和6.70 IU/mL。

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