尹昀東，方朝暉，尤良震

(1安徽中醫(yī)藥大學(xué)，合肥230031；2安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

Goto-Kakizaki(GK)大鼠是一種自發(fā)的非胰島素依賴性糖尿病動物模型，其特有的2型糖尿病(T2DM)特征是后天環(huán)境和多基因缺陷相互作用的結(jié)果，可在每代之間傳播[1]。GK大鼠由Goto和Wistar大鼠重復(fù)近交系繁殖得來，近年來在糖尿病及相關(guān)并發(fā)癥的動物實驗研究過程中得到廣泛的應(yīng)用。相較與其同源的正常Wistar大鼠，GK大鼠自發(fā)發(fā)育所形成的T2DM模型與典型的亞洲型糖尿病非常相似[2]，而Wistar大鼠通常則作為空白對照組參與實驗。本文總結(jié)了目前GK大鼠生物學(xué)特性的研究進展，并探討GK大鼠在糖尿病相關(guān)模型實驗中的應(yīng)用注意事項。

1 GK大鼠體質(zhì)量、糖脂代謝特征

1.1 體質(zhì)量與攝食特征 研究表明，早期的GK大鼠與Wistar大鼠的體質(zhì)量并無顯著差異，Wistar大鼠從13周起體質(zhì)量的增長速率逐漸高于GK大鼠[3]。在25周齡之后到32周齡左右，GK大鼠開始出現(xiàn)明顯的糖尿病早期特征，體質(zhì)量增長幅度開始下降并逐漸趨于停滯，明顯低于同周齡的Wistar大鼠，總體上GK大鼠的平均體質(zhì)量比配對年齡的Wistar大鼠低10%～30%。16～22周齡期間，Wistar大鼠和GK大鼠的平均日攝食量均表現(xiàn)為逐漸增長的趨勢，但是在第22周齡之后，GK大鼠相比同周齡的Wistar大鼠的攝食量明顯增加，同時GK大鼠平均日攝水量也要明顯高過Wistar大鼠，總體上呈現(xiàn)多食、多飲、消瘦的糖尿病臨床癥狀。

1.2 血糖與胰島素特征 GK大鼠的血糖水平異常通常在成年(一般指8周齡)后開始出現(xiàn)，14周齡時，其葡萄糖刺激的胰島素釋放顯著下降，血清胰島素水平僅有正常Wistar大鼠的25%～50%，而同時期GK大鼠的血糖水平比正常Wistar大鼠高出50%～55%[4]。GK大鼠血糖異常的主要特征為非隨機血漿葡萄糖水平升高，與人類T2DM的餐后血糖水平增高具有一定的相似性，同時伴有葡萄糖耐量受損，糖負荷后平均血糖為16～25 mmol/L，并在相當(dāng)長的時間里保持在一個穩(wěn)定水平。GK大鼠與對照Wistar大鼠的葡萄糖曲線下面積(AUC)和胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)從第9周開始差異即有統(tǒng)計學(xué)意義[5]，此特征在GK大鼠整個生長過程中持續(xù)體現(xiàn)，呈現(xiàn)中度的高胰島素血癥和胰島素抵抗。

1.3 血脂指標(biāo)特征 對于GK大鼠的血脂特征目前尚無明確結(jié)論。研究發(fā)現(xiàn)，成年GK大鼠在11周齡后血脂部分指標(biāo)降低，例如GK大鼠的空腹血漿甘油三酯水平明顯低于同齡Wistar大鼠，但是血清總膽固醇相比Wistar大鼠在生長過程中沒有明顯變化，其具體機制尚不明確，可能是由于外周組織清除甘油三酯的速率超過了肝臟產(chǎn)生和分泌甘油三酯的速率，造成血液中甘油三酯水平下降，從而出現(xiàn)低甘油三酯血癥[6]。聯(lián)合以上研究結(jié)果和GK大鼠的體質(zhì)量演變特征來看，GK大鼠并不完全適用于肥胖型高脂血癥糖尿病動物實驗造模。

綜上所述，由于長期(>20年)連續(xù)近親繁殖，GK大鼠已經(jīng)存在穩(wěn)定的葡萄糖耐受和胰島素抵抗，具體表現(xiàn)為與生長進程同步的血糖水平的升高、血清胰島素水平下降、并有著與人類T2DM非常相似的臨床癥狀。穩(wěn)定的高血糖和體質(zhì)量減輕的特征使得GK大鼠適用于非肥胖型的糖尿病動物實驗造模，可避免在普通高脂飼料喂養(yǎng)的造模過程中附加肥胖因素產(chǎn)生的干擾。

2 GK大鼠的糖尿病前期表現(xiàn)

糖尿病前期指由血糖調(diào)節(jié)正常發(fā)展為血糖調(diào)節(jié)受損的階段，血糖升高但尚未達到糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，包括空腹血糖受損、糖耐量受損，二者可單獨或合并出現(xiàn)[7]，流行病學(xué)調(diào)查顯示糖尿病前期患病率為50.1%[8]，且糖尿病前期一般無臨床表現(xiàn)。目前可用于糖尿病前期的動物模型很少，研究表明在出生后的前3周內(nèi)，GK大鼠沒有出現(xiàn)明顯高血糖，在此期間，與Wistar大鼠相比，GK大鼠體質(zhì)量減輕，行為正常，但是脂肪細胞增多。由于某些導(dǎo)致胰島素分泌受損的基因被編碼，GK大鼠的胰島β細胞在出生時就有功能異常的現(xiàn)象，這些遺傳的編碼基因的表達外加長期暴露于高糖高脂代謝環(huán)境，可進一步引發(fā)胰島β細胞的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和纖維化等病理改變，并最終導(dǎo)致β細胞功能障礙和凋亡[9,10]。此外，幼年GK大鼠胰島素前體的分泌不足也是導(dǎo)致胰島β細胞新生和發(fā)育缺陷的重要原因，使得GK大鼠平均從8周齡之后開始出現(xiàn)非空腹的血漿葡萄糖水平升高及葡萄糖耐量受損。根據(jù)以上研究成果推測，出生3～8周的幼年GK大鼠的很多生物學(xué)特征與人類糖尿病前期具有較高的相似度，例如胰島β細胞損傷、胰島素分泌功能下降、胰島素抵抗等，幼年期(3～8周)自然生長的GK大鼠可能適合作為糖尿病前期的動物實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

3 GK大鼠與糖尿病及相關(guān)并發(fā)癥的動物模型

3.1 GK大鼠與T2DM模型 相比正常的Wistar大鼠，成年GK大鼠中β細胞的數(shù)量通常減少60%，胰島素分泌顯著減少。遺傳學(xué)研究顯示，GK大鼠的胰島β細胞形態(tài)和功能的缺陷主要受遺傳基因決定[11]。在經(jīng)過多代雜交繁殖之后，研究人員發(fā)現(xiàn)胎兒時期GK大鼠胰島β細胞的功能就已經(jīng)開始出現(xiàn)下降的趨勢，3周齡時隨著正常胰島β細胞數(shù)目的減少，血清胰島素水平逐漸開始下降，這些特征表明GK大鼠的T2DM發(fā)病依賴于多種遺傳因素和某些跨代表觀遺傳刺激，而造成胰島細胞缺陷的主要因素則是GK大鼠特有的自發(fā)性糖尿病遺傳基因。此外，由于先天性的胰島素分泌功能下降導(dǎo)致的持續(xù)性高血糖環(huán)境、糖耐量受損和營養(yǎng)物質(zhì)代謝異常，也是導(dǎo)致胰島β細胞進一步損傷的重要原因。形態(tài)學(xué)研究顯示，GK大鼠的胰島β細胞功能紊亂伴隨著周齡的增長具有加重的趨勢，12周齡胰島組織鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)胰腺濾泡與胰島交替生長；24周齡時鏡下可見胰島數(shù)量明顯減少，外觀多呈不規(guī)則狀，部分胰島萎縮、崩解，與周圍組織界限模糊[5]。Western blotting結(jié)果顯示細胞凋亡相關(guān)蛋白如Caspase和Bax表達有明顯增多。電鏡觀察結(jié)果顯示細胞內(nèi)顆粒數(shù)目減少，分化不成熟的顆粒數(shù)目增加，高爾基體增生，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)目增加，細胞內(nèi)自噬體和自噬溶酶體的數(shù)量增多等[12]。GK大鼠胰島素分泌缺陷也并非是單純的β細胞凋亡，其中還包括β細胞去分化和細胞自噬功能的異常改變，β細胞去分化轉(zhuǎn)變成α細胞或者PP細胞是目前除了細胞凋亡學(xué)說之外，又一個得到驗證的引起β細胞數(shù)量減少的原因，其具體機制有待進一步深入研究[13]。

在研究GK大鼠胰島細胞炎癥反應(yīng)和間質(zhì)纖維化時發(fā)現(xiàn)，GK大鼠在8～10周齡時胰島細胞外基質(zhì)的沉積開始有明顯的異質(zhì)性，并伴隨大量粒細胞和白細胞浸潤增生，細胞因子諸如IL-1、IL-6、腫瘤壞死因子α(TNF-α)表達增加，單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)、巨噬細胞炎性蛋白1α(MIP-1α)等多種趨化因子增多，顯示細胞間存在大量炎癥反應(yīng)[9]。將成年(尤其是16周齡以上)的GK大鼠和Wistar大鼠胰島基因表達進行對比發(fā)現(xiàn)，GK大鼠胰島中有71個基因過度表達，其中24%為細胞外基質(zhì)(ECM)相關(guān)蛋白的編碼基因，34%屬于炎癥和免疫反應(yīng)家族[14]。綜上所述，相比采用鏈脲佐菌素(STZ)聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)所形成的糖尿病大鼠模型，GK大鼠由于具有遺傳和環(huán)境多重影響所形成的糖尿病發(fā)病特征，在造模方面具有更高的穩(wěn)定性和可觀測性；此外成年GK大鼠可作為T2DM胰島β細胞去分化、凋亡、炎癥反應(yīng)與纖維化相關(guān)動物實驗的造模。

3.2 GK大鼠與糖尿病腎病模型 糖尿病腎病是糖尿病微血管病變的典型代表，主要以蛋白尿、腎小球硬化和(或)間質(zhì)損害為特征，目前類似于人類糖尿病患者特征的糖尿病鼠模型較少。在成年GK大鼠中，慢性高血糖引起的腎臟組織的形態(tài)學(xué)改變與人類糖尿病患者相似，包括腎小球微血管硬化、腎小球足細胞凋亡、系膜基質(zhì)增殖和腎小管間質(zhì)纖維化。但是研究發(fā)現(xiàn)，人類糖尿病腎病的一項重要指標(biāo)——尿微量蛋白在自然生長的GK大鼠的發(fā)病過程中并無明顯體現(xiàn)[15]，而微量蛋白尿以及尿蛋白肌酐比值則是臨床上診斷糖尿病腎病的重要依據(jù)。

Janssen等[16]分別給成年GK大鼠和Wistar大鼠的飼料中添加脫氧皮質(zhì)酮乙酸酯，即人工添加高血壓影響因素；6周后兩種大鼠血壓均升高且相互間無顯著差異，12周后高血壓GK大鼠逐漸出現(xiàn)蛋白尿增多的現(xiàn)象，之后定期檢測結(jié)果表明尿蛋白水平呈逐漸增高趨勢，第24周的病理分析結(jié)果顯示GK大鼠及Wistar大鼠均出現(xiàn)腎小球硬化的病理改變，此特征與高血壓足細胞損傷有關(guān)，但非高血壓組的GK大鼠則沒有發(fā)現(xiàn)如此顯著的腎臟病變；高血壓GK大鼠腎小管間質(zhì)的Ⅳ型膠原蛋白和α-平滑肌肌動蛋白表達水平升高，腎小管間質(zhì)損傷較高血壓Wistar大鼠明顯增強，該研究證明具有高血壓特征的GK大鼠是研究糖尿病腎病的良好模型，自然生長的GK大鼠需要施加人為升高血壓的方法，才會與人類糖尿病腎病具有高度相似性。

國外相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)，通過人工雜交的方法可以培養(yǎng)出自發(fā)性糖尿病腎病的大鼠，例如通過將GK大鼠與頭部淺褐色高血壓(FHH)大鼠雜交而進行基因改造[15，17]。FHH大鼠隨著年齡的增長具有腎臟血流自身調(diào)節(jié)缺陷的特性，是一種慢性腎臟疾病的嚙齒動物模型，GK大鼠與之雜交后下一代可成為自發(fā)性糖尿病腎病轉(zhuǎn)基因亞系大鼠，由此產(chǎn)生的GK大鼠亞系可在12周具有明顯的糖尿病特征和腎臟組織學(xué)改變，包括在生命后期形成腎內(nèi)結(jié)節(jié)，類似于人類糖尿病腎病。在研究過程中，該種大鼠出現(xiàn)了嚴(yán)重的蛋白尿、腎損傷等慢性腎病，18周齡時，腎小球濾過率GFR下降57%，而GK大鼠的GFR無明顯變化。病理結(jié)果顯示該種大鼠表現(xiàn)為嚴(yán)重的腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化和腎小管壞死，而同時期GK大鼠的腎臟僅發(fā)生輕微的組織學(xué)改變，例如腎小管和腎小球基底膜增厚，腎小球大小增加，系膜基質(zhì)擴大。因此，通過與FHH大鼠雜交形成自發(fā)性糖尿病腎病GK大鼠是目前最穩(wěn)定的大鼠DN造模方法，但是仍處于研究階段，而且其成型時間相對較長，因此尚未得到普及。

3.3 GK大鼠與糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)模型 DPN是種類繁多且機制較為復(fù)雜的一種糖尿病并發(fā)癥，在動物實驗中，大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度、形態(tài)學(xué)改變以及雪旺細胞的病變通常作為DPN的依據(jù)[18]。目前有關(guān)使用GK大鼠建立DPN模型的研究較少，有關(guān)DPN的造模大多采用STZ腹腔注射SD大鼠并配合高脂飲食或配合動脈鉗夾等方式。而且此類方法更偏向于使用血糖水平來反映DPN的發(fā)病進展，增加了實驗結(jié)果的不穩(wěn)定性[19]。

GK大鼠由于其遺傳因素所決定的自發(fā)性糖尿病特征，血糖及病理發(fā)展都比STZ腹腔注射SD大鼠模型更為穩(wěn)定。研究表明，8周齡GK大鼠在高脂飼料(主要成分包括普通飼料88.2%、精煉豬油10.0%、膽固醇1.5%、豬膽鹽0.3%)喂養(yǎng)12周之后，相關(guān)檢測指標(biāo)如血糖、神經(jīng)傳導(dǎo)速度、神經(jīng)細胞病理形態(tài)及施萬細胞的功能與正常Wistar大鼠有明顯差異，表現(xiàn)為感覺神經(jīng)和運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度下降，施萬細胞呈現(xiàn)出穩(wěn)定的凋亡趨勢，具有典型的人類DPN特征，可以作為DPN研究的良好模型[20]。此方法操作簡便，但是具體針對GK大鼠糖尿病中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變、DPN和自主神經(jīng)病變的相關(guān)研究仍然較少，在此方面的研究仍有待進一步的深入和發(fā)展。

3.4 GK大鼠與糖尿病大血管病變模型 糖尿病大血管病變指由長期糖尿病并發(fā)的心、腦及外周大血管包括胸主動脈、腹主動脈等病變，其主要病理過程是動脈粥樣硬化(AS)。血管內(nèi)皮功能紊亂被認為是AS解剖學(xué)證據(jù)出現(xiàn)之前的最早期表現(xiàn)。長期的高糖高脂內(nèi)環(huán)境引發(fā)的活性氧ROS等過氧化物對血管內(nèi)皮細胞損傷是大血管病變中關(guān)鍵性的一步，同時大量低密度脂蛋白膽固醇在此基礎(chǔ)上被氧化為氧化低密度脂蛋白，最終可轉(zhuǎn)變成脂質(zhì)代謝產(chǎn)物丙二醛，期間一系列中間產(chǎn)物會引發(fā)嚴(yán)重的細胞損傷和炎癥反應(yīng)，進一步提高氧化應(yīng)激水平，形成惡性循環(huán)并加重AS，最終誘發(fā)糖尿病大血管病變[21]。自然生長的GK大鼠由于高血糖低甘油三酯的特性不能穩(wěn)定形成AS，因此，在此類實驗造模過程中需要采取相應(yīng)特殊方法。

糖尿病大血管病變或者AS動物模型建立的方法主要有喂養(yǎng)法、機械損傷法、免疫損傷法和轉(zhuǎn)基因法等。其中喂養(yǎng)法比較接近人類飲食特點，GK大鼠需要采用高脂飼料喂養(yǎng)或者在高脂飲食中添加一氧化氮合成酶(NOS)抑制劑，如Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)，才能建立糖尿病大血管病變的動物模型。L-NAME是近年來報道較多的研究造模劑，可以競爭性與一氧化氮(NO)合成酶結(jié)合，從而抑制NO的合成，損傷血管內(nèi)皮功能，誘導(dǎo)早期的血管炎癥和AS的發(fā)生。研究顯示，在成年GK大鼠的飲水中，每100 mL添加0.5 mL的L-NAME，維持4周后，大鼠的頸總動脈和腹主動脈開始出現(xiàn)血管炎癥和早期AS，此種方法造模時間5周，GK大鼠腹主動脈病理檢查結(jié)果顯示出病灶部位內(nèi)膜增厚、內(nèi)皮細胞腫脹、內(nèi)皮下細胞浸潤和脂質(zhì)沉積等T2DM大血管病變的早期病變特征[22,23]。其反映氧化應(yīng)激水平的諸多指標(biāo)如血清超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的含量，黏附因子ICAM-1 mRNA及蛋白的表達等均有明顯變化，國外也有大量研究結(jié)果表明，可以通過給予L-NAME 長達4周左右在大鼠體內(nèi)復(fù)制出AS，其報道結(jié)果基本一致。高脂飼料聯(lián)合L-NAME喂養(yǎng)不僅可以有效地形成AS，同時還可以模擬高真實度的糖尿病大血管病變的血管環(huán)境，結(jié)合GK大鼠自身穩(wěn)定的糖尿病發(fā)病特征，此方法具有造模時間穩(wěn)定、成功率高的特點，因此成年GK大鼠高脂飼料聯(lián)合L-NAME喂養(yǎng)5周以上可以作為自發(fā)性糖尿病大血管病變的優(yōu)良動物模型。

綜上所述，GK大鼠是一種優(yōu)良的自發(fā)性糖尿病動物模型，由于T2DM發(fā)病機制的復(fù)雜性與多樣性，其糖尿病發(fā)病特征與人類之間仍存在相應(yīng)的差異，因此在使用GK大鼠建立糖尿病模型的過程中，許多問題仍然需要重視，在了解GK大鼠生物學(xué)特性的基礎(chǔ)上，需要針對不同類型的糖尿病并發(fā)癥進行特殊處理。GK大鼠用于糖尿病動物實驗造模目前尚未得到廣泛普及，其相關(guān)方法的完善和改良仍然需要進行大量的深入研究。