陶嘉萍 黃鋒 黃偉強(qiáng)

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年心內(nèi)科&廣西心腦血管疾病防治精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地&廣西心腦血管疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心（南寧530021）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）主要是指冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂引起血栓形成，導(dǎo)致相應(yīng)冠狀動(dòng)脈堵塞、血流中斷，一部分心肌因嚴(yán)重的持久性缺血而發(fā)生局部壞死的疾病。血管再生和心肌組織血管化是影響心肌梗死預(yù)后的重要因素。干∕祖細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制和分化能力的細(xì)胞，不少研究將其用于MI 后的血管再生治療研究，取得了一定效果。各種基因工具可用于介導(dǎo)效應(yīng)分子促進(jìn)血管再生［1］，其中，基因修飾干∕祖細(xì)胞用于血管再生治療備受關(guān)注，其方法是利用基因工具合成與血管生成相關(guān)的目的DNA 或RNA 片段，再經(jīng)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞目的基因表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)在基因水平調(diào)節(jié)血管再生的目的。

1 血管再生治療相關(guān)干/祖細(xì)胞類型及其功能

干∕祖細(xì)胞的內(nèi)皮分化潛能及其旁分泌效應(yīng)在血管再生治療中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞（endothlial cell，ECs）可以由成體干∕祖細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞［2］、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）［3］分化而來(lái)。其中，成體干∕祖細(xì)胞包括心臟干細(xì)胞（cardiac stem cells，CSCs）［4］∕心臟祖細(xì)胞（cardiac progenitor cells，CPCs）［5］、間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）［6］、脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）［7］和心血管祖細(xì)胞［8］等。干∕祖細(xì)胞的旁分泌效應(yīng)能增加駐留在心臟的干∕祖細(xì)胞的存活率，促使梗死心肌組織血管新生，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，募集內(nèi)源性干∕祖細(xì)胞并促進(jìn)有益的心臟重塑，從而改善心功能。如ADSCs 能通過(guò)旁分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α（stromal cell-derived factor-1，SDF-1α）和單核細(xì)胞趨化蛋白（monocyte chemotactic protein-3，MCP-3）促進(jìn)血管生成和趨化［9］。

2 參與調(diào)節(jié)血管再生的基因

2.1 編碼基因 機(jī)體內(nèi)參與調(diào)節(jié)血管生成的編碼基因包括：（1）抗凋亡基因：絲∕蘇氨酸激酶Pim1 編碼基因［10］、抗凋亡因子Bcl-xL 編碼基因［11］、熱休克蛋白27（heat shock protein 27，Hsp27）編碼基因HSPB1［12］等。（2）促進(jìn)血管生成基因：VEGF 編碼基因［13］、胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulinlike growth factor-1，IGF-1）編碼基因［14］、HGF 編碼基因［15］和心血管祖細(xì)胞LIM-homeobox 轉(zhuǎn)錄因子islet-1 編碼基因ISL1［16］等。（3）抗炎相關(guān)的基因：腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）編碼基因、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）編碼基因和白介素-6（interleukin-6，IL-6）編碼基因［17］等。（4）促進(jìn)細(xì)胞靶向歸巢的基因：SDF-1a 編碼基因和MCP-1 編碼基因［18］、趨化因子GCP-2 編碼基因和趨化因子NAP-2 編碼基因［19］等。（5）其他編碼基因，如整合蛋白β1（integrin β1）編碼基因Itgb1［20］和基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）編碼基因［21］等。

2.2 非編碼基因 非編碼RNAs（non-coding RNAs，ncRNAs），包括微小RNAs（microRNAs，miRNAs）、長(zhǎng)鏈非編碼RNAs（long non-coding RNAs，lncRNAs）和環(huán)狀RNAs（circular RNAs，circRNAs）。

MiRNAs 是一類由19～23 個(gè)核苷酸組成的小分子單鏈ncRNAs，是發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70～90 個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過(guò)Dicer 酶加工后生成。miRNAs 在細(xì)胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)功能，是研究最為廣泛的參與調(diào)節(jié)血管再生的非編碼基因。在MI 的研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miR-130 與急性MI 的炎癥反應(yīng)和心肌纖維化相關(guān)［22］；ECs 特異性miR-126可介導(dǎo)體內(nèi)血管生成和發(fā)育并維持血管的完整性［23-24］；miR-210 可促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖和存活，促進(jìn)小鼠MI 后的血管生成，減少心肌凋亡，改善心臟功能［25］。此外，DONG等［26］發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老的miR-10a，不僅可以提高衰老的MSCs 的分化能力，還可以促進(jìn)移植后MSCs 的存活，通過(guò)激活A(yù)kt（蛋白激酶B）誘導(dǎo)血管生成因子的表達(dá)，促進(jìn)MI 小鼠心肌組織中血管再生。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，越來(lái)越多l(xiāng)ncRNAs和circRNAs 被發(fā)現(xiàn)。lncRNAs 是一類長(zhǎng)度大于200 個(gè)核苷酸的長(zhǎng)鏈ncRNAs，在順式或反式轉(zhuǎn)錄調(diào)控、核結(jié)構(gòu)域組裝和調(diào)控RNA 和蛋白質(zhì)功能等方面發(fā)揮重要作用［27］。circRNAs 是主要由外顯子環(huán)化而成的具有環(huán)狀閉合結(jié)構(gòu)的一類新型RNA，可作為miRNAs 海綿或基因剪切和轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)基因表達(dá)［28］。

lncRNAs 和circRNAs 在心血管疾病，特別是在MI 中的研究仍處在起始階段。lncRNA MIAT（myocardial infarction associated transcript，MIAT）是心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄本，雖然MIAT 在心肌梗死中發(fā)揮的作用尚不清楚，但有證據(jù)表明MIAT 通過(guò)MIAT-（MiR-150-5P）-VEGF 反饋環(huán)調(diào)控ECs 的功能［29］。組織缺氧是血管生成的強(qiáng)烈誘因，有研究顯示，lncRNA linc00323 和MIR503HG 在ECs 中有強(qiáng)烈的缺氧依賴性激活現(xiàn)象，在缺氧環(huán)境它們被激活并調(diào)控內(nèi)皮轉(zhuǎn)錄因子GATA2 的表達(dá)，從而調(diào)控ECs 的增殖和管狀形成［30］。此外，在糖尿病視網(wǎng)膜血管病變中，circRNA circHIPK3 能阻斷miR-30a 功能，導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管ECs 過(guò)度增生，血管功能紊亂［31］。這些研究提示，ncRNAs 能通過(guò)不同途徑參與血管再生的調(diào)控，為其今后用于MI 后心肌血管再生治療提供了依據(jù)。

3 基因修飾的載體和干/祖細(xì)胞的治療途徑

目前常用的基因修飾載體包括病毒載體和非病毒載體，其中病毒載體的轉(zhuǎn)染方式有腺病毒、腺相關(guān)病毒和慢病毒轉(zhuǎn)染，非病毒載體的轉(zhuǎn)染方式有電穿孔、脂質(zhì)體和納米微粒體轉(zhuǎn)染等。在干∕祖細(xì)胞治療MI 的研究中，其治療途徑主要有全身（靜脈內(nèi)）注射和局部（心肌內(nèi)）移植兩種［32］。與靜脈注射相比，心肌內(nèi)移植的效果主要依賴干∕祖細(xì)胞的歸巢能力和滯留能力，靜脈注射雖比心肌內(nèi)移植途徑容易實(shí)施，且侵入性小，但注射的干∕祖細(xì)胞容易在肝、肺和脾臟中積累，僅少量能經(jīng)過(guò)血液循環(huán)到達(dá)缺血的心肌組織。因此，直接心肌內(nèi)注射這種治療途徑目前是研究MI 的干∕祖細(xì)胞治療的首選方法。

4 基因修飾干/祖細(xì)胞促進(jìn)MI 后血管再生的機(jī)制

4.1 增強(qiáng)干/祖細(xì)胞活性 基于干∕祖細(xì)胞的血管再生療法是MI 治療中備受關(guān)注的新型治療方法，但梗死心肌組織中因缺血引起的強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)可產(chǎn)生過(guò)量的細(xì)胞凋亡因子，導(dǎo)致移植后的干∕祖細(xì)胞凋亡增加，存活減少，進(jìn)一步影響干∕祖細(xì)胞功能的正常發(fā)揮。研究發(fā)現(xiàn)，移植到MI 小鼠心臟中的干細(xì)胞，一周內(nèi)死亡率高達(dá)90%［33］，可見(jiàn)，直接將干∕祖細(xì)胞移植到梗死區(qū)域并不能達(dá)到理想的治療效果。

有研究人員通過(guò)對(duì)移植前的干∕祖細(xì)胞進(jìn)行基因修飾預(yù)處理，試圖提高它們移植后的活力。HGF 是血管生成、抗炎和抗細(xì)胞凋亡相關(guān)的重要細(xì)胞因子，ZHU 等［34］通過(guò)孔介二氧化硅納米顆粒生物相容性系統(tǒng)將HGF 基因?qū)牍撬鐼SCs（HGF-MSCs），再移植到MI 大鼠心肌缺血部位，結(jié)果顯示，移植后HGF-MSCs 的存活率較MSCs 高，且HGFMSCs 移植后心肌細(xì)胞凋亡顯著減少、間質(zhì)纖維化減輕、心肌血管生成增加。此外，組織抗炎因子IL-10 在MI 模型中的心臟保護(hù)作用也已經(jīng)得到證實(shí)，有報(bào)道［8］，在IL-10 敲除的急性MI 小鼠體內(nèi)miR-375 水平顯著升高。為研究IL-10和miR-375 在MI 過(guò)程中的內(nèi)在聯(lián)系，移植前敲除骨髓血管生成祖細(xì)胞（bone marrow-derived angiogenic progenitor cells，BMPAC）的miR-375 基因，發(fā)現(xiàn)抑制miR-375 表達(dá)能明顯改善移植后BMPAC 的存活率，并提高由BMPAC 旁分泌效應(yīng)介導(dǎo)的MI 后新生血管的形成和組織修復(fù)能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，沉默miR-375 上調(diào)了3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶-1 的表達(dá)，并通過(guò)激活PI3K∕Akt 信號(hào)通路，提高BMPAC 在MI組織中的存活率和功能。另有報(bào)道［35］，硫氧還蛋白（thioredoxin-1，Trx-1）有強(qiáng)效抗氧化特性和生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，使用腺病毒攜帶能編碼Trx-1 的基因轉(zhuǎn)染到大鼠MSCs（Trx-1-MSCs），再注射到MI 大鼠心臟缺血邊界區(qū)，移植4 天后與對(duì)照組相比，Trx-1-MSCs組的血紅素加氧酶-1和VEGF 表達(dá)明顯升高，因此提高Trx-1-MSCs 移植后的抗缺氧能力和存活率，并促使毛細(xì)血管生成增加。

4.2 動(dòng)員干/祖細(xì)胞遷移至缺血區(qū) 趨化因子SDF-1 通過(guò)與C-X-C 趨化因 子受體4（C-X-C chemokine receptor type 4，CXCR4）和CXCR7 結(jié)合，激活下游信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，調(diào)節(jié)心肌血管再生過(guò)程中CSC 的動(dòng)員、募集和功能［36］。ZUO等［37］通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明，用c-kit＋配體干細(xì)胞因子（c-kit＋ligand stem cell factor，SCF）刺激能提高CSC 遷移能力，使用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）抑制CSC 中CXCR4 的表達(dá)后，SCF 的作用被抑制，并發(fā)現(xiàn)該作用是SCF 通過(guò)誘導(dǎo)CXCR4-serine399 磷酸化進(jìn)行調(diào)節(jié)，而G 蛋白偶聯(lián)受體激酶6（transmembrane-spanning G protein-coupled receptor kinase 6，GRK6）在這個(gè)環(huán)節(jié)中起著關(guān)鍵的信號(hào)傳導(dǎo)作用。基于體外研究的結(jié)果，在MI 模型中，作者用體內(nèi)示蹤方法研究siGRK6-CSC（siRNA 抑制CSC 中GRK6 的表達(dá)）和CSC 移植后的易位和歸巢情況，結(jié)果顯示，部分CSC可以易位和歸巢到心肌損傷部位，而siGRK6-CSC 卻沒(méi)有觀察到類似現(xiàn)象。此外，有研究報(bào)道CXCR4 過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)MSCs 表達(dá)VEGF、細(xì)胞周期蛋白A2 和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2，而縮短MSCs 細(xì)胞周期，增加其內(nèi)源性再生能力。在MI 大鼠體內(nèi)，CXCR4 過(guò)表達(dá)能在更大程度上動(dòng)員MSCs 遷移到心肌缺血區(qū)域，并通過(guò)旁分泌信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制促進(jìn)缺血區(qū)的血管生成［38］。

整合素連接激酶（integrin-linked kinase，ILK）是一種在心臟高表達(dá)的絲氨酸∕蘇氨酸激酶，可通過(guò)其下游Akt 信號(hào)促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化、遷移和粘附，是血管生成的重要調(diào)節(jié)因子。有研究用腺病毒介導(dǎo)ILK 基因轉(zhuǎn)染CPCs（ILKCPCs），結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)ILK 能增加體外CPCs 的增殖和遷移，增加CPCs 移植到MI 大鼠體內(nèi)后的存活率，促進(jìn)心肌微血管再生［39］。另有學(xué)者將ILK-MSCs 注射到MI 大鼠心肌梗塞邊界區(qū)，觀察到ILK-MSCs 移植后的存活率明顯提高，研究證明ILK 可通過(guò)Akt 和mTOR 信號(hào)通路增加VEGF 的表達(dá)，促進(jìn)梗死區(qū)新生血管生成［40］。

4.3 促進(jìn)干/祖細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化 機(jī)體缺血性損傷會(huì)啟動(dòng)多種促進(jìn)受損組織血管再生的機(jī)制，理論上這種促使血管生成的環(huán)境應(yīng)該誘導(dǎo)血管祖細(xì)胞向ECs 分化，但實(shí)際上很少有血管祖細(xì)胞被招募進(jìn)入血管系統(tǒng)并分化顯示出ECs 表型。在MI 后血管再生治療中，為提高血管祖細(xì)胞的內(nèi)皮分化效率，獲得足夠數(shù)量的功能性ECs，以提高M(jìn)I 后心肌血管再生治療的療效，XU 等［41］最近報(bào)道，E2F 轉(zhuǎn)錄因子1（E2F transcription factor1，E2F1）通過(guò)促進(jìn)糖酵解途徑中的丙酮酸脫氫酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinase，PDK）的表達(dá)，抑制骨髓祖細(xì)胞（bone marrow progenitor cells，BMPC）從無(wú)氧糖酵解到線粒體氧化磷酸化代謝的轉(zhuǎn)變，進(jìn)而抑制BMPC 的活化，抑制BMPC 向ECs 分化。他們研究發(fā)現(xiàn)，在E2F1 缺陷型小鼠體內(nèi)，PDK 的表達(dá)明顯下降，將從E2F1 缺陷型小鼠體內(nèi)分離出的BMPC（BMPCE2F1-∕-）注射到MI 小鼠體內(nèi)，觀察到E2F1 缺失可促進(jìn)缺血心肌組織中的BMPCE2F1-∕-向ECs 分化，促使血管生成增加；為明確PDK 在BMPC 向ECs 分化過(guò)程中的作用，他們進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果證明BMPC 中PDK 的過(guò)表達(dá)抑制了BMPC 的氧化代謝，降低內(nèi)皮分化能力。

由體細(xì)胞重編程得到的iPSCs 具有無(wú)限的自我更新能力，能分化產(chǎn)生大量所需的功能性細(xì)胞，因而成為一類重要的再生醫(yī)學(xué)研究的干細(xì)胞類型。目前，不少研究將iPSCs分化而來(lái)的ECs 用于血管再生治療，但其自發(fā)性ECs 分化率低是未來(lái)臨床研究的主要阻礙，因此，如何提高干細(xì)胞的內(nèi)皮分化效率是個(gè)亟待解決的問(wèn)題。以往介導(dǎo)血管發(fā)育的信號(hào)傳導(dǎo)途徑為建立有效的iPSCs 的ECs 分化體系提供了重要信息，近期研究報(bào)道，LIANG［42］等將攜帶拮抗血管生成的miR-495 基因的病毒轉(zhuǎn)染到iPSCs（iPSCsAnti-495）中，能提高iPSCsAnti-495誘導(dǎo)分化為ECs（iPSCAnti-495-ECs）的能力。研究顯示，miR-495 通過(guò)靶向血管內(nèi)皮鋅指1（vascular endothelial zinc finger 1，VEZF1）調(diào)控內(nèi)皮或血管生成基因的表達(dá)，抑制miR-495 的表達(dá)可以解除miR-495 對(duì)VEZF1轉(zhuǎn)錄功能的抑制，從而提高由iPSCs 誘導(dǎo)分化成ECs 的效率，而且分化生成的ECs 具有較強(qiáng)的血管生成能力，包括細(xì)胞增殖、遷移和管狀形成等；將iPSCAnti-495-ECs 移植到免疫缺陷MI 小鼠中，能增加梗死心肌組織中新生血管的密度，減小梗死面積。

5 小結(jié)

隨著干∕祖細(xì)胞治療在MI 后心肌血管再生研究的不斷深入，探索干∕祖細(xì)胞聯(lián)合基因修飾在改善干∕祖細(xì)胞心肌移植后的微環(huán)境、提高移植后干∕祖細(xì)胞存活率，以及提高它們的內(nèi)皮分化效率等方面，將具有廣闊的研究和臨床應(yīng)用前景。在干∕祖細(xì)胞治療過(guò)程中，如果這些問(wèn)題能得到解決，MI 后血管再生的研究將會(huì)取得突破，從而推動(dòng)有關(guān)臨床研究工作的開(kāi)展。