姚俊閣，李冰熠，岳青芬

(鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院婦科，河南 洛陽(yáng) 471000)

卵巢上皮性癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤，5年生存率僅為20%～30%，其病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，至今還缺少有效的早期診斷方法。因此，深入研究卵巢上皮性癌的發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制對(duì)尋找新的腫瘤標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)具有重要意義。異?；钴S的糖酵解代謝是惡性腫瘤的顯著特征，通過(guò)阻斷糖酵解途徑來(lái)抑制癌細(xì)胞中能量的生成，從而達(dá)到治療惡性腫瘤。己糖激酶(HK)是糖酵解過(guò)程中的第一限速酶，其中HK-Ⅱ已被證實(shí)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲密切相關(guān)[1]。蛋白激酶B(PKB)是磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(P13K/PKB)信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白。在P13K/PKB通路激活后，通過(guò)多種分子機(jī)制參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，目前有研究[2]表明該通路參與了糖酵解酶HK的上游調(diào)控。

本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)卵巢上皮性癌組織中HK-Ⅱ、PKB蛋白的表達(dá)水平，分析二者與卵巢上皮性癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系及二者在卵巢上皮性癌組織中表達(dá)的相關(guān)性，從而明確HK-Ⅱ、PKB在卵巢上皮性癌中的作用及其意義，以期為臨床對(duì)卵巢上皮性癌的診斷及治療提供新的思路和方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2010年7月至2017年3月鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院手術(shù)切除的標(biāo)本96例，其中卵巢上皮性癌組織標(biāo)本(惡性組)56例，年齡(53.4±10.7)歲。均經(jīng)病理檢查診斷為卵巢上皮性癌。按國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期：Ⅰ—Ⅱ期20例，Ⅲ—Ⅳ期36例。低分化32例，高、中分化24例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例。病理類型：漿液性囊腺癌21例，黏液性囊腺癌17例，子宮內(nèi)膜樣腺癌8例。術(shù)前均未行放、化療。卵巢良性上皮性腫瘤組織標(biāo)本(良性組)20例，年齡(50.4±10.6)歲。其中漿液性囊腺瘤10例，黏液性囊腺瘤10例。正常卵巢上皮組織標(biāo)本(正常組)20例，年齡(49.8±9.1)歲。均為良性疾病行子宮加附件切除術(shù)的組織標(biāo)本。3組年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 檢測(cè)方法

采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)各組HK-Ⅱ和PKB蛋白的表達(dá)水平。將手術(shù)標(biāo)本用10%甲醛固定，并進(jìn)行梯度脫水、透明、浸蠟和包埋，以厚度為4 μm 連續(xù)切片。然后，將切片脫蠟、水化、EDTA緩沖液100 ℃修復(fù)。修復(fù)后，滴加過(guò)氧化酶阻斷溶液，用動(dòng)物非免疫血清(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)室溫封閉。封閉后，滴加一抗HK-Ⅱ(美國(guó)Santa Cruz公司，1：100稀釋)、PKB(美國(guó)R&D公司，1：50稀釋)，陰性對(duì)照用PBS代替。生物素標(biāo)記的二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行室溫孵育。孵育后，滴加鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液，PBS沖洗。沖洗后，DAB顯色。蘇木精復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片并鏡檢。

1.3 結(jié)果判定

HK-Ⅱ蛋白表達(dá)于細(xì)胞膜和胞質(zhì)，采取半定量法進(jìn)行評(píng)分[3]。隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡(10×40)視野進(jìn)行觀察。按染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；再按照陽(yáng)性細(xì)胞率計(jì)分，陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分。將上述兩種得分相乘，總分<5分為陰性(—)，≥5分為陽(yáng)性(+)。結(jié)果判定在雙盲下進(jìn)行，每張切片分別由2名病理科醫(yī)師判讀。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；變量間的相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HK-Ⅱ、PKB蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的比較

惡性組、良性組及正常組HK-Ⅱ蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為82.1%(46/56)、25.0%(5/20)、10.0%(2/20)。惡性組HK-Ⅱ蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常組、良性組(P<0.01)，良性組HK-Ⅱ蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。惡性組、良性組及正常組PKB蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為69.6%(39/56)、20.0%(4/20)、10.0%(2/20)。惡性組PKB蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常組、良性組(P<0.01)，良性組PKB蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。卵巢上皮性癌組織中HK-Ⅱ、PKB的蛋白表達(dá)均呈陽(yáng)性染色，均主要位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中(封三圖1—2)。

2.2 HK-Ⅱ、PKB蛋白表達(dá)與卵巢上皮性癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

卵巢上皮性癌組織學(xué)分級(jí)為高、中分化和病理類型為漿液性囊腺癌、黏液性囊腺癌HK-Ⅱ、PKB蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與組織學(xué)分級(jí)為低分化、病理類型為子宮內(nèi)膜樣腺癌比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。卵巢上皮性癌FIGO分期為Ⅰ—Ⅱ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移HK-Ⅱ、PKB蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與FIGO分期為Ⅲ—Ⅳ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 HK-Ⅱ、PKB蛋白表達(dá)與卵巢上皮性癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，卵巢上皮性癌組織中HK-Ⅱ蛋白表達(dá)與PKB蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.402，P<0.05)。

3 討論

腫瘤細(xì)胞的代謝與正常細(xì)胞不同，即使在氧氣充足的情況下，腫瘤細(xì)胞仍主要以糖酵解途徑提供能量，這種代謝途徑的重塑被稱為Warburg效應(yīng)[4]。近年來(lái)，通過(guò)阻斷糖酵解途徑來(lái)抑制癌細(xì)胞中的能量生成而達(dá)到治療惡性腫瘤的策略正備受關(guān)注。HK是細(xì)胞糖酵解途徑中的第一個(gè)限速酶，在調(diào)控糖酵解流量中起關(guān)鍵作用，而在腫瘤組織中常發(fā)現(xiàn)其同工酶類型、表達(dá)量、亞細(xì)胞分布及動(dòng)力學(xué)特性等改變，其中HK-Ⅱ與腫瘤特征性代謝、細(xì)胞增殖和凋亡密切相關(guān)[5]。Hoppe Seyler等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸正常組織中HK-Ⅱ不表達(dá)或者低表達(dá)，而在宮頸癌組織中異常高表達(dá)，且與放療耐受和抵抗有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HK-Ⅱ持續(xù)高表達(dá)與人乳頭瘤病毒癌基因E6/E7的激活有關(guān)。劉娜等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在鼻咽癌組織中HK-Ⅱ表達(dá)上調(diào)，并與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展及腫瘤細(xì)胞的侵襲能力有關(guān)，且高表達(dá)HK-Ⅱ的患者預(yù)后較差。另有文獻(xiàn)[8]報(bào)道，抑制HK-Ⅱ的表達(dá)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞及其化療耐藥細(xì)胞通過(guò)線粒體凋亡途徑凋亡，從而提高化療療效，并在侵襲性淋巴瘤的研究中得到印證。本研究結(jié)果顯示，惡性組HK-Ⅱ蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常組、良性組(P<0.01)，卵巢上皮性癌FIGO分期為Ⅰ—Ⅱ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移HK-Ⅱ蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與FIGO分期為Ⅲ—Ⅳ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，提示HK-Ⅱ不僅參與了卵巢上皮性癌發(fā)生，且與其侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

P13K/AKT通路是一個(gè)經(jīng)典的抗凋亡、促增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在腫瘤發(fā)生發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及放化療抵抗中發(fā)揮重要作用。PKB是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的蛋白激酶，是P13K/PKB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的主要效應(yīng)分子，其活化與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系。有研究[9]表明，PKB在正常組織中低表達(dá)或不表達(dá)，而在肺癌、食管癌、乳腺癌等惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)，并與不良預(yù)后有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，惡性組PKB蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常組、良性組(P<0.01)，卵巢上皮性癌FIGO分期為Ⅰ—Ⅱ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移PKB蛋白陽(yáng)性表達(dá)率與FIGO分期為Ⅲ—Ⅳ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，其與上述研究結(jié)果一致，并提示P13K/AKT通路的激活可能是卵巢上皮性癌發(fā)生的始動(dòng)因素之一，且與卵巢上皮性癌的生物學(xué)行為和預(yù)后密切相關(guān)。

有研究[10]證實(shí)，HK-Ⅱ與線粒體結(jié)合是調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、增殖和凋亡的關(guān)鍵。HK-Ⅱ與線粒體外膜蛋白(VDAC)結(jié)合形成線粒體結(jié)合型HK-Ⅱ，并可優(yōu)先利用線粒體產(chǎn)生ATP，同時(shí)解除產(chǎn)物G-6-P對(duì)HK-Ⅱ的抑制作用，使糖代謝能夠持續(xù)、高速地進(jìn)行，為快速生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞提供足夠的能量。另外，線粒體結(jié)合型HK-Ⅱ能夠維持線粒體外膜完整性，并參與線粒體膜通透轉(zhuǎn)換孔復(fù)合物的構(gòu)建，抑制促凋亡因子，阻止線粒體途徑誘導(dǎo)的凋亡，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。此外，HK-Ⅱ與線粒體的結(jié)合涉及多條通路和多種因子，Gottlob等[11]報(bào)道，P13K/AKT通路參與了HK的上游調(diào)控，PKB的激活能夠促使HK-Ⅱ與線粒體VDAC相結(jié)合，進(jìn)而利用ATP參與糖代謝，并通過(guò)抑制細(xì)胞色素C釋放來(lái)抑制凋亡。本研究中，相關(guān)性分析結(jié)果顯示，卵巢上皮性癌組織中HK-Ⅱ蛋白表達(dá)與PKB蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.402，P<0.05)，提示HK-Ⅱ、PKB可能協(xié)同參與卵巢上皮性癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，HK-Ⅱ、PKB蛋白的異常表達(dá)可能與卵巢上皮性癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，深入研究糖酵解代謝相關(guān)限速酶及其調(diào)控機(jī)制，有望為卵巢上皮性癌的治療提供新的靶點(diǎn)。