肖正俊，阿良*，李洪秋，鄧純博，沈曉桐

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院骨外科，遼寧 沈陽 110024；2.婦產(chǎn)科）

外傷、感染、腫瘤等疾病所導(dǎo)致的骨缺損填充和重建對骨移植材料有非常大的需求，顯示了骨移植龐大的應(yīng)用市場。現(xiàn)有骨缺損的治療方法主要有三種：（1）自體骨移植、同種異體骨移植和異種骨移植；（2）骨延長術(shù)；（3）誘導(dǎo)膜技術(shù)。三者不是取自體骨或異體骨，就是二次手術(shù)且手術(shù)周期長，給患者身心帶來巨大傷害［1］。近年來，組織工程骨膜技術(shù)研究發(fā)展迅速，具有廣闊的應(yīng)用前景，現(xiàn)予以綜述。

1 組織工程骨膜技術(shù)

1.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bonemarrowmesenchymal stem cells，BMSCs） BMSCs起源于中胚層，存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，其中以骨髓中含量最為豐富，是骨髓中非造血干細(xì)胞，能夠支持體外造血和促進體內(nèi)造血功能重建，具有自我復(fù)制和多向分化潛能［2］，在一定的誘導(dǎo)條件下能夠分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等成熟細(xì)胞，易于提取和培養(yǎng)，且免疫原性低［3-4］。

1.2 人脫細(xì)胞羊膜（human acellular amniotic membrane，HAAM） 有研究證實，羊膜本身就是一種良好的生物材料［5］。HAAM以健康足月孕婦羊膜為基礎(chǔ)原料，75%乙醇進行病毒滅活，使用0.25%胰蛋白酶脫細(xì)胞處理，配置碳二亞胺：N-羥基琥珀酰亞胺（4：1）體系進行交聯(lián)改性，之后無菌條件下采用生理鹽水清洗，完全洗去殘留試劑，僅保留了基膜層和致密層，有效地去除了羊膜中的細(xì)胞成分，保留了纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，進一步降低了抗原性［6］。羊膜脫細(xì)胞材料屬于可吸收膠原類材料，能夠作為種子細(xì)胞和材料支架應(yīng)用于組織工程骨膜中，為骨缺損的修復(fù)帶來了希望［7］。

1.3 組織工程骨膜（tissue engineering periosteum）

組織工程骨膜基于生命科學(xué)與工程學(xué)的原理，選取BMSCs作為定向分化成骨細(xì)胞的種子，HAAM作為BMSCs附著、增殖和分化的可降解的支架材料，復(fù)合細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子而成。組織工程骨膜結(jié)合了兩者的優(yōu)點，不改變細(xì)胞相容性和HAAM原本的特性，并能夠在一定程度上保護細(xì)胞的生長，從而產(chǎn)生骨膜的結(jié)構(gòu)和功能，其置于骨缺損區(qū)域可誘導(dǎo)成骨的生長［6］。組織工程骨膜既有良好的生物相容性、組織學(xué)和理化特性，又有生物降解性、透明性等優(yōu)點，作為組織工程骨膜支架材料有其獨特的優(yōu)越性［8］。

2 組織工程骨膜分類

2.1 宏觀組織工程骨膜（bionic macrostructure tissue-engineering periosteum） 在生物膜上培養(yǎng)細(xì)胞是制造組織工程骨膜最簡單的方法，可以容易地模仿骨膜的粗糙結(jié)構(gòu)。在體外，BMSCs負(fù)載于生物膜上黏附和增殖良好，已經(jīng)合成了骨膜樣材料。而且受骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）刺激的影響，骨膜樣材料中的成骨細(xì)胞顯示潛在的生長差異。在體內(nèi)，通過BMSCs接種在人脫細(xì)胞真皮上用于骨缺損治療，6～8周骨缺損成功愈合，表明通過在膜的表面上培養(yǎng)細(xì)胞，例如人脫細(xì)胞真皮攜帶BMSCs和骨誘導(dǎo)蛋白可以制造組織工程骨膜［9］。

同種異體骨移植中不存在骨膜及其干細(xì)胞群體，影響骨缺損愈合。Hoffman等［10-11］使用可降解的水凝膠作為BMSCs支架，并將其與干細(xì)胞移植到同種異體移植物表面上，可導(dǎo)致移植物血管化增強及軟骨內(nèi)骨形成增多，再添加額外骨祖細(xì)胞用于共系培養(yǎng)，可預(yù)防骨化延遲，達到組織工程化“擬生態(tài)骨膜”，增強骨缺損治療效果。

靜電紡絲技術(shù)（簡稱“電紡”）是一種在高壓電場作用下形成超細(xì)纖維的聚合物加工技術(shù)，通過控制電紡過程的各種參數(shù)可以制成性能不同的納米纖維支架。電紡納米纖維也是組織工程骨膜制造的有吸引力的基礎(chǔ)。含地塞米松（DEX）的聚乙烯醇（PVA）納米纖維合成具有控制釋放特性的人工骨膜，培養(yǎng)3周后，通過DEX誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，具有高表達的骨基因和蛋白質(zhì)［12］。因此，電紡納米纖維被認(rèn)為是滿足基本要求的人造骨膜。

由法國醫(yī)師 Masquelet等［13］提出的誘導(dǎo)膜（IM）技術(shù)也已經(jīng)用于組織工程骨膜，對35例長骨缺損患者清創(chuàng)后，將骨缺損部位填入骨水泥（聚甲基丙烯酸甲酯，PMMA），在其周圍誘導(dǎo)生物膜形成，6～8周后去除骨水泥，將顆粒狀自體松質(zhì)骨填充骨缺損部位并固定，取得良好治療效果。Cuthbert等［14］用IM技術(shù)治療臨界尺寸骨缺損患者，并與健康股骨干骨膜比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IM誘導(dǎo)的骨膜厚度顯著增加，淋巴細(xì)胞、周細(xì)胞的數(shù)目顯著提高，可表達骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（SDF-1）等關(guān)鍵組織再生因子，并且IM誘導(dǎo)細(xì)胞表達的SDF-1轉(zhuǎn)錄物表達量是健康骨膜細(xì)胞的2倍。IM被認(rèn)為是體內(nèi)合成的組織工程骨膜，是組織工程骨膜的一個典型例子。

2.2 微觀組織工程骨膜（bionic microstructure tissue-engineering periosteum） 雖然相關(guān)研究顯示宏觀組織工程骨膜增強了骨再生，但是與天然骨膜的表面形態(tài)和微結(jié)構(gòu)存在明顯的差異，這可能降低治療效果。為了無限接近天然骨膜的微結(jié)構(gòu)，實驗證明直接使用無細(xì)胞骨膜，使大鼠的顱蓋缺損恢復(fù)良好，顯示骨膜微結(jié)構(gòu)的重要性［15］。為了更好地顯示微觀組織工程骨膜的意義，Shi等［15］在聚乳酸-共-乙醇酸（PLGA）納米片上產(chǎn)生了微槽結(jié)構(gòu)，可指導(dǎo)細(xì)胞優(yōu)選沿著微槽結(jié)構(gòu)方向傳播，以調(diào)節(jié)干細(xì)胞的空間取向并應(yīng)用不同的機械拉伸作用促進成骨細(xì)胞生長，在骨生長和重建中起著重要作用?？梢?，我們應(yīng)該更加重視微觀組織工程骨膜，進一步的探索。

2.3 血管化組織工程骨膜（vascularized tissueengineered periosteum） 在天然骨膜中血管組織豐富，血管生成在骨發(fā)育和骨折修復(fù)中有重要作用，可以為骨膜提供氧氣和營養(yǎng)成分。誘導(dǎo)組織工程骨膜中血管化是一個亟待解決的問題。van Gastel等［16］研究了小鼠骨膜來源細(xì)胞（periosteum derived cells，PDCs）的致血管生成特性，發(fā)現(xiàn)PDCs能表達并分泌VEGF，從而增強內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和存活；與內(nèi)皮細(xì)胞共移植發(fā)現(xiàn)，PDCs可通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞形成周細(xì)胞樣表型來增強血管發(fā)生。VEGF和VEGFR主要參與血管生成，Hah等［17］對人PDCs細(xì)胞的成骨細(xì)胞分化過程進行研究，發(fā)現(xiàn)VEGF、血管內(nèi)皮生長因子受體VEGFR-1、VEGF-2的表達，而外源性人VEGF可刺激PDCs的成骨細(xì)胞分化過程，并且VEGF可充當(dāng)人PDCs的成骨細(xì)胞分化的自分泌生長因子。這些結(jié)果研究表明，骨膜細(xì)胞不僅通過其成骨潛能，而且還通過其促血管生成的特點，有助于骨折修復(fù)，從而為骨再生治療提供理想的細(xì)胞來源。

3 組織工程骨膜治療骨缺損

目前，雖然沒有應(yīng)用于臨床上的大段骨缺損的治療，但是治療小面積骨缺損時有報道。Nagata等［18］將培養(yǎng)的自體骨膜細(xì)胞（CAPCs）、自體骨顆粒和富含血小板的血漿混合，并移植修復(fù)唇腭裂患者的牙槽骨，術(shù)后顯示骨再生良好，骨活檢顯示再生骨周圍聚集成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞并伴隨血管生成，并且CAPCs骨移植的自體骨顆粒的重建速度明顯快于常規(guī)植骨。Pradel等［19］比較組織工程骨和自體松質(zhì)骨治療腭裂患者的療效差別，術(shù)后6個月隨訪發(fā)現(xiàn)，組織工程骨移植組的裂口平均體積低于自體松質(zhì)骨移植組，而組織工程移植組的腭裂缺陷骨化率（40.9%）明顯高于自體松質(zhì)骨移植組（36.6%）。

一直以來大家都認(rèn)為關(guān)節(jié)軟骨損傷（或缺損）為不可逆修復(fù)，伴隨著組織工程骨膜修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷（或缺損）技術(shù)［20］的問世，徹底打破這一定論。Oehi等［21］將體外分離的自體軟骨細(xì)胞接種到膠原蛋白凝膠中，培養(yǎng)21～26 d后移植到軟骨缺損處，治療后可減低患者的疼痛和腫脹，1年后隨訪發(fā)現(xiàn)，患者疼痛消失，移植處形成透明堅固表面光滑的關(guān)節(jié)軟骨，且再生軟骨的硬度與周圍正常軟骨一致，結(jié)果表明通過組織工程制造的軟骨樣組織的移植有望成為長時間獲得軟骨的最有效的技術(shù)，其在缺陷處產(chǎn)生的軟骨與正常軟骨有相似的生物化學(xué)和生物力學(xué)特性。另一種軟骨缺陷修復(fù)方法是基質(zhì)誘導(dǎo)的自體軟骨細(xì)胞移植技術(shù)，即體外培養(yǎng)的自體軟骨細(xì)胞接種到Ⅰ/Ⅲ型膠原膜上，將纖維蛋白注射到缺陷處軟骨表面用以固定膠原膜，膠原膜修剪后移植到軟骨缺損處，使關(guān)節(jié)軟骨再生，臨床療效已經(jīng)得到了證實［22］。

綜上所述，組織工程骨膜技術(shù)應(yīng)用于骨缺損治療，特別是關(guān)節(jié)軟骨損傷的治療，具有較好的臨床效果。但是，組織工程骨膜技術(shù)治療骨缺損仍存在一定的爭議。一些學(xué)者持懷疑態(tài)度，他們認(rèn)為HAAM雖是可降解和吸收材料，但是采取異體間植入骨缺損處是否會產(chǎn)生倫理問題有待商榷。支持者則認(rèn)為這是醫(yī)學(xué)研究的進步，為患者康復(fù)帶來希望。目前，組織工程骨膜在相關(guān)動物實驗中已經(jīng)得到十足發(fā)展，為其將來的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。然而，人工骨膜如何能無限接近天然骨膜，從而滿足骨缺損的臨床需求，如何解決移植物的免疫調(diào)節(jié)等問題仍有待深入研究。

［1］ Blick SS，Brumback RJ，Lakatos R， et al.Early prophylactic bone grafting of high-energy tibial fractures［J］.Clin Orthop RelatRes，1989（240）：21-41.

［2］虞冀哲，董學(xué)海，陳海丹，等.間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于軟骨組織工程的研究進展［J］.生物骨科材料與臨床研究，2015，12（4）：60-64.

［3］Yin F，Guo L，Meng CY，etal.Transplantation ofmesenchymal stem cells exerts anti-apoptotic effects in adult rats after spinal cord ischermia-reperfusion injury［J］.Brain Res，2014，1561：1-10.

［4］ Neirinckx V，Agirman G，Coste C，et al.Adult bone marrow mesenchymal and neural crest stem cells are chemoattractive and accelerate motor recovery in amousemodel of spinal cord injury［J］.Stem CellRes Ther，2015，6：211.

［5］楊志明.組織工程［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2001：41-43.

［6］ Okabe M，Kitagawa K，Yoshida T，et al.Hyperdry human amniotic membrane is useful material for tissue engineering：physical， morphological properties， and safety as the new biological material［J］.J Biomed Mater Res A， 2014， 102（3）：862-870.

［7］ Muhonen V， Salonius E， Haaparanta AM， et al.Articular cartilage repair with recombinant human type II collagen/polylactide scaffold in a preliminary porcine study［J］.JOrthop Res，2016，34（5）：745-753.

［8］Robinson D，Bab I，Nevo Z.Osteogenic growth peptide regulates proliferation and osteogenicmaturation of human and rabbit bone marrow stromal cells［J］.JBone Miner Res， 1995，10 （5）：690-696.

［9］ Lai JY， Lue SJ， Cheng HY， et al.Effect of matrix nanostructure on the functionality of carbodiimide cross-linked amniotic membranes as limbal epithelial cell scaffolds ［J］.J Biomed Nanotechnol， 2013，9（12）：2048-2062.

［10］ Hoffman MD， Xie C， Zhang X， et al.The effect of mesenchymal stem cells delivered via hydrogelbased tissue engineered periosteum on bone allograft healing ［J］.Biomaterials，2013，34（35）：8887-8898.

［11］ Hoffman MD， Benoit DS.Emulating native periosteum cell population and subsequent paracrine factor production to promote tissue engineered periosteummediated allograft healing［J］.Biomaterials，2015，52：426-440.

［12］ Su WT，Chiou WL，Yu HH，etal.Differentiation potential of SHEDs using biomimetic periosteum containing dexamethasone［J］.Mater SciEng CMater Biol Appl，2016，58：1036-1045.

［13］ Masquelet AC， Fitoussi F，Begue T， et al.Reconstruction of the long bones by the induced membrane and spongy autograft［J］.Ann Chir Plast Esthet， 2000， 45 （3）： 346-353.

［14］ Cuthbert RJ， Churchman SM， Tan HB， et al.Induced periosteum a complex cellular scaffold for the treatment of large bone defects［J］.Bone，2013，57（2），484-492.

［15］ Shi X，F(xiàn)ujie T，Saito A，et al，Periosteum-mimetic structuresmade from freestandingmicrogrooved nanosheets［J］.Adv Mater，2014，26（20）：3290-3296.

［16］ van Gastel N，Torrekens S，Roberts SJ， et al.Engineering vascularized bone：osteogenic and proagiogenic potential of murine perioteal cells［J］.Stem Cells， 2012， 30 （11）：2460-2471.

［17］ Hah YS，Jun JS，Lee SG，et al.Vascular endothelial growth factor stimulates osteoblastic differentiation of cultured human periosteal-derived cells expressing vascular endothelial growth factor receptors［J］.Mol Biol Rep，2011，38 （2）：1443-1450.

［18］NagataM，Hoshina H，LiM，etal.A clinical study ofalveolar bone tissue engineering with cultured autogenous periosteal cells：coordinated activation of bone formation and resorption［J］.Bone，2012，50（5）：1123-1129.

［19］PradelW，Lauer G.Tissue-engineered bone grafts for osteoplasty in patients with cleft alveolus［J］.Ann Anat，2012，194（6）：545-548.

［20］Crawford DC，DeBerardinoTM，Williams RJ 3rd.NeoCart，an autologous cartilage tissue implant，compared with microfracture for treatment of distal femoral cartilage lesions：an FDA phase-II prospective，randomized clinical trial after two years［J］.JBone JointSurg Am，2012，94（11）：979-989.

［21］OchiM，Uchio Y，Tobita M， etal.Current concepts in tissue engineering technique for repair of cartilage defect［J］.Artif Organs，2001，25（3）：172-179.

［22］CraigW，Wood DJ，Zheng MH，etal.A current review on the biology and treatment of articular cartilage defect ［J］.J MusculoskeletRes，2003，7：157-181.