單 芬吳其銳鄒潔建花福有陳 武*

(1.廣州動物園，廣州，510070；2.廣東省野生動物救護中心，廣州，510635；3.深圳野生動物園，深圳，518055)

犬瘟熱病毒(canine distemper virus，CDV)屬于副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒屬(Morbillivirus)成員。感染的宿主范圍較廣，包括浣熊科(Procyonidae)、熊科(Ursidae)、靈貓科(Niverridae)、鬣狗科(Hyaenidae)、貓科(Felidae)及鼬科(Mustelidae)等動物[1]。2014年12月陜西珍稀野生動物救護中心4只大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)感染犬瘟熱死亡，開始對這個疫病的重視。

東北虎(Pantheratigrisaltaica)是我國Ⅰ級保護動物，為瀕危物種，Tracie A等研究學(xué)者在2013年通過RT-PCR及免疫組化(IHC)等方法證實了2只出現(xiàn)典型神經(jīng)癥狀的野外東北虎死于CDV感染[2]，而國內(nèi)尚未見虎感染CDV的相關(guān)報道。隨著生態(tài)環(huán)境的變化和CDV對動物流行病因素的適應(yīng)，加之CDV 變異株的出現(xiàn)，目前犬瘟熱呈現(xiàn)的發(fā)病率和致死率有所升高、感染動物的宿主范圍有擴大的趨勢。本研究從死亡東北虎身上采集病料組織通過細胞培養(yǎng)、RT-PCR等方法進行分離鑒定，并對H基因全序列進行分子特征和遺傳演化分析，為野生動物特別是瀕危貓科動物CDV的有效防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本

病料樣本來自廣東某地感染CDV病死東北虎的組織。病患臨床癥狀表現(xiàn)為精神沉郁、運動失調(diào)、抽搐等神經(jīng)癥狀，經(jīng)抗生素等治療無效而死亡。病料組織于研缽在冰上剪碎，加上PBS 充分研磨，待研磨完全后，8 000 r /min 高速離心25 min 后取上清液，用0.2 μm 濾膜過濾，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

ExTaqDNA 聚合酶、克隆載體pMD18-T、AMV Reverse Transcriptase、dNTPs、工程菌JM109等購自大連寶生物工程公司；Trizol、RNase Inhibitor 購自Invitrogen公司；膠回收試劑盒購自天根生物科技有限公司；Vero細胞由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院傳染病實驗室保存；DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、新生胎牛血清購自Hyclone 公司。

1.3 細胞復(fù)蘇及病毒培養(yǎng)

從-80 ℃取出凍存的Vero 細胞，置于37 ℃水浴鍋水浴5 min，800 r /min 離心3 min，棄去上清，加入含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基吹打混勻后，分裝在細胞培養(yǎng)瓶中，置于細胞培養(yǎng)箱37 ℃靜置培養(yǎng)。待Vero 細胞長至80% 后，棄去培養(yǎng)基，加入1 mL 制備好的病毒液接種細胞，放入細胞培養(yǎng)箱，37 ℃靜置培養(yǎng)2 h，待病毒吸附后，棄去病毒液。加維持液繼續(xù)放于細胞培養(yǎng)箱37 ℃靜置培養(yǎng)，盲傳3代后，再接種細胞，每日觀察細胞CPE，當(dāng)CPE達到80% 時收獲病毒液，分裝凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.4 基因克隆和測序

使用E.Z.N.A.Viral RNA Kit(OMEGA，美國)進行病毒RNA 的提取，參照SuperScript III(Invitrogen，美國)操作說明進行反轉(zhuǎn)錄。用犬瘟熱病毒基因特異性引物，PCR擴增CDV H基因保守片段，引物由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院傳染病實驗室提供，鑒定引物信息如下：上游 5′-ATAGATGTCTTGACACCGCTCTT-3′，下游 5′-GTACATACCTTGGCTTTGGAACT-3′，目的片段預(yù)計大小為580 bp。參考NCBI中犬瘟熱病毒H基因全長序列，設(shè)計H基因全長擴增引物，引物序列略。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收后，與pMD18-T 載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，初步鑒定正確的重組質(zhì)粒由深圳華大基因公司測序。

1.5 序列分析

用Lasergene Version 7.1 軟件的SeqMan拼接所得的基因序列，測得序列登陸NCBI，與GenBank中不同犬瘟熱的H基因序列進行BLAST分析。同時與下載不同基因型的犬瘟熱病毒序列采用MegAlign進行不同序列、氨基酸比較分析。采用MEGA 5.1軟件繪制其H基因的系統(tǒng)進化樹。進化樹的繪制方法如下：應(yīng)用Neighbor-joining 法(參數(shù)設(shè)置為1 000 replications)、最大似然法(ML 法)、貝葉斯法(BI 法)構(gòu)建的分子系統(tǒng)進化樹及Maximum composite likelihood model 比對核苷酸序列。采用NetNGlyc1.0軟件進行糖基化位點分析。

2 結(jié)果

2.1 病毒的細胞分離

病料經(jīng)過Vero細胞盲傳3代后再接種Vero細胞，到第3天時細胞培養(yǎng)基中出現(xiàn)明顯的細胞脫落和死亡；第4天，出現(xiàn)明顯的塊狀細胞脫落，細胞CPE病變明顯。圖1、圖2所示為病料肺、腎組織接種Vero細胞傳代6次之后的細胞變化。

圖2 Vero細胞肺6代Fig.2 The sixth generation of Vero cells in lung

2.2 犬瘟熱H基因特異性鑒定引物的RT-PCR擴增結(jié)果

提取犬瘟熱病毒的RNA，經(jīng)RT-PCR擴增、1%的瓊脂糖凝膠電泳之后，結(jié)果得到大小約為580 bp的目的基因片段，結(jié)果與預(yù)期大小一致，其中泳道1、2、3、4分別為不同臟器組織樣本的擴增結(jié)果(圖3)。

2.3 H基因的序列及遺傳演化分析

獲得的H基因序列經(jīng)DNASTAR Version 7.1 軟件包中的seqman 軟件拼接正確無誤后，命名為CDV-1，登陸NCBI，經(jīng)BLAST 分析，各基因與GenBank中核苷酸序列相似性最高的毒株列于表1。從表中可以看出分離株的H基因與1999年中國小熊貓(Ailurusfulgens)源分離株、2014年中國東北虎源的犬瘟熱病毒分離株的H蛋白核苷酸序列相似性最高，均為99%。

圖3 RT-PCR擴增的H基因Fig.3 RT-PCR amplification of H geneM：DL 2 000 marker；1、2、3、4：H 基因PCR擴增產(chǎn)物；5：陰性對照；6：陽性對照M：DL 2 000 marker；1、2、3、4：H gene；5：Negative control；6：Positive control

表1 分離株與GenBankTM中核苷酸序列相似性最高的毒株

Tab.1 Homology of the isolate H genes from siberian tiger with the related sequences in GenBankTM

登陸GenBank下載不同基因型的CDV代表毒株，采用MegAlign軟件進行核苷酸序列及編碼氨基酸的比對分析。其中本分離株與標(biāo)準(zhǔn)強毒株A15/17的氨基酸相似性為96.2%；而與經(jīng)典疫苗Onderstepoort株的氨基酸序列相似性僅為89.8%；與其他疫苗株SH、CDV3、Convac、lederle的氨基酸序列相似性分別為91.6%、91.6%、91.3%、91.8%；與其他Asia-1基因型的毒株相比氨基酸序列相似性在95.9%～97.5%之間。不同CDV分離株氨基酸序列相似性比對結(jié)果詳見圖4。

采用MEGA 5.1軟件繪制CDV H基因的系統(tǒng)進化樹，采用3種方法構(gòu)建H基因進化樹，3種方法的拓撲結(jié)構(gòu)完全一致，結(jié)果見圖5。由圖5可知：本研究分離株CDV-1位于Asia-1，和目前我國犬瘟熱流行毒株流行情況一致。與疫苗株屬于的America-1(Vaccine strain)親緣關(guān)系較遠。在Asia-1基因分支內(nèi)，與另外一株東北虎源分離株一起形成一個小的進化分支。CDV分離株遺傳演化分析結(jié)果詳見圖5。

圖4 不同CDV分離株氨基酸序列相似性比對Fig.4 Similarity comparison of amino acid sequences between different CDV isolates

圖5 不同CDV毒株H基因遺傳演化分析Fig.5 The phylogenetic tree of CDV strains based on H gene sequence

CDV H蛋白作為重要的膜蛋白，主要通過與宿主體內(nèi)SLAM受體的結(jié)合從而可以復(fù)制。研究表明H蛋白個別氨基酸位點改變會影響與SLAM受體的結(jié)合能力。文獻報道這些位點集中在525、526、529、530、549等位點。分析發(fā)現(xiàn)本分離株的這幾個位點氨基酸與強毒株A75/17完全一致，與疫苗株相比530、549位氨基酸差異明顯。詳細情況見表2。

本研究毒株H蛋白氨基酸序列與其他Asia-1型毒株相比在V47、M50、N77、R110、F198、T245、S265、N277、V337、A365、S388、V522等位點發(fā)生變異。

大量研究表明，H蛋白的糖基化位點的個數(shù)和位置與病毒的復(fù)制能力有關(guān)。采用NetNGlyc1.0軟件進行H蛋白糖基化位點分析，結(jié)果顯示：本研究的分離株具有9個糖基化位點，其中包括309-311位的野毒株特有的糖基化位點。而疫苗OP株僅有4個、其他幾個疫苗株均含有7個。本研究毒株在其他位點沒有發(fā)現(xiàn)新增的糖基化位點，這和大量文獻中報道的流行毒株的情況相對一致，其他基因型的野毒株含有8個或9個糖基化位點。詳細情況見表3。

表2 不同毒株與SLAM受體結(jié)合位點分析

Tab.2 Analysis of binding sites of SLAM receptor in different strains

表3 不同毒株N-糖基化位點

Tab.3 Distribution status of N-glycosylation sites of H gene in different genetypes of CDV

注：N代表糖基化位點；— 代表無此糖基化位點

Note：N N-glycosylation sites；— Negative

3 討論

3.1 犬瘟熱(CDV)H蛋白的氨基酸變異

H蛋白作為犬瘟熱病毒表面膜蛋白，還協(xié)助病毒的另一囊膜糖蛋白F蛋白介導(dǎo)病毒囊膜與細胞膜發(fā)生膜融合，使病毒進入細胞[3]。研究證明：CDV感染動物，宿主體內(nèi)至少存在兩種受體，其中一種就是淋巴細胞信號活性分子(Signaling lymphocytic activation molecule，SLAM)，CDV利用此受體，首先在呼吸道淋巴細胞及巨噬細胞中大量繁殖，進而隨淋巴液和血液循環(huán)，侵染全身各免疫細胞[4]。大量實驗研究證明CDV H蛋白個別氨基酸位點改變就會影響與SLAM受體的結(jié)合，從而使毒株在細胞內(nèi)表達發(fā)生重要改變[5-7]。A75/17毒株被看作是犬瘟熱病毒典型的強毒株A75/17 H 蛋白的Y525、D526 和 R529 是其與 SLAM 受體結(jié)合的關(guān)鍵位點。本研究毒株與其相比這3個位點的氨基酸完全一致。這次分離的毒株是否為強毒株，毒力研究還在進一步實驗中。研究還表明野毒株的H蛋白530和549位點的改變也會出現(xiàn)與SLAM 受體結(jié)合的差異，本研究毒株549位氨基酸為Y，和A75/17等部分野毒株一致，而疫苗株Onderstepoort、CDV3、SH、Convac等則為H，而2013年Tracie A等[2]報道的俄羅斯遠東地區(qū)東北虎源CDV分離株H蛋白也具有549 Y的特點。本研究分離株的H蛋白的530位為G，與部分強毒株如A75/17等一致，而與所有疫苗株相比均存在差異，CDV3、SH等為N，而OP株則為S。此外，本研究毒株H蛋白氨基酸序列與其他Asia-1型毒株相比在V47、M50、N77、R110、F198、T245、S265、N277、V337、A365、S388、V522等位點發(fā)生變異，這些關(guān)鍵位點氨基酸的變異，一方面彰顯在高強度疫苗免疫壓力下病毒發(fā)生變異，另一方面究竟這些變異與病毒的感染宿主、病毒的流行特點等是否有關(guān)還有待進一步研究。

H蛋白的糖基化位點的變化與病毒的毒力有明顯關(guān)系，對本研究毒株H蛋白氨基酸分析表明：潛在N-末端糖基化位點與疫苗株也不同，本毒株具有9個，而目前最常用的疫苗株Onderstepoort株為4個、Convac株的糖基化位點為7個，和其他野毒株一樣，具有309-311位的特有糖基化位點。本研究毒株的H蛋白糖基化位點與目前流行的野毒株相比沒有發(fā)生明顯變異，但是與現(xiàn)行疫苗株相比存在明顯差異，目前市售疫苗能否給臨床動物提供足夠抗體保護還有待研究。

3.2 犬瘟熱(CDV)的基因型

CDV的基因型與地理位置有關(guān)，基于H基因全長序列分析，根據(jù)病毒分離株地域流行特點將其分為7個主要基因型：America-1(疫苗株)、America-2、Asia-1、Asia-2、Europe、Artic-like和European野生型。還有些學(xué)者將其分為Africa、Asia、Argentina等基因型，其實也是基于病毒地域流行的特點[8]。本研究中虎源CDV分離株屬于Asia-1和國內(nèi)流行的毒株保持一致，與2013年Tracie A等報道的俄羅斯遠東地區(qū)東北虎源CDV分離株的基因型(Artic-like)存在明顯差異[2]，這可能與CDV在不同地區(qū)流行株氨基酸之間存在較大差異有關(guān)。本分離株基因型與疫苗株基因型(America-1)也差異較大，這可能與高強度的疫苗免疫壓力下，流行毒株發(fā)生變異的可能性較大。

目前國內(nèi)尚未有虎源犬瘟熱感染的報道，CDV不僅僅是引起家犬死亡的第二大病原，同時也是在全球范圍內(nèi)威脅野生食肉動物健康的重要病原，較多動物種類在病原的傳播過程中起著病毒存儲器的作用，而疫苗接種是控制本病發(fā)生的最好方法[9]。而目前并沒有針對圈養(yǎng)野生動物的犬瘟熱疫苗，市面上針對寵物的犬瘟熱疫苗應(yīng)用于野生動物時候應(yīng)格外慎重，可能會引起動物的發(fā)病甚至死亡[10]。Seimon等研究中指出通過免疫家犬來達到保護野外東北虎的目的[2]，因為有東北虎捕獵家犬的案例發(fā)生，這項建議對于以豬肉、雞肉為食的圈養(yǎng)虎則不適用，而直接免疫老虎，這顯然存在一定的安全隱患。在疫苗的選擇方面重組載體疫苗在安全性和有效性具有獨特優(yōu)勢而應(yīng)該被優(yōu)先推薦，但是由于商品采購困難等原因，在實際的臨床使用中存在一定限制。

本研究在國內(nèi)首次分離了一株虎源CDV，并對病毒的H蛋白進行系統(tǒng)分析，在目前缺乏野生動物犬瘟熱疫苗的情況下，了解流行毒株的分子生物學(xué)特點、流行毒株的病毒變異情況，對于該病的有效防控有重要意義。同時也要求野生動物研究人員平時應(yīng)注重對易感動物如小熊貓、虎、狼(Canislupus)等CDV血清學(xué)抗體等數(shù)據(jù)的積累，對CDV在圈養(yǎng)野生動物中的流行情況做詳細調(diào)查，同時積極從事專項用于野生動物犬瘟熱防控疫苗的研究。

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