韋中強(qiáng)++韓如剛++李娜++韓量++秦靜

摘要 為了探討藥用植物黃精根際土著AM菌根真菌地球囊霉孢子在人工接種條件下，不同接種體數(shù)量對擴(kuò)繁試驗(yàn)的影響，本文采用1%水瓊脂作為活性孢子萌發(fā)培養(yǎng)基，以三葉草為接種宿主，在宿主種植密度為10株/dm2條件下，分別采用單孢、4孢、20孢接種處理，研究繁殖體擴(kuò)繁數(shù)量的變化。結(jié)果表明，單孢接種繁殖系數(shù)最高（4 200），4孢接種中等（1 562），20孢接種最低（365）；孢子產(chǎn)量則以20孢接種最高，4孢接種次之，單孢接種最小?？梢钥闯?，不同接種體擴(kuò)繁效應(yīng)存在顯著差異。該結(jié)果為土著AM真菌的純化及擴(kuò)繁培養(yǎng)提供了簡易可行的途徑。

關(guān)鍵詞 藥用植物；黃精；土著AM真菌；擴(kuò)繁；繁殖系數(shù)

中圖分類號 S567 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）03-0080-02

菌根（mycorrhiza）是自然界中一種普遍的植物共生現(xiàn)象。AM真菌在植物根際形成的龐大菌絲網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)能顯著促進(jìn)作物礦物質(zhì)養(yǎng)分和水分的吸收利用[1]，促進(jìn)其生長發(fā)育，改善水分狀況，提高抗旱性、抗病性，增強(qiáng)作物對鹽堿和重金屬毒害的耐性，改良土壤，提高作物產(chǎn)量，改善品質(zhì)，對實(shí)現(xiàn)植物根際土壤生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展具有重要實(shí)踐價值[2-3]。近年來，菌根技術(shù)在農(nóng)業(yè)上的開發(fā)利用已取得了進(jìn)展，獲得了顯著經(jīng)濟(jì)效益，越來越受到了世界各國的普遍關(guān)注。

我國VA菌根真菌資源豐富，生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)，廣泛存在于各種生態(tài)環(huán)境中。AM真菌是專性活體營養(yǎng)微生物，在無宿主存在的離體培養(yǎng)中，目前的技術(shù)還不能使這些真菌完成整個生活史，由此成為進(jìn)一步開發(fā)和利用AM真菌的重大障礙。但是由于AM真菌具有一定的無宿主發(fā)育能力，對人類有巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益，促使研究人員開展了大量研究工作，希望能尋找到促進(jìn)AM真菌在離體條件下可以完成其生活史的各種化學(xué)物質(zhì)——AM真菌生長促進(jìn)物質(zhì)（stimulators），實(shí)現(xiàn)離體培養(yǎng)條件下完成AM真菌生活史的愿望，生產(chǎn)出高純度、無污染、低成本的商品AM菌劑。本試驗(yàn)開展了AM真菌地球囊霉（G. geospora Gerdemann）的單孢及多孢擴(kuò)繁試驗(yàn)，現(xiàn)將結(jié)果總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

宿主植物：三葉草（Trifolium reperns）。AM菌劑：黃精根際土壤分離的VA菌根真菌地球囊霉（G. geospora Gerdemann）。盆栽缽：市場上購買的白色塑料缽，缽高16 cm，上口內(nèi)徑18 cm，面積為254.34 cm2，底部內(nèi)徑12 cm。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

用AM真菌不同接種體（孢子）數(shù)量接種培養(yǎng)在特殊基質(zhì)上的三葉草根系，即設(shè)3個處理，分別為單孢接種、4孢接種、20孢接種，6次重復(fù)。3個月后取培養(yǎng)基質(zhì)提取分離新生孢子，統(tǒng)計(jì)分析產(chǎn)孢數(shù)量，確定繁殖效益。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制。取直徑7 cm洗凈的培養(yǎng)皿，倒入10 mL 1.0%水瓊脂培養(yǎng)基，5皿一組疊放，用雙層鋁箔將其包裹，高溫高壓（θ=121 ℃，φ=0.1 MPa）滅菌15 min，晾至室溫取出，移入接種箱內(nèi)待用。

1.3.2 孢子表面消毒。采用濕篩傾斜法[4]分離提取的地球囊霉孢子，在光學(xué)解剖鏡下挑出細(xì)胞質(zhì)均勻一致的生活孢子，42 KHz超聲波水浴振蕩片刻去掉孢子表面的雜物，蒸餾水漂洗數(shù)次后，將孢子轉(zhuǎn)入直徑為3.0 cm的小玻璃培養(yǎng)皿中移入接種箱內(nèi)，滴加幾滴2%（W/V）氯銨T-200 mg/L鏈霉素-100 mg/L慶大霉素-吐溫20液[5]，蓋好上皿，進(jìn)行孢子表面消毒15 min。與此同時，接種箱內(nèi)盛有滅菌培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿及所有用具也在紫外燈下表面滅菌15 min。

1.3.3 接種培養(yǎng)。2015年2月20日，將表面消毒后的孢子，經(jīng)滅菌蒸餾水漂洗數(shù)次后，用特制的塑料小吸管分別將孢子接種在滅菌培養(yǎng)基表面，每皿分別接種1個、4個、20個孢子，孢子在皿中成均勻排布，用封口膜封固上下皿，20個重復(fù)。30 ℃暗箱培養(yǎng)10 d，絕大多數(shù)孢子萌發(fā)，待用。

1.3.4 盆栽基質(zhì)的制備。取腐殖土和黃精園土，按體積比1∶1混合，pH值5.8、含磷量12.7 mg/kg、有機(jī)質(zhì)含量4.12%。高溫高壓（θ=121 ℃，φ=0.1 MPa）滅菌2 h，晾至室溫取出備用。

1.3.5 接種盆栽培養(yǎng)。2015年3月1日，孢子經(jīng)表面消毒后，在1%水瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，選用萌發(fā)的單孢、4孢、20孢的地球囊霉孢子分別接種在播種有經(jīng)表面消毒的三葉草種子的培養(yǎng)基質(zhì)中，將培養(yǎng)10 d已經(jīng)萌發(fā)的AM真菌孢子及其瓊脂培養(yǎng)物一并倒入已裝好的滅菌土的盆缽?fù)帘砻嬉韵? cm左右，再覆土，每盆裝培養(yǎng)土1 kg，然后在表面播入已表面消毒的三葉草種子30粒，成苗后定苗25株，宿主植物種植密度為10株/dm2。為了保溫、保濕并減少被雜菌污染和病原菌侵染的機(jī)會，在盆缽上罩上透明白色的保鮮袋。在以后的培養(yǎng)期內(nèi)，每隔10 d補(bǔ)充10 mL的Hoagland營養(yǎng)液，3個月后檢測孢子數(shù)量。

1.3.6 收獲、取樣檢測。2015年6月30日，收獲三葉草培養(yǎng)基質(zhì)，晾干后，各取10 g用濕篩傾斜法分離介質(zhì)中的孢子，體視顯微鏡下計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

由表1可知，在培養(yǎng)基質(zhì)、宿主植物種類、宿主種植密度（10株/dm2）以及培養(yǎng)條件相同的情況下，單孢接種、4孢接種和20孢接種的孢子產(chǎn)量有顯著差異，以20孢接種的處理孢子產(chǎn)量最大。因此，為獲得較高的繁殖體產(chǎn)量，以接種較高的繁殖體數(shù)量為宜。但是，從統(tǒng)計(jì)結(jié)果看，4孢和20孢接種的孢子產(chǎn)量并不是單孢接種的孢子產(chǎn)量的對應(yīng)倍數(shù)，相比之下，單孢接種者繁殖系數(shù)最高（4 200）、效益最好，4孢接種中等（1 562），20孢接種最低（365），接種體孢子的數(shù)量與繁殖系數(shù)成負(fù)相關(guān)（圖1）。同時，單孢擴(kuò)繁者的后代遺傳性質(zhì)較為一致，能夠滿足更高的科學(xué)研究和遺傳育種需要。endprint

3 結(jié)論與討論

宿主種植密度為10株/dm2且其他培養(yǎng)條件相同時，地球囊霉多孢繁殖可獲得較多的再生孢子數(shù)量，單孢繁殖則能獲得更高的繁殖系數(shù)。本文在Fracchiaa等的方法基礎(chǔ)上略加改良，進(jìn)行地球囊霉的單孢、4孢和20孢萌發(fā)接種三葉草擴(kuò)繁試驗(yàn)，最終都獲得了再生孢子，表明地球囊霉是可以進(jìn)行單孢活體盆栽擴(kuò)繁培養(yǎng)的。這為G. geospora Gerdemann的純系培養(yǎng)提供了一個簡易可行的途徑，適于科研上需要的少量接種物的培養(yǎng)，或應(yīng)用于經(jīng)過多代的Ri T-DNA轉(zhuǎn)型根[6]培養(yǎng)后AM真菌遺傳穩(wěn)定性的恢復(fù)，從而防止AM真菌侵染率的下降。目前，菌根真菌尚不能進(jìn)行純培養(yǎng)，菌劑培養(yǎng)周期長、擴(kuò)繁效率低，限制了菌根在實(shí)際生產(chǎn)中的推廣。該試驗(yàn)結(jié)果表明，在相同的培養(yǎng)條件下，單孢接種繁殖系數(shù)高。單孢培養(yǎng)純度高、遺傳變異小，可滿足科學(xué)研究上的少量使用；多孢培養(yǎng)產(chǎn)量高，可在一定程度上滿足生產(chǎn)使用。

4 參考文獻(xiàn)

[1] VAN DER HEIJDEN M G A，KLIRONOMOS J N，URIC M，et al.Mycorrhizal fungal diversity determines plant biodiversity，ecosystem variability and productivity[J].Nature，1998，396：69-72.

[2] 陳敏，王和勇，廖志華，等.發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的藥用植物遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2000，12（3）：98-102.

[3] 郭良棟.內(nèi)生真菌研究進(jìn)展[J].菌物系統(tǒng)，2001，20（1）：148-152.

[4] DANIELS B A，SKIPER H D.Methods and principles of mycorrhizal research[M].St. Paul，Minn.：American Phytopathological Society，1982：29-35.

[5] 董昌金，鄭世學(xué)，鄭斌，等.球囊霉屬幾種AM真菌孢子表面消毒與萌發(fā)的研究[J].菌物系統(tǒng)，2003，22（3）：410-416.

[6] 劉琴，吳震，翁忙玲，等.發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒及其在植物科學(xué)中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報(bào)，2002（5）：21-25.endprint