魏愛泓，矯新明，毛成責(zé)，林明洵，黃金鑫，樓夢嵐，廖啟智，唐磊，王長友

1. 江蘇省海涂研究中心(江蘇省海洋環(huán)境監(jiān)測預(yù)報中心)，南京 210036 2. 南京信息工程大學(xué) 海洋科學(xué)學(xué)院，南京 210044

重金屬汞是全球范圍內(nèi)備受關(guān)注的持久性環(huán)境污染物之一，許多國家及國際機構(gòu)將其列為污染物排放最優(yōu)先考慮的控制目標(biāo)[1]。20世紀(jì)80年代以來，每年僅通過徑流輸入進(jìn)入我國海洋的汞達(dá)40噸以上，造成遼東灣、膠州灣等我國近海部分海域海水汞污染風(fēng)險較大[2]。進(jìn)入海洋的汞污染物不能降解，只能通過顆粒沉降進(jìn)人沉積物才能離開海洋，但這又對底棲生物造成危害。此外，沉積物中有機組分礦化及生物擾動會促使汞釋放出來重新進(jìn)入水體[3]，造成汞的二次污染，危害海洋生物。汞危害性極大，不僅引起生物的急性毒性效應(yīng)，還能在生物體內(nèi)富集，沿食物鏈轉(zhuǎn)移，對海洋生態(tài)系統(tǒng)造成難以逆轉(zhuǎn)的損害[4-5]。

自20世紀(jì)80年代開始我國涉海高等院校和科研機構(gòu)紛紛開展了針對汞的海洋生態(tài)毒理學(xué)研究。受試生物包括浮游植物、雙殼類、甲殼類和魚類等多種海洋生物，毒性效應(yīng)指標(biāo)(反應(yīng)終點)涵蓋光合作用、生長、濾食、呼吸、行為、發(fā)育和繁殖等諸多方面，涉及生物累積與生物排放、生物轉(zhuǎn)移與放大、生物轉(zhuǎn)化與生物降解等諸多生物作用過程[4-16]。另外，也有文獻(xiàn)涉及到汞污染物對海洋生物的致畸和致突變現(xiàn)象以及海洋生物致毒和解毒機制的研究[7,13,15]。

為保護(hù)海洋生物免受汞的危害，需加強汞污染物入?？刂?，明確海水汞污染物對海洋生物的毒性效應(yīng)。目前關(guān)于汞污染物對海洋生物尤其底棲生物的毒性效應(yīng)數(shù)據(jù)還不是很多。本文以典型近海底棲雙殼類生物毛蚶和紫貽貝作為受試生物，研究汞污染物急性和慢性毒性效應(yīng)，分析計算汞的非效應(yīng)濃度及半致死濃度。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

毛蚶(Scapharcasubcrenata)、紫貽貝(Mytilusedulis)取自于江蘇贛榆近岸養(yǎng)殖水域。采集后立刻帶回實驗室后用海水沖凈其表面的淤泥及附著物，挑選健康、反應(yīng)靈敏的紫貽貝/毛蚶放入盛有100 L海水的水槽暫養(yǎng)。采用半靜水方式暫養(yǎng)3～7 d，連續(xù)充氣；每24 h更換培養(yǎng)水體的1/2。所有紫貽貝/毛蚶進(jìn)行3 d饑餓處理，從第4天開始每天投螺旋藻粉(日投餌量為貝類軟體部鮮重的0.6%，約0.1%～0.2%濕重)至正式實驗開始[17]。實驗前1 d停止投餌，選擇健康、反應(yīng)靈敏、大小基本一致的個體隨機分組。

在塑料桶(50 L)中放入自來水，添加海水素(益爾牌)并攪拌均勻，配制鹽度為20‰的人工海水，放置1 d后作為受試生物培養(yǎng)液。配制1 mg·L-1氯化汞(分析純，美國Spectrum Chemical公司生產(chǎn))溶液作為儲備液，再稀釋成各處理組濃度。

1.2 實驗方法

1.2.1 急性暴露實驗

在20 L玻璃水槽(內(nèi)徑37 cm×27 cm×20 cm)內(nèi)放入培養(yǎng)液5 L，隨機投放經(jīng)過24 h饑餓處理、健康活潑紫貽貝/毛蚶15只。毛蚶平均體長2.27 cm(2.16～2.39 cm)，平均體質(zhì)量4.0 g(3.8～4.5 g)，紫貽貝平均體長5.19 cm(5.05～5.40 cm)，平均體質(zhì)量14.1 g(13.2～15.4 g)，年齡均約10個月。采用半靜水方式培養(yǎng)，連續(xù)充氣。實驗期間不投餌。每24 h更換培養(yǎng)水體的1/2。實驗濃度梯度取值采用等差或等比方法，并結(jié)合預(yù)實驗結(jié)果進(jìn)行設(shè)置，每個污染物設(shè)置5個濃度處理組，每組2個平行樣，以天然海水為空白對照組，進(jìn)行96 h急性毒性實驗。每24 h觀察并記錄紫貽貝/毛蚶的死亡率，死亡標(biāo)準(zhǔn)是個體外套膜松弛、長時開口，用玻璃棒輕觸外套膜緣5 min內(nèi)無反應(yīng)，及時撈出死亡個體。實驗開始時測量其體質(zhì)量和體長。

表1 氯化汞對毛蚶、紫貽貝毒性實驗各處理組濃度(HgCl2, μg·L-1)Table 1 Concentrations of HgCl2 prepared for the exposure of Scapharca subcrenata and Mytilus edulis in the toxic effect test (HgCl2, μg·L-1)

1.2.2 慢性暴露實驗

在20 L水槽內(nèi)放入培養(yǎng)液5 L，隨機投放經(jīng)過24 h饑餓處理、健康活潑毛蚶/紫貽貝40只。毛蚶平均體長2.83 cm(2.76～2.91 cm)，平均體質(zhì)量7.2 g(6.8～7.6 g)，紫貽貝平均體長5.04 cm(4.86～5.15 cm)，平均體質(zhì)量12.8 g(11.4～13.9 g)。采用半靜水式培養(yǎng)，每24 h更換培養(yǎng)水體的1/2后補充污染物至初始濃度。每天固定時間各投喂螺旋藻粉1次(日投餌量為貝類軟體部鮮重的0.6%，約0.1%～0.2%濕重)。其他培養(yǎng)條件與急性毒性試驗期間相同。參考急性毒性試驗的結(jié)果優(yōu)化污染物濃度設(shè)置，實驗設(shè)置5個濃度處理組，1組空白對照組。每實驗組設(shè)2個平行。實驗開始后，于4、8、12、16、20 d取樣，每組隨機選取2只，用于蛋白質(zhì)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定。實驗期間觀察各組有無毛蚶、紫貽貝個體死亡。于實驗開始、5、9、13、17、21 d及結(jié)束時，應(yīng)用電子臺秤5臺(精度0.1 g)測量受試生物濕重，應(yīng)用游標(biāo)卡尺(精度0.01 mm)測量受試生物體長。

用大剪刀或螺絲刀在毛蚶/紫貽貝殼上鉆孔后并迅速撬開，將偽足上方包裹黑色部位的肌肉分離，黑色部位前半段即為其消化腺，置于稱量紙上稱量，冰浴暫時保存。取消化腺組織，加入適量冰浴預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，冰浴進(jìn)行勻漿1 min(使用玻璃勻漿器)。隨后勻漿液10 000 g、4 ℃離心10 min，上清即為待測樣品，樣品按量分裝成4～6份，-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用碧云天的總SOD活性檢測試劑盒(WST-8法)，應(yīng)用可見光分光光度計法測定SOD酶活力。其中PBS緩沖液按實驗室常用配制方法配制(NaCl 8 g·L-1; KCl 0.2 g·L-1; Na2HPO41.42 g·L-1; KH2PO40.27 g·L-1)，測定波長450 nm。主要原理是通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑作用下呈現(xiàn)紫色，利用分光光度計測定吸光度值，然后計算樣品中的SOD酶活力。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

采用Log-logistic模型計算受試生物L(fēng)C05和LC50及其置信區(qū)間[18]。Log-Logistic模型：

(1)

式中，y為效應(yīng)指標(biāo)，c為污染物濃度，x為效應(yīng)百分?jǐn)?shù)，a為c=0時的效應(yīng)指標(biāo)，b為模型形狀參數(shù)。

應(yīng)用Weibull毒性效應(yīng)閾值模型計算受試生物急性毒性效應(yīng)閾值濃度[19-20]。Weibull毒性效應(yīng)閾值模型：

y=y0e-a(cb-csb)

(2)

式中，y為效應(yīng)指標(biāo)，c為污染物濃度，cs為閾值濃度，y0為c=0時的效應(yīng)指標(biāo)，a和b為模型形狀參數(shù)。

對于慢性毒性實驗數(shù)據(jù)，應(yīng)用單因素方差分析檢驗各實驗組組間方差與組內(nèi)方差的顯著性；應(yīng)用配對多重比較(Games-Howell和Dunnett’s T3)檢驗處理組與對照組的均數(shù)差異，根據(jù)檢驗結(jié)果確定受試生物慢性毒性實驗的NOEC(No Observed Effective Concentration)[21-24]。顯著性檢驗P<0.05、P<0.01為差異顯著。利用SPSS19.0軟件對慢性實驗毒性效應(yīng)測定數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 毛蚶、紫貽貝急性致死效應(yīng)

急性毒性實驗結(jié)果表明，氯化汞對毛蚶、紫貽貝的毒性非常強，濃度高于100 μg·L-1就能造成毛蚶死亡，超過800 μg·L-1在96 h內(nèi)就能造成半數(shù)毛蚶和紫貽貝死亡(圖1、2)。

2.2 毛蚶、紫貽貝體長及體質(zhì)量

盡管慢性毒性實驗分別在0、5、9、13、17、21 d測定了毛蚶、紫貽貝的平均體質(zhì)量、平均體長(圖3、4)，結(jié)果表明同一濃度處理組的組內(nèi)方差與組間方差并沒有顯著性差異(P> 0.1)，這可能是由于實驗周期相對其生長周期來說太短，體質(zhì)量體長難以有明顯變化。這表明對于實驗周期小于1個月的毒性效應(yīng)實驗，雙殼類底棲動物的體長及體質(zhì)量不適合作為毒性效應(yīng)的評價終點。

圖1 急性毒性實驗毛蚶96 h生存數(shù)隨氯化汞濃度變化曲線Fig. 1 The curve for survivals of Scapharca subcrenata in 96 h with concentrations of HgCl2 in the acute toxic effect test

圖2 急性毒性實驗貽貝96 h生存數(shù)隨氯化汞濃度變化曲線Fig. 2 The curve for survivals of Mytilus edulis in 96 h with concentrations of HgCl2 in the acute toxic effect test

圖3 慢性毒性實驗不同氯化汞濃度處理下毛蚶平均體質(zhì)量、平均體長變化注：t0、t21表示實驗開始時間(0 d)、實驗結(jié)束時間(21 d)。下同。Fig. 3 The changes of averaged weight and length of Scapharca subcrenata with concentrations of HgCl2 in the chronic toxic effect testNote: t0 and t21 are the beginning time (0 d) and ending time of this test (21 d), respectively. The same below.

圖4 慢性毒性實驗不同氯化汞濃度處理下貽貝平均體質(zhì)量、平均體長變化Fig. 4 The changes of averaged weight and length of Mytilus edulis with concentrations of HgCl2 in the chronic toxic effect test

圖5 慢性毒性實驗不同氯化汞濃度處理下毛蚶 超氧化物歧化酶(SOD)活性變化Fig. 5 The changes of superoxide dismutase (SOD) in Scapharca subcrenata with concentrations of HgCl2 in the chronic toxic effect test

2.3 毛蚶、紫貽貝SOD活性的變化

氯化汞污染物對毛蚶消化腺中SOD活性的影響如圖5所示。整體來看，污染物暴露4、8、12、16、20 d時，各實驗組組內(nèi)方差與組間方差的差異并不顯著(P> 0.05)，只有暴露12 d時的顯著性差異(P= 0.098)接近0.05。但通過配對多重比較可以發(fā)現(xiàn)一些實驗組的均數(shù)也存在差異。當(dāng)污染物暴露4 d時，C1、C2、C3、C4、C5濃度組(10、20、40、60、100 μg·L-1)SOD活性較對照組均有所降低，分別為對照組的74.8%、89.1%、80.8%、81.9%、71.8%，但只有C1、C3濃度組SOD活性較對照組顯著降低(P< 0.05)；污染物暴露8 d時，C1、C2、C3、C4、C5濃度組SOD活性仍然低于對照組，分別為對照組的83.1%、84.3%、77.3%、62.4%、94.0%，但差異并不顯著(P> 0.1)；污染物暴露12 d時，C4濃度組SOD活性低于對照組，為對照組的90.7%，C1、C2、C3、C5濃度組SOD活性較對照組均有所增加，分別為對照組的120.1%、103.4%、130.9%、115.5%，但差異并不顯著(P> 0.1)；污染物暴露16 d時，仍只有C4濃度組SOD活性低于對照組，為對照組的84.9%，C1、C2、C3、C5濃度組SOD活性高于對照組，分別為對照組的112.1%、123.5%、117.2%、115.51%，但差異并不顯著(P> 0.1)；污染物暴露20 d時，C1、C2、C3、C4、C5濃度組SOD活性仍然低于對照組，分別為對照組的80.3%、88.1%、87.4%、86.6%、80.3%，但差異并不顯著(P> 0.1)。

同一氯化汞污染物濃度作用下，不同時間的毛蚶消化腺SOD活性變化并不一致，C1、C2、C3、C5濃度組SOD活性與對照組的比值整體上呈現(xiàn)先減小再增加然后再減小的波動趨勢，只有C4濃度組SOD活性在整個實驗過程中都低于對照組，但與對照組的比值整體上也呈現(xiàn)先減小再增加然后再減小的波動趨勢。整個實驗過程中，C1、C2、C3、C4、C5濃度組SOD活性積分值都低于對照組，但只有C4濃度組SOD活性積分值較對照組顯著降低(P< 0.05)。

氯化汞污染物對紫貽貝消化腺中SOD活性的影響如圖6所示。整體來看，污染物暴露4、8、12、16、20 d時，各實驗組組內(nèi)方差與組間方差的差異并不顯著(P> 0.05)，只有暴露12 d時的顯著性差異(P= 0.083)接近0.05。但通過配對多重比較可以發(fā)現(xiàn)一些實驗組的均數(shù)也存在差異。當(dāng)污染物暴露4 d時，C1、C2濃度組(10、20 μg·L-1)SOD活性較對照組均有所增加，分別為對照組的105.4%、109.6%，C3、C4、C5濃度組(40、60、100 μg·L-1)SOD活性較對照組有所降低，分別為對照組的92.2%、99.8%、97.3%，但差異并不顯著(P> 0.1)；污染物暴露8 d時，C1、C3濃度組SOD活性較對照組均有所增加，分別為對照組的102.3%、120.0%，C2、C4、C5濃度組SOD活性較對照組有所降低，分別為對照組的94.3%、92.7%、86.2%，但差異并不顯著(P> 0.1)；污染物暴露12 d時，C1、C2、C3、C4、C5濃度組SOD活性均低于對照組，為對照組的83.2%、79.2%、65.5%、81.6%、84.0%，但只有C3濃度組SOD活性較對照組均差異顯著(P< 0.05)；污染物暴露16 d時，C1、C2、C3、C4、C5濃度組SOD活性仍都低于對照組，為對照組的95.7%、99.0%、68.2%、89.4%、95.5%，且只有C3濃度組SOD活性較對照組均差異顯著(P< 0.05)；污染物暴露20 d時，C1、C2濃度組SOD活性較對照組均有所增加，分別為對照組的112.0%、120.8%，C3、C4、C5濃度組SOD活性較對照組有所降低，分別為對照組的97.1%、94.7%、96.7%，但差異并不顯著(P> 0.1)。已有文獻(xiàn)報道重金屬汞低濃度、短期暴露下抗氧化酶活性增加，但是隨著暴露時間的延長，酶活性降低，甚至被抑制[5]，與本文的結(jié)果基本一致，但顯著性差異大。

同一氯化汞污染物濃度作用下，不同時間的貽貝消化腺SOD活性變化并不一致，C1、C2濃度組SOD活性與對照組的比值整體上呈現(xiàn)先增加再減小然后再增加的波動趨勢，C4、C5濃度組SOD活性與對照組的比值在整個實驗過程中都低于對照組，只有C3濃度組SOD活性與對照組的比值整體上呈現(xiàn)先減小再增加然后再減小的波動趨勢。但整個實驗過程中，C1、C2、C3、C4、C5濃度組SOD活性積分值都低于對照組，但差異并不顯著(P> 0.1)。

圖6 慢性毒性實驗不同氯化汞濃度處理下貽貝SOD活性變化Fig. 6 The changes of SOD in Mytilus edulis with concentrations of HgCl2 in the chronic toxic effect test

2.4 毒性效應(yīng)濃度

利用Matlab軟件進(jìn)行編程，通過模型參數(shù)估計方法，應(yīng)用模型方程公式(1)、(2)分別計算了氯化汞對毛蚶、貽貝的急性毒性效應(yīng)濃度LC50、LC05、Cs及其bootstrap置信區(qū)間，平均擬合優(yōu)度大于0.9，計算結(jié)果如表2。通過配對多重比較檢驗處理組與對照組的均數(shù)差異，根據(jù)檢驗結(jié)果確定了受試生物慢性毒性實驗的NOEC(P< 0.05)(表2)。

總體來看，Log-logistic模型[18]和Weibull毒性效應(yīng)閾值模型[19]都能很好地擬合汞污染物濃度與受

試生物之間的毒性效應(yīng)曲線(反“S”形)，并且毒性效應(yīng)參數(shù)(LC50、LC05、Cs)都能在模型擬合過程中直接率定。但由于Weibull毒性效應(yīng)閾值模型是四參數(shù)模型，Log-Logistic模型是三參數(shù)模型，Log-Logistic模型收斂性優(yōu)于Weibull毒性效應(yīng)閾值模型，計算的LC05均值總體上小于Cs均值，LC05置信區(qū)間總體上比Cs置信區(qū)間窄。因此，將計算所得的LC05作為汞污染物的非效應(yīng)濃度[25]。計算結(jié)果表明，氯化汞分別高于23.7 μg·L-1、87.8 μg·L-1將會對海洋底棲生物毛蚶、紫貽貝生存產(chǎn)生明顯的不利影響。LC50計算結(jié)果表明，氯化汞的環(huán)境濃度分別高于683.4 μg·L-1、773.2 μg·L-1將會造成海洋底棲生物毛蚶、紫貽貝半數(shù)死亡。慢性實驗結(jié)果表明，氯化汞的環(huán)境濃度分別高于10 μg·L-1、20 μg·L-1將會顯著影響海洋底棲生物毛蚶、紫貽貝消化腺SOD酶的活性。

結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)資料，可以進(jìn)行物種敏感度分布(Species Sensitivity Distribution, SSD)分析[23]，發(fā)現(xiàn)汞污染物對不同門類生物的毒性效應(yīng)差異很大，半致死濃度(或半效濃度)范圍約為0.11～62 688 μg·L-1，對體積較小的單細(xì)胞生物(如長毛對蝦受精卵、三角褐指藻等)毒性一般更大，對體積較大的生物(如阿匍蝦虎魚、中華絨鰲蟹等)毒性相對較小(圖7)。毛蚶、紫貽貝等雙殼類海洋底棲生物在汞污染物物種敏感性分布中屬于抗性較強的物種(0.80 ≤ Rank)[26]，這可能主要是由于毛蚶、紫貽貝體積相對較大，并且受到污染物脅迫時可以閉殼保護(hù)自身組織器官免受損傷。

慢性毒性效應(yīng)實驗數(shù)據(jù)結(jié)果表明，實驗周期內(nèi)毛蚶和紫貽貝體質(zhì)量、體長的組內(nèi)方差與組間方差并沒有顯著性差異(P> 0.1)，體長及體質(zhì)量不適合作為毒性效應(yīng)的評價終點。毛蚶、紫貽貝各實驗組SOD酶活力的組內(nèi)方差與組間方差的差異整體上并不顯著(P> 0.05)，實驗周期內(nèi)僅在個別時間處理組間存在顯著性差異(P< 0.05)，毛蚶、紫貽貝NOEC分別為10 μg·L-1、20 μg·L-1。急性毒性效應(yīng)實驗數(shù)據(jù)結(jié)果表明，重金屬汞對毛蚶、紫貽貝的非檢測毒性效應(yīng)濃度分別為23.7 μg·L-1、87.8 μg·L-1，半致死濃度分別為683.4 μg·L-1、773.2 μg·L-1。

表2 氯化汞對毛蚶和紫貽貝的Cs、LC50、LC05 (μg·L-1)Table 2 The Cs, LC50, and LC05 of Scapharca subcrenata and Mytilus edulis with the exposure to HgCl2(μg·L-1)

注：Cs表示閾值濃度。

Note:Csstands for threshold concentration.

圖7 污染物汞半效濃度(EC50)物種敏感性分布注：■斑馬魚胚胎及魚卵[27]；□長毛對蝦受精卵及幼體[12]； ●赤潮異彎藻、旋鏈角毛藻、海洋原甲藻、裸甲藻、中肋骨條藻、 三角褐指藻、青島大扁藻、亞心型扁藻[6]；○斑馬魚胚胎幼體[28]；▲阿匍蝦虎魚，黑褐新糠蝦[29]；△三角褐指藻[7]；▼黑鯛胚胎[10]；▽櫛孔扇貝幼貝[4]；◆中華絨鰲蟹幼蟹[30]；◇毛蚶成體，紫貽貝成體(本文)。Fig. 7 Species sensitivity distribution for contaminant HgCl2 according to half-effect concentration (EC50) Note:■ Embryos and eggs of zebrafish[27]; □ Fertilized eggs and larvae of Penaeus penicillatus Alcock[12]; ● Heterosigma akashiwo Hada, Chaetoceros curvisetus Cleve, Prorocentrum micans Ehrenberg, Gymnodinium sp., Skeletonema costatum (Greville) Cleve, Phaeodactylum tricornutum Bohlin, Platymonas helgolanidica, Platymonas subcordiformis[6]; ○ Larvae of zebrafish[28]; ▲ Aboma lactipes, Neomysis awatschensis[29]; △ Phaeodactylum tricornutum Bohlin[7]; ▼ Embryos of black porgy[10]; ▽ Juvenile Chlamys farreri [4]; ◆ Young Eriocheir sinensis [30]; ◇ Mature Scapharca subcrenata and mature Mytilus edulis (this study).