朱立賢，張一敏，毛衍偉，曹麗，梁榮蓉，韓明山，朱炳海，羅欣*

1(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安，271018) 2(內(nèi)蒙古科爾沁牛業(yè)有限公司，內(nèi)蒙古 通遼，028000) 3(陽(yáng)信縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，山東 濱州，251800)

一磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated proteinkinase，AMPK)屬絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，幾乎在所有真核生物中都有表達(dá)[1]，被稱(chēng)為“中心代謝傳感器”、“能量檢查站”[2]和“細(xì)胞能荷調(diào)節(jié)器”[3]，在所有真核細(xì)胞能量平衡中均發(fā)揮關(guān)鍵作用。對(duì)其研究從醫(yī)學(xué)領(lǐng)域介導(dǎo)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[4]、調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)成分代謝[5-6]等方面的研究逐步深入至動(dòng)物宰后肌肉的生化進(jìn)程[7-9]。AMPK活性與不同極限pH值牛肉的產(chǎn)生密切相關(guān)[9]。作者之一的張一敏報(bào)道AMPK活性在不同部位牛肉中差異顯著，牛柳中的AMPK活性顯著高于西冷，AMPK活性與pH值與肌糖原含量呈顯著正相關(guān)，AMPK可能通過(guò)調(diào)節(jié)糖酵解進(jìn)程而影響牛肉品質(zhì)[10]。

肌肉轉(zhuǎn)化為食肉需要經(jīng)過(guò)一系列生化變化，能量代謝特別是糖酵解是其中的一個(gè)重要過(guò)程。屠宰后肌肉早期的能量代謝伴隨著pH值、溫度變化及蛋白質(zhì)變性等生化反應(yīng)，在很大程度上影響牛肉的品質(zhì)[11]。動(dòng)物宰后早期pH值的變化速率與極限pH值是影響肉品最終品質(zhì)的關(guān)鍵因素[12]，宰后早期糖酵解促使乳酸不斷積累，是宰后肌肉pH值下降的主要原因[13-14]，因此糖酵解與宰后肌肉品質(zhì)密切相關(guān)。宰后早期環(huán)境溫度影響肌肉發(fā)生一系列生物化學(xué)變化，最終對(duì)肉的品質(zhì)造成不同的影響，然而其潛在的分子機(jī)制還遠(yuǎn)未闡明。LI等[15]發(fā)現(xiàn)宰后不同溫度處理影響牛背最長(zhǎng)肌的pH值下降速率、嫩度、顏色等品質(zhì)。而宰后早期不同溫度處理是否對(duì)牛肉AMPK活性、糖酵解過(guò)程產(chǎn)生影響尚不明確。

本研究對(duì)牛背最長(zhǎng)肌(M.Longissimuslumborum)為研究對(duì)象， 探討不同溫度處理對(duì)牛肉中AMPK活性、糖酵解進(jìn)程及肉品質(zhì)的影響，初步揭示AMPK是否參與糖酵解及牛肉品質(zhì)的調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用24月齡體重相近、性別相同的魯西黃牛×西門(mén)塔爾雜交牛6頭。宰后30 min內(nèi)迅速取出背腰最長(zhǎng)肌肉，修除皮下脂肪后，同一頭牛的每條背腰最長(zhǎng)肌平均分割成2部分，放置在不同溫度(0、14 ℃)下至宰后10 h，每個(gè)肉塊平均分割成4部分真空包裝，在0 ℃下貯藏14 d，分別在成熟1、3、7、14 d測(cè)定各項(xiàng)肉品質(zhì)指標(biāo)。在宰后2、4、6、8、10和24 h時(shí)間點(diǎn)測(cè)定24 h內(nèi)的溫度和pH值，并從不同溫度處理的每塊肉各取約10 g樣品，放入液氮中，然后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存，用于測(cè)定AMPK活性和糖酵解指標(biāo)。

1.2 儀器與試劑

MP-120便攜式pH計(jì)，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀，英國(guó)Stable Micro System公司； UT-1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司； GL-20G-2冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；SPX-400智能型生化培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠；蛋白轉(zhuǎn)印儀PS2A200，mersham。

AMPKα antibody(#2532)Cell Signaling Technology(CST)；phosphor-AMPKα(Thr172) antibody(#2531)(CST)；Anti-β-Actin Antibody(CW 0097)、HRP-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；肌糖原測(cè)定試劑盒、乳酸測(cè)定試劑盒、丙酮酸激酶(PK)試劑盒，南京建成科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 pH值測(cè)定

使用pH計(jì)測(cè)定肉塊的pH值，探頭深度為2 cm，測(cè)定3次，取平均值。

1.3.2 AMPK活性測(cè)定

參考張一敏[10]的方法，取-80 ℃冷凍樣品100 mg在液氮中研磨，取40 mg樣品粉末，加入400 μL裂解液(1mmol/L蛋白酶抑制劑，50 mmol/L Tris，pH 7.4，150 mmol/L NaCl，1% Triton X-100，1% sodium vanadate )，在冰浴中勻漿裂解15 min，裂解后的樣品在4 ℃ 15 000g下離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)1.5 mL離心管中，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，調(diào)整蛋白質(zhì)量濃度為5 μg/μL。然后進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白，電泳條件為上層5%的濃縮膠，下層12%的分離膠，電泳時(shí)間3.5～4 h(20 mA)。將凝膠置于轉(zhuǎn)印緩沖液中(20 mmol/L Tris, 192 mmol/L 甘氨酸，15%甲醇)中浸泡20 min，使用蛋白轉(zhuǎn)印儀將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印到 PVDF膜上，轉(zhuǎn)印條件為恒壓60 V，轉(zhuǎn)移2 h，轉(zhuǎn)印后的PVDF膜用在室溫條件下于封閉液中封閉2 h，用TTBS清洗，將一抗稀釋至適當(dāng)濃度加到膜上，4 ℃孵育4 h，然后在TTBS中洗3次，每次15 min，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，然后用TTBS 洗3次，每次15 min，最后采用ECL方法進(jìn)行熒光顯影，利用蛋白凝膠成像儀器和Vision Works LS 7.1軟件進(jìn)行凝膠成像和光密度分析。

1.3.3 糖原、乳酸含量及丙酮酸激酶活性測(cè)定

糖原、乳酸含量以及丙酮酸激酶活性采用南京建成試劑公司的試劑盒進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)具體操作和結(jié)果計(jì)算參照各試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行。

1.3.4 汁液損失測(cè)定

宰后10 h時(shí)肉塊稱(chēng)質(zhì)量(m1)后真空包裝，分別在貯藏成熟1、3、7、14 d打開(kāi)包裝取出肉塊，用濾紙吸干肉塊表面的汁液，稱(chēng)質(zhì)量(m2)。

汁液損失率/%=[(m1-m2)/m1]×100

(1)

1.3.5 剪切力測(cè)定

參考LUO等[16]學(xué)者的方法，取測(cè)完汁液損失的肉塊放入75 ℃水浴中到肉塊中心溫度70 ℃保持20 min，取出肉塊放入0～4 ℃冰箱內(nèi)12 h。用直徑為1.27 cm的空心取樣器沿肌纖維方向取肉柱，每個(gè)樣品取6個(gè)以上肉柱，用質(zhì)構(gòu)分析儀的 HDP/BSW 探頭測(cè)定肉柱剪切力值，并通過(guò)Texture Expert V1.0 軟件加以控制。每個(gè)肉塊的剪切力值為各肉柱剪切力值的平均值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采樣LSD法進(jìn)行方差分析，差異顯著水平α為0.05，差異極顯著水平α為0.01。數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 宰后早期不同溫度處理對(duì)牛背最長(zhǎng)肌pH值的影響

不同溫度處理組牛背最長(zhǎng)肌的宰后初始pH值差異不顯著，而在宰后4～10 h同一時(shí)間點(diǎn)14 ℃處理組的pH值顯著低于0 ℃處理組(p<0.05)。在宰后24 h，2個(gè)溫度處理組的極限pH值差異不顯著，在5.6～5.7之間。結(jié)果表明不同的冷卻溫度能夠改變pH值的下降速率，但是不能夠改變其下降程度。

圖1 宰后早期不同溫度處理對(duì)牛背最長(zhǎng)肌肉溫度和pH值的影響Fig.1 Effect of different temperature during the early post- mortem on pH of beef M. Longissimus lumborum注：a，b表示不同溫度處理組同一時(shí)間點(diǎn)差異顯著(p<0.05)，圖3、圖4同。

2.2 宰后早期不同溫度處理對(duì)牛背最長(zhǎng)肌AMPK活性的影響

以p-AMPK(α)蘇氨酸172位點(diǎn)(Thr172)磷酸化蛋白水平表征的AMPK活性如圖2所示。在宰后2、4 h時(shí)0 ℃和14 ℃處理的牛背最長(zhǎng)肌AMPK活性，差異極顯著(p<0.01)。在宰后2 h，14 ℃的AMPK活性達(dá)到最高，在宰后4 h時(shí)，0 ℃的AMPK活性達(dá)到了最大活性值。在宰后4 h后，2個(gè)溫度處理組牛肉中AMPK活性均呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)。對(duì)于同一部位肉來(lái)說(shuō)，溫度僅能夠影響其達(dá)到最大活性的時(shí)間點(diǎn)，但是不影響AMPK的最大活性值，溫度對(duì)宰后能量代謝的影響可能通過(guò)影響AMPK活性而起作用。

圖2 宰后早期0 ℃和14 ℃溫度處理牛背最長(zhǎng)肌的AMPK活性Fig.2 The AMPK activity of beef M. Longissimus lumborum at 0 ℃ and 14 ℃ during the early post-mortem注：a，b表示不同溫度處理組同一時(shí)間點(diǎn)差異極顯著(p<0.01)。圖5、圖6同。

2.3 宰后早期不同溫度處理對(duì)牛背最長(zhǎng)肌糖原含量的影響

如圖3所示，隨著宰后時(shí)間的延長(zhǎng)，2個(gè)溫度處理組牛背最長(zhǎng)肌糖原含量均呈現(xiàn)下降的趨，宰后6 h、8、10 h時(shí)14 ℃處理組的糖原含量顯著低于0 ℃處理組(p<0.05)，宰后冷卻溫度越高，糖原分解速率越快。宰后24 h時(shí)2個(gè)溫度處理組牛背最長(zhǎng)肌糖原含量差異不顯著(p>0.05)。結(jié)果表明溫度能夠改變糖原分解速率，但不能改變其分解程度。

圖3 宰后早期0 ℃和14 ℃處理牛背最長(zhǎng)肌的糖原含量Fig.3 The glycogen content of beef M. Longissimus lumborum at 0 ℃ and 14 ℃ during the early post-mortem

2.4 宰后早期不同溫度處理對(duì)牛背最長(zhǎng)肌乳酸含量的影響

如圖4所示，2個(gè)溫度處理組牛背最長(zhǎng)肌的乳酸含量隨著宰后時(shí)間的延長(zhǎng)均逐漸積累增加，宰后6、8、10 h時(shí)14 ℃處理組的糖原含量顯著高于0 ℃處理組(p<0.05)，與糖原含量的結(jié)果呈負(fù)相關(guān)。宰后24 h時(shí)2個(gè)溫度處理組樣品的乳酸含量差異不顯著(p>0.05)。結(jié)果表明宰后早期不同溫度處理能夠影響牛肉中乳酸產(chǎn)生的速率。

圖4 宰后早期0 ℃和14 ℃處理牛背最長(zhǎng)肌的乳酸含量Fig.4 The lactate content of beef M. Longissimus lumborum at 0 ℃ and 14 ℃ during the early post-mortem

2.5 宰后早期不同溫度處理對(duì)牛背最長(zhǎng)肌丙酮酸激酶活性的影響

2個(gè)溫度處理組牛背最長(zhǎng)肌丙酮酸激酶活性變化如圖5所示。在宰后4、6 h時(shí)不同溫度處理組丙酮酸激酶活性差異顯著(p<0.05)。不同溫度處理丙酮酸激酶活性達(dá)到最大活性時(shí)間點(diǎn)不同，14 ℃處理組丙酮酸激酶活性在宰后4 h達(dá)到最大活性，0 ℃的在宰后6 h達(dá)到最大活性值，最大活性值不顯著(p>0.05)。

圖5 宰后早期0 ℃和14 ℃處理牛背最長(zhǎng)肌的酮酸激酶活性Fig.5 The pyruvate kinase activity of beef M. Longissimus lumborum at 0 ℃ and 14 ℃ during the early post-mortem

2.6 宰后早期不同溫度處理下牛背最長(zhǎng)肌的貯藏汁液損失

如表1所示，在宰后1 d時(shí)14 ℃處理組牛背最長(zhǎng)肌的汁液損失顯著低于0 ℃處理組(p<0.05)，在宰后3、7、14 d時(shí)2個(gè)處理組的牛肉汁液損失差異不顯著，但14 ℃處理組有降低的趨勢(shì)。成熟時(shí)間對(duì)宰后早期同一溫度處理牛肉的貯藏汁液損失有顯著的影響(p<0.05)，隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，貯藏汁液損失增加。肌肉的貯藏汁液損失與僵直過(guò)程中肌纖維收縮與其收縮程度有關(guān)[17]，僵直期間肌肉纖維收縮與溫度密切相關(guān)，僵直前期肌肉在14～20 ℃下放置所發(fā)生的收縮量最小，大約只有10%，在0～10 ℃低溫下發(fā)生收縮的程度能達(dá)到正常肌節(jié)長(zhǎng)度的50%[18]，這可能是14 ℃處理組牛肉汁液損失顯著低于0 ℃處理組的原因。

表1 宰后早期不同溫度處理下牛背最長(zhǎng)肌的貯藏汁液損失Table1 The purge loss of beef M. Longissimus lumborumat different temperature

注：a，b表示不同溫度處理組肉在同一宰后貯藏時(shí)間汁液損失差異顯著(p<0.05)。

2.7 不同溫度處理下牛背最長(zhǎng)肌的剪切力值

如圖6所示，宰后早期不同溫度對(duì)牛背最長(zhǎng)肌剪切力值的影響差異顯著(p<0.05)，在宰后1、3、7、14 d時(shí)14 ℃處理組牛背最長(zhǎng)肌的剪切力值顯著低于0 ℃處理組(p<0.05)。

圖6 宰后早期不同溫度對(duì)牛背最長(zhǎng)肌剪切力值Fig.6 The shearing force of beef M. Longissimus lumborum at different temperature during the early post-mortem

隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，剪切力值均降低，但是肉的成熟速率和成熟程度不同。成熟至14 d，14 ℃處理組的嫩度改善在34%左右，0 ℃處理組嫩度改善在23%左右。

3 討論

宰后早期環(huán)境溫度影響胴體或者肌肉發(fā)生一系列生物化學(xué)變化，能量代謝特別是糖酵解是這些變化中的一個(gè)重要過(guò)程，在無(wú)氧條件下葡萄糖被分解生成丙酮酸，丙酮酸又進(jìn)一步被還原為乳酸[11-12]，乳酸的積累導(dǎo)致了肌肉pH值的下降。而pH值的降低程度和降低速率則是影響宰后肌肉品質(zhì)的重要因素。AMPK能感知機(jī)體細(xì)胞能量代謝狀態(tài)的改變，有學(xué)者[19-20]研究發(fā)現(xiàn)，AMPK可以調(diào)節(jié)小鼠宰后骨骼肌的糖酵解。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明宰后早期不同溫度處理能夠影響牛背最長(zhǎng)肌宰后糖酵解速率，表現(xiàn)在pH值下降速率、糖原分解速率以及乳酸積累速率，同時(shí)還能夠影響AMPK和丙酮酸激酶的活性變化。這與李澤[21]的研究結(jié)果相一致，保存在15 ℃的羊肉比0 ℃和4 ℃的具有更高的AMPK活性值，肌糖原和pH值下降快，乳酸蓄積多。朱學(xué)伸[22]報(bào)道宰后高溫處理火雞胸肌1 h時(shí)AMPK酶被激活，20 ℃處理組的AMPK磷酸化水平高于0 ℃處理組。宰后綿羊肌肉AMPK活性較高時(shí)糖酵解速度較快[23]。張一敏[10]報(bào)道AMPK的活性在不同部位牛肉中差異顯著，AMPK 活性較高的牛柳中丙酮酸激酶達(dá)到最大活性的時(shí)間早于西冷。丙酮酸激酶作為糖酵解途徑的限速酶之一，其活性的提高能夠提高糖酵解速率。DU[24]報(bào)道AMPK基因敲除小鼠宰后24 h背最長(zhǎng)肌中丙酮酸激酶活性顯著低于對(duì)照組，AMPK參與丙酮酸激酶的激活。本研究中2個(gè)溫度處理組AMPK達(dá)到最大活性的時(shí)間不同，14 ℃處理組相較于0 ℃處理組的AMPK較早的達(dá)到最大活性，其丙酮酸激酶也較早的達(dá)到最大活性，說(shuō)明在宰后牛肉中AMPK可能通過(guò)介導(dǎo)丙酮酸激酶的活性而調(diào)節(jié)糖酵解速率。

宰后僵直前期的冷卻溫度能夠影響胴體肌肉的生化過(guò)程，從而對(duì)肉品品質(zhì)有著重要的影響[25]。不同的冷卻程序即不同的溫度處理能夠影響肌肉的溫度-pH窗口，對(duì)肉的嫩度、保水性起到最終的決定作用[26]。本研究中不同溫度處理能夠影響牛背最長(zhǎng)肌的糖酵解速度和肉品質(zhì)，14 ℃處理組牛肉的嫩度及保水性顯著高于0 ℃處理組，成熟至14 d，14 ℃處理組的嫩度改善在34%左右，且剪切力值最低，嫩度較好，0 ℃處理組嫩度改善在23%左右，且剪切力值最高，嫩度較差。酶的活性極易受溫度的影響，溫度較低，AMPK活性不易被激活，糖酵解進(jìn)程緩慢，pH值下降慢。若pH值降低到6.2之前胴體的溫度降低到12 ℃以下，便容易發(fā)生冷收縮[27]，肉的嫩度和保水性變差。溫度在14～20 ℃時(shí)肌肉進(jìn)入僵直，收縮量最小[18]，牛肉的收縮程度與肉的嫩度密切相關(guān)。因此調(diào)節(jié)宰后合理的冷卻程序，調(diào)控宰后代謝，對(duì)于生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的牛肉有著重要作用。

4 結(jié)論

不同的冷卻溫度能夠改變牛背最長(zhǎng)肌的pH值的下降速率、糖酵解速率及肉品質(zhì)，宰后早期14 ℃處理組的pH值下降速率、糖原分解速率、乳酸積累速率及肉的嫩度顯著高于0 ℃處理組。14 ℃處理組相較于0 ℃處理組的AMPK較早地達(dá)到最大活性，其丙酮酸激酶也較早地達(dá)到最大活性，說(shuō)明在宰后牛肉中AMPK通過(guò)介導(dǎo)丙酮酸激酶的活性而調(diào)節(jié)糖酵解速率進(jìn)而影響肉品質(zhì)。

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