侯美，高鋼，朱愛(ài)國(guó)，陳平，陳繼康，陳坤梅，熊和平，喻春明

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類(lèi)研究所，長(zhǎng)沙410205）

苧麻（Boehmeria nivea L．Gauld）是蕁麻科苧麻屬多年生草本植物［1］，其蛋白質(zhì)含量高，營(yíng)養(yǎng)豐富，生物產(chǎn)量大，再生能力強(qiáng)，是很好的飼用植物蛋白質(zhì)來(lái)源［2］，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與苜蓿（Medicago sativa）相近［3－4］。在正常條件下，硝酸鹽是苧麻從外界吸收的主要氮源，提高苧麻的氮素利用率，便可有效提高苧麻的經(jīng)濟(jì)效益。在擬南芥中第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1.1（nitrate transporter1.1，NRT1.1）［5］，其通過(guò)氨基酸序列中第101位蘇氨酸發(fā)生磷酸化修飾而表現(xiàn)出雙親和轉(zhuǎn)運(yùn)功能［6］。有研究表明，硝酸鹽在擬南芥中的主要傳感器是NRT1.1［7］。在小麥中發(fā)現(xiàn)經(jīng)氮饑餓處理后TaNRT1.1表達(dá)受到顯著抑制［8］；在水稻中發(fā)現(xiàn)NRT1.1B是一個(gè)高氮利用率基因，在育種中有著重要的應(yīng)用價(jià)值［9］。另外，在白菜、茶樹(shù)、菊花等作物中成功克隆出NRT1.1基因，并對(duì)其進(jìn)行功能鑒定［10－12］。目前關(guān)于苧麻對(duì)硝酸鹽吸收利用的分子機(jī)制研究較少，尚不清楚苧麻硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1.1（BnNRT1.1）在苧麻對(duì)氮素吸收利用過(guò)程中發(fā)揮的作用。本研究擬通過(guò)克隆獲得苧麻BnNRT1.1基因的cDNA全長(zhǎng)序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析與表達(dá)特性研究，以期為苧麻BnNRT1.1基因的功能研究提供參考，并為提高苧麻氮素利用率奠定分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類(lèi)研究所苧麻資源圃中龍?zhí)洞舐榕c青皮桿麻兩個(gè)苧麻品種為試驗(yàn)材料（前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)龍?zhí)洞舐榈牡曙@著高于青皮桿麻）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類(lèi)研究所苧麻資源圃中取苧麻品種龍?zhí)洞舐榕c青皮桿麻植株，削苗后進(jìn)行扦插，扦插苗長(zhǎng)度約12～15 cm，頂端保留3～4片嫩葉，將削好的扦插苗浸入稀釋500倍的多菌靈中消毒30 s，扦插到Karen牌無(wú)土栽培水培儀內(nèi)，置于環(huán)境溫度為25℃、光/暗周期為16/8 h的溫室內(nèi)培養(yǎng)［13］，設(shè)計(jì)3次生物學(xué)重復(fù)。先在水培儀中加入10 L自來(lái)水，15 d后，將水培儀中的自來(lái)水換成10 L氮濃度為9 mmol/L的營(yíng)養(yǎng)液，其中大量元素基本組成為：Ca（NO3）2·4H2O（472.3 mg/L）、KNO3（505.55 mg/L）、KH2PO4（136.07 mg/L）、MgSO4·7H2O（492.96 mg/L）、CaCl2·2H2O（441.06 mg/L），微量元素配方參考湯滌洛［14］的方法，在處理 0 h、12 h、1 d、3 d、5 d后分別取樣，并將其根、莖、葉分開(kāi)，液氮速凍后，于－80℃冰箱保存，作為提取總RNA的試驗(yàn)材料。

1.3 RNA的提取、cDNA第一鏈的合成

取0.1 g苧麻新鮮葉片，利用RNA提取試劑盒（EASYspin Plus Plant RNA Kit，Aidlab biotech）提取苧麻總RNA，具體操作步驟參照北京艾德萊公司的EASYspin Plus Plant RNA Kit說(shuō)明書(shū)，提取后用1%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，合格后進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，具體步驟參考cDNA合成試劑盒（RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，Thermo）說(shuō)明書(shū)。

1.4 獲取苧麻BnNRT1.1基因全長(zhǎng)cDNA序列

利用擬南芥AtNRT1.1基因序列和ncbi－blast－2.5.0＋－win64軟件，與苧麻轉(zhuǎn)組數(shù)據(jù)庫(kù)［15］unigenes序列進(jìn)行比對(duì)，檢索目的序列，通過(guò)NCBI對(duì)目的序列進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)，利用oligo7軟件在目的基因ORF區(qū)域兩頭設(shè)計(jì)引物，BnNRT1.1－F：ATGGCAAGTGGTCTCCCCC，BnNRT1.1－R：GTGACACACAACATCATGAA，擴(kuò)增苧麻BnNRT1.1全長(zhǎng)cDNA序列。以cDNA第一鏈為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：94℃ 3min，94℃30 s，58℃ 30 s，72℃2 min，30個(gè)循環(huán)，72℃5 min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收后，連接到pClone007 Simple載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在Xgal/IPTG瓊脂糖平板上挑選白色菌落，PCR驗(yàn)證為陽(yáng)性菌落后進(jìn)行測(cè)序，由北京擎科生物長(zhǎng)沙測(cè)序部完成。

1.5 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與軟件分析

DNA序列的翻譯及分析用DNAMAN進(jìn)行；基因開(kāi)放閱讀框用NCBI提供的在線(xiàn)ORFfinder尋找，預(yù)測(cè)和分析BnNRT1.1基因編碼的產(chǎn)物借助ExPASy在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)，理化性質(zhì)采用ProtParam分析軟件預(yù)測(cè)；親水性/疏水性采用ProtScale預(yù)測(cè)；苧麻BnNRT1.1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)采用TMHMM預(yù)測(cè)；苧麻BnNRT1.1亞細(xì)胞定位及功能分類(lèi)分別采用PSORT和ProtFun預(yù)測(cè)；采用NetPhoS 2.0分析苧麻BnNRT1.1蛋白潛在的磷酸化修飾位點(diǎn)；系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建采用MEGA6軟件。

1.6 苧麻BnNRT1.1基因的表達(dá)特性研究

利用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT－PCR）進(jìn)行苧麻BnNRT1.1基因的表達(dá)特性研究，以苧麻管家基因18S rRNA作為內(nèi)參基因［16］，通過(guò)Primer5設(shè)計(jì)目的基因引物，F(xiàn)（5’－3’）－：AGTTCGACGAGTCGGACAAG，R（5’－3’） －AGATTCCGTAGCCCCAGTCT，反應(yīng)體系為 5.0μL 2×PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix，0.2μL 10μmol/L Forward primer，0.2μL 10μmol/L Reverse primer，1μL cDNA，3.6μL dd H2O。反應(yīng)程序：95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，根據(jù)CT值，用公式2-ΔΔCT分別計(jì)算出目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品RNA質(zhì)量檢測(cè)

提取的總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1A所示?？梢?jiàn)28S rRNA，18S rRNA和5S rRNA條帶非常清晰，且28S rRNA是18S rRNA的2倍左右。為進(jìn)一步確定RNA質(zhì)量，使用Naonodrop2000進(jìn)行濃度檢測(cè)，結(jié)果顯示所提取 RNA濃度為436.9 ng/μL，A260/A280為2.07，A260/A230為2.06，說(shuō)明此RNA完整性較好，純度較高，不存在蛋白質(zhì)、多糖和酚類(lèi)物質(zhì)的明顯污染，符合試驗(yàn)要求，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 目的片段的PCR擴(kuò)增與克隆鑒定

以提取的苧麻總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如圖1B所示。將目的片段回收純化后連接到pClone007 Simple載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，對(duì)白斑進(jìn)行PCR菌液鑒定，確定為陽(yáng)性菌落，如圖1C所示。進(jìn)行測(cè)序后得到BnNRT1.1全長(zhǎng)序列1869 bp，其中含開(kāi)放閱讀框（ORF）1776 bp，其編碼的核苷酸序列與氨基酸序列如圖2所示。

圖1 1%瓊脂糖凝膠電泳Fig.11%agarose gel electrophoresis

圖2 苧麻BnNRT1.1的核苷酸序列及氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence and amino acid sequence of BnNRT1.1

2.3 苧麻BnNRT1.1基因的生物信息學(xué)分析

2.3.1 苧麻BnNRT1.1蛋白的氨基酸序列分析

ProtParam預(yù)測(cè)顯示，苧麻BnNRT1.1基因編碼591個(gè)氨基酸殘基，蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為65.25 kD，等電點(diǎn)是8.85，理論推導(dǎo)半衰期大于10 h，不穩(wěn)定參數(shù)（Instability index）為31.49，屬穩(wěn)定蛋白，脂溶指數(shù)（Aliphatic index）為98.17，屬脂溶蛋白，總平均親水性為0.325，為疏水性蛋白。ExPASy網(wǎng)站的SPOMA信息庫(kù)對(duì)該蛋白質(zhì)序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示苧麻BnNRT1.1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以 α－螺旋（alpha helix）、無(wú)規(guī)則卷曲（random coil）、延伸鏈（extended strand）、β－轉(zhuǎn)角（beta turn）為結(jié)構(gòu)元件，分別占41.12%、32.99%、17.26%、8.63%。

2.3.2 苧麻BnNRT1.1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)軟件TMHMM Server v.2.0對(duì)苧麻BnNRT1.1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖3所示。苧麻BnNRT1.1蛋白具有12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，在第6和第7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域之間存在一個(gè)大的親水環(huán)，符合PTR家族跨膜結(jié)構(gòu)特征。

圖3 苧麻BnNRT1.1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.3 Prediction of transmembrane domain of BnNRT1.1 protein in Ramie

2.3.3 苧麻BnNRT1.1蛋白亞細(xì)胞定位及功能預(yù)測(cè)

采用軟件WoLF PSORT II對(duì)苧麻BnNRT1.1蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1。苧麻Bn-NRT1.1蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)膜與囊泡中，為膜蛋白。通過(guò)Protfun分析軟件預(yù)測(cè)基因BnNRT1.1編碼產(chǎn)物功能，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，該蛋白主要具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)運(yùn)功能。采用NetPhoS2.0分析苧麻BnNRT1.1蛋白潛在的磷酸化修飾位點(diǎn)，預(yù)測(cè)顯示苧麻BnNRT1.1蛋白具有9個(gè)絲氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)、5個(gè)蘇氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)、1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)。

表1 苧麻BnNRT1.1蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果Tab.1 Subcellular prediction results of BnNRT1.1 of camellia sinensis

表2 BnNRT1.1蛋白的功能預(yù)測(cè)結(jié)果Tab.2 Functional prediction results of BnNRT1.1 protein

2.3.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

在NCBI中，將苧麻BnNRT1.1進(jìn)行blast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)苧麻BnNRT1.1基因序列與櫻桃、白梨、桑樹(shù)、梅、草莓、巨桉、桃樹(shù)、核桃、木豆的NRT1序列具有較高相似度，其序列相似度均大于70%。通過(guò)MEGA6構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，如圖4所示，苧麻與櫻桃、白梨、桑樹(shù)在一個(gè)分支上，具有同源關(guān)系。

圖4 苧麻BnNRT1.1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of BnNRT1.1 gene in ramie

2.4 苧麻BnNRT1.1基因的表達(dá)特性研究

硝酸鹽處理不同時(shí)間后，苧麻BnNRT1.1基因在不同品種及不同部位的表達(dá)情況如圖5所示。苧麻BnNRT1.1基因在不同部位表達(dá)量不同，根中大量表達(dá)，葉片中少量表達(dá)，莖中極少表達(dá)，在處理3 d后，其表達(dá)量達(dá)到最大值。苧麻BnNRT1.1基因在不同品種中表達(dá)量不同，在前期苧麻氮高效品種篩選試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)龍?zhí)洞舐榈牡曙@著高于青皮桿麻，本試驗(yàn)研究表明，BnNRT1.1在氮高效品種龍?zhí)洞舐橹械谋磉_(dá)量高于氮低效品種青皮桿麻，且在龍?zhí)洞舐橹械淖畲笙鄬?duì)表達(dá)量約為2.63，青皮桿麻中的最大相對(duì)表達(dá)量約為1.19。

圖5 苧麻BnNRT1.1基因的表達(dá)特性Fig.5 Expression characteristics of BnNRT1.1 gene in ramie

3 討論

苧麻為南方重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，目前作為飼料作物大范圍推廣應(yīng)用，如何提高其氮素利用率一直是苧麻育種工作的研究重點(diǎn)［17］。硝酸鹽與銨鹽是植物生長(zhǎng)所需氮素的主要來(lái)源，在自然條件下，硝酸鹽是非固氮植物生長(zhǎng)所需的主要氮源，無(wú)論外界硝酸鹽濃度高低，NRT1.1均發(fā)揮重要作用，目前在國(guó)內(nèi)對(duì)苧麻硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。苧麻BnNRT1.1基因的功能與作用機(jī)制是否與其它作物中的相同尚不清楚。本研究從苧麻植株中成功克隆出苧麻BnNRT1.1基因，功能預(yù)測(cè)表明，苧麻BnNRT1.1基因不僅可以轉(zhuǎn)運(yùn)硝酸鹽，還可以作為一種信號(hào)分子，其對(duì)苧麻生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的調(diào)控作用，有待于進(jìn)一步研究與鑒定。

本研究雖然獲得了苧麻BnNRT1.1的cDNA全長(zhǎng)序列，但無(wú)法獲得其非編碼區(qū)的相關(guān)信息，目前苧麻沒(méi)有可利用的基因組數(shù)據(jù)。Blast比對(duì)結(jié)果表明，苧麻BnNRT1.1基因序列與其它植物的NRT1具有較高相似性，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明，其與櫻桃、白梨、桑樹(shù)NRT1具有同源關(guān)系，因此可借鑒其同源序列的相關(guān)信息進(jìn)行研究，有助于加快提高苧麻氮素利用率的研究進(jìn)程。

本試驗(yàn)表達(dá)特性研究表明，苧麻BnNRT1.1基因主要在根中表達(dá)，而苧麻具有較復(fù)雜的根系結(jié)構(gòu)，其由營(yíng)養(yǎng)根（俗稱(chēng)蘿卜根）、支根和細(xì)根組成［18］，前人研究［19］表明NRT1.1具有調(diào)控植物根系結(jié)構(gòu)的功能，而苧麻BnNRT1.1是否能夠調(diào)控蘿卜根、支根和細(xì)根的形成，有待于進(jìn)一步研究；苧麻氮代謝過(guò)程比較復(fù)雜，其與多種代謝途徑相關(guān)的基因相關(guān)聯(lián)，要完全明確其機(jī)制，難度較大。本研究發(fā)現(xiàn)苧麻BnNRT1.1在不同品種中的表達(dá)量不同，在氮高效品種龍?zhí)洞舐橹斜磉_(dá)量高，氮低效品種青皮桿麻中表達(dá)量低，因此BnNRT1.1在苧麻氮代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在后期研究中可嘗試通過(guò)分子生物學(xué)手段提高BnNRT1.1基因的表達(dá)量來(lái)提高苧麻的氮素利用率，本研究為其提供了一定的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

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