高壇玉，劉思淵，林國(guó)榮

（莆田學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，福建省新型污染物生態(tài)毒理效應(yīng)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 莆田 351100）

羊棲菜又名海大麥、玉草等，是北太平洋西部特有的暖溫帶性海藻，廣泛分布于我國(guó)遼寧、山東、福建、浙江省沿海，具有軟堅(jiān)散結(jié)，利水泄熱等功效，且藻體肥厚多汁，富含多糖、膳食纖維、蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)，以及人體所需的各種微量元素和八種必需氨基酸。它可作為工業(yè)用褐藻膠原料和藥品，臨床上多用于治療甲狀腺腫、淋巴浮腫病、腳氣病等，具有很高的食用和藥用價(jià)值。

羊 棲 菜 多 糖 （SargassumfusiformePolyccharides，SFPS）是指從羊棲菜中提取的水溶性多糖，主要由褐藻酸和褐藻糖膠組成。羊棲菜多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抑制腫瘤細(xì)胞、抗菌和抗病毒等生理活性。多糖是羊棲菜中的主要活性成分，研究發(fā)現(xiàn)多糖的生物學(xué)功能與其化學(xué)性質(zhì)有關(guān)，只有分離出多糖的有效成分并明確其結(jié)構(gòu)特征，才能進(jìn)一步研究其藥理活性。

以羊棲菜為原料，用熱水浸提法提取羊棲菜多糖粗品，篩選出最優(yōu)樹脂對(duì)羊棲菜多糖進(jìn)行分離純化，確定最佳多糖提取和分離純化參數(shù)，為羊棲菜多糖的開發(fā)與應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試供材料及處理

將羊棲菜粉碎烘干，在冰箱中保存待用。

1.2 主要化學(xué)試劑與儀器

主要試劑：無水乙醇（天津市鼎盛鑫化工有限公司），苯酚（天津市鼎盛鑫化工有限公司），濃硫酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），大孔樹脂HPD-100、HPD-400、HZ-801、HZ-818、NKA-9、LSA-5 （上海藍(lán)季科技發(fā)展公司）。

主要儀器：SartoriusBS224S電子天平（Sartorius公司）、DK-S24型電熱恒溫水浴鍋（上海精勝科學(xué)儀器有限公司）、YZ1515x衡流泵（保定蘭格衡流泵有限公司）、722型可見光分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器公司）、pH計(jì) （廈門精益興業(yè)公司）、BS-100A收集器（蘇州江東精密儀器有限公司）、SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 用分析天平精密稱取干燥后的葡萄糖5.00mg，加適量水溶解并于50 mL容量瓶中定容，配置成0.1 mg／mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 用移液管從上述配制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別吸取 0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1 mL，轉(zhuǎn)入干凈試管中，補(bǔ)加去離子水至1 mL。然后，運(yùn)用硫酸-苯酚法依次加入2.5mL濃硫酸和0.5 mL 6%苯酚溶液，搖勻并冷卻到室溫后靜置20 min。以第一管為空白，在490 nm處測(cè)定吸光度A，再以吸光度A為縱坐標(biāo)、糖濃度C為橫坐標(biāo)，得到回歸方程。

1.3.2 提取工藝的確定取羊棲菜粉末 5.0 g，分別加入75 mL的去離子水和75 mL的乙醇，在60℃的水浴鍋中提取2 h，再取5.0 g羊棲菜粉末加入75 mL去離子水在60℃超聲波環(huán)境下提取0.5 h，通過測(cè)其吸光度選出最佳提取工藝。其次，取羊棲菜粉末5.0 g，運(yùn)用最好的提取方法分別在45℃、60℃、75℃、90℃下加熱2 h，得到不同溫度下的羊棲菜多糖提取液，確定最優(yōu)提取溫度。再次，按照 1∶10，1∶12.5，1∶15，1∶20固液比，在上述試驗(yàn)后的最優(yōu)溫度下水浴加熱2 h，確定最優(yōu)提取固液比。最后，在水浴加熱時(shí)間為1.5 h，2 h，2.5 h，3 h 的條件下，按照上述試驗(yàn)所得的最適溫度和最適提取固液比進(jìn)行試驗(yàn)，確定最適提取時(shí)間，即可確定羊棲菜多糖適宜提取工藝。

將上述不同條件下所得的提取液取1 mL于干燥潔凈的試管中，依次加入2.5 mL濃硫酸和0.5 mL 6%苯酚溶液，邊滴加邊震蕩，冷卻至室溫后靜置20 min，在490 nm處測(cè)其吸光度。

1.3.3 樹脂的篩選

1）樹脂預(yù)處理 樹脂經(jīng)預(yù)處理并用水沖洗，直到無色無味。

2）靜態(tài)吸附 選用大孔樹脂 HPD-100、HPD-400、HZ-801、HZ-818、NKA-9、LSA-5 各 5 mL， 分別加入羊棲菜多糖提取液80 mL，在100 r／min搖床上5次吸附。第一次為吸附2 h測(cè)一次吸光度，此后每隔1 h測(cè)一次吸光度，共吸附6 h。然后，將所得吸附液取1 mL于干燥潔凈的試管中，依次加入2.5 mL濃硫酸和0.5 mL 6%苯酚溶液，邊滴加邊震蕩，冷卻至室溫后靜置20 min，在490 nm處測(cè)其吸光度。

3）靜態(tài)洗脫 在吸附后的樹脂中加入60 mL 50%的乙醇，洗脫3h后將所得洗脫液取1 mL于干燥潔凈的試管中，依次加入2.5 mL濃硫酸和0.5m L6%苯酚溶液，邊滴加邊震蕩，冷卻至室溫后靜置20 min，在490 nm處測(cè)其吸光度。

1.3.4 動(dòng)態(tài)吸附

1）飽和吸附。NKA-9樹脂在無水乙醇中浸泡24 h，用去離子水洗至中性。在層析柱中加入15 mL濕樹脂，以2 BV的流速吸附羊棲菜多糖的提取液。經(jīng)分部收集器收集得到漏出液，并在490 nm處測(cè)定吸光度。

2）動(dòng)態(tài)吸附。采用水提取方式，1∶15固液比，在90℃條件下提取3 h得到提取液。經(jīng)無水乙醇浸泡NKA-9樹脂24 h后，用去離子水洗至中性，在玻璃層析柱中裝填15 mL濕樹脂，加入100 mL羊棲菜多糖提取液，在1 BV、2 BV、3 BV三種不同流速下進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，以篩選出最優(yōu)提取效果下的流速，再進(jìn)行不同上樣濃度的吸附。 按照 1∶10，1∶15，1∶20 不同固液比，在90℃下取提取液100 mL，在玻璃層析裝填15 mL濕樹脂，在最適流速下進(jìn)行吸附處理。

取上述不同條件下的吸附液1 mL于干燥潔凈的試管中，依次加入2.5 mL濃硫酸和0.5 mL 6%苯酚溶液，邊滴加邊震蕩，冷卻至室溫后靜置20 min，在490 nm處測(cè)其吸光度。

1.3.5 動(dòng)態(tài)洗脫對(duì)上述完成動(dòng)態(tài)吸附的樹脂柱用去離子水淋洗，然后低溫保存處理。

取動(dòng)態(tài)吸附后的樹脂15 mL填裝于玻璃層析柱中，然后用50%、60%和70%乙醇溶液120 ml進(jìn)行洗脫處理，流速為2BV。 然后，以120 ml最佳乙醇濃度進(jìn)行洗脫處理，流速為1BV、2BV和3 BV。取上述不同條件下的吸附液1 mL于干燥潔凈的試管中，依次加入2.5 mL濃硫酸和0.5 mL 6%苯酚溶液，邊滴加邊震蕩，冷卻至室溫后靜置20 min，在490 nm處測(cè)其吸光度。

1.3.6 純度測(cè)定

精準(zhǔn)稱取制備好的的樣品，用甲醇作為溶劑，將樣品溶解并定容至10 mL，同上法測(cè)定溶液吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出純化后的多糖濃度，按照下式計(jì)算純度：

式中，C為通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的純化后果皮花青素的濃度，mg／mL， V 為定容體積，10 mL，m 為精準(zhǔn)稱取的樣品質(zhì)量，mg

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

羊棲菜多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of polysaccharide

樣液吸光度為A490 nm＝7.430，代入圖1標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得出樣液羊棲菜多糖質(zhì)量濃度為1.046 mg／mL。

表1 不同提取方式對(duì)羊棲菜多糖提取的影響Table 1 Effect of different extraction mode on extraction of Sargassum fusiforme polysaccharides

2.2 提取工藝的確定 不同提取方式對(duì)羊棲菜多糖提取的影響見表1。

2.2.1 提取方式的確定由表1可以看出，水提取法效果最好，乙醇提取法次之，超聲波提取效果最差，故本試驗(yàn)選用水提取方式提取羊棲菜中的多糖。

2.2.2 提取溫度的確定不同溫度對(duì)羊棲菜多糖提取的影響見圖2。

由圖2可以看出，水提取法中羊棲菜多糖的提取效果隨著溫度的增加而增大，且增加幅度隨溫度升高而呈遞增趨勢(shì)。60℃之前，多糖提取量隨溫度升高而增加的速度較緩慢，在溫度達(dá)到60℃以后，隨著水浴溫度的提高，多糖分子熱運(yùn)動(dòng)隨之加快，多糖提取量亦隨之增加，60～75℃之間增速較快，75～90℃之間達(dá)到最快增速，溫度達(dá)到90℃時(shí)為最佳提取效果。

圖2 不同溫度對(duì)羊棲菜多糖提取的影響Figure 2 Effect of different temperature on extraction of Sargassum fusiforme polysaccharides

2.2.3 最適提取固液比的確定不同固液比對(duì)羊棲菜多糖提取的影響見圖3。

圖3 不同固液比對(duì)羊棲菜多糖提取的影響Figure 3 Effect of different solid-to-liquid ratio on extraction of Sargassum fusiforme polysaccharides

由圖3可以看出，多糖提取效果隨固液比的變化而變化。當(dāng)固液比小于1：15時(shí)，多糖提取效果逐漸遞增；當(dāng)固液比為1∶15時(shí)，羊棲菜多糖提取效果最好；隨著固液比增大，其提取效果逐漸降低。造成此現(xiàn)象的原因是：當(dāng)固液比小于1∶15時(shí)，其羊棲菜多糖沒有完全溶解于水中，故提取效果較差；當(dāng)固液比大于1∶15時(shí)，其溶液中水較多，對(duì)羊棲菜多糖起到稀釋作用，且固液比越大，其溶液中多糖濃度就越小，繼而提取效果隨之下降。

2.2.4 不同時(shí)間條件下提取效果不同時(shí)間對(duì)羊棲菜多糖提取的影響見圖4。

圖4 不同時(shí)間對(duì)羊棲菜多糖提取的影響Figure 4 Different time on extraction of Sargassum fusiforme polysaccharides

由圖4可以看出，羊棲菜多糖提取量隨提取時(shí)間的增加而呈遞增趨勢(shì)，且隨著時(shí)間的增加，多糖提取量的增大趨勢(shì)逐漸減緩。當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到3 h時(shí)，多糖提取效果最好。

2.3 大孔樹脂分離工藝的確定

2.3.1 大孔樹脂篩選 大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸結(jié)果見表2。

表2 大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸結(jié)果Table 2 Static adsorption and desorption results of macroporous resin

從表2可知，隨著時(shí)間的增加各個(gè)大孔樹脂的吸附量逐漸增大，對(duì)羊棲菜多糖提取而言，吸附量最佳的是NKA-9，HZ-818次之，HPD-400最差；洗脫效果最好的是NKA-9，HZ-818次之，其中HB-801最差。由于NKA-9吸附能力最佳，洗脫效果最好且解吸率最高，故后續(xù)試驗(yàn)采用NKA-9型大孔樹脂。

2.3.2 NKA-9大孔樹脂對(duì)多糖飽和吸附量確定NKA-9大孔樹脂飽和吸附曲線見圖5。

由圖5可以看出，以2BV的速度進(jìn)行吸附，當(dāng)上樣量達(dá)到85 mL時(shí)，其吸附液吸光度變化很小，趨近于原液的40.71，但仍呈上升趨勢(shì)。其最大吸附量為106.95 mg／mL，故決定動(dòng)態(tài)吸附時(shí)的上樣量為100 mL。

圖5 NKA-9大孔樹脂飽和吸附曲線Figure 5 Saturation adsorption curve of NKA-9 macroporous resin

2.4 動(dòng)態(tài)吸附

2.4.1 NKA-9大孔樹脂在不同流速下吸附效果不同流速下NKA-9大孔樹脂的吸附曲線見圖6。

圖6 不同流速下NKA-9大孔樹脂的吸附曲線Figure 6 Adsorption curve of NKA-9 macroporous resin with different flow rate

從圖6中可以看出，當(dāng)流速為2 BV時(shí)，NKA-9對(duì)多糖的吸附效果明顯優(yōu)于1 BV和3 BV。吸附流速不同時(shí)會(huì)影響多糖在樹脂中的擴(kuò)散速度，吸附效果受溶質(zhì)在樹脂表面擴(kuò)散速度的的影響。當(dāng)流速為3 BV時(shí)，流速過大會(huì)導(dǎo)致樹脂吸附量降低。當(dāng)流速為1 BV時(shí)，吸附流速過小會(huì)導(dǎo)致吸附時(shí)間增加。當(dāng)流速為2 BV時(shí)，其吸附效果最好，達(dá)到飽和時(shí)的上樣體積為100 mL。

2.4.2 NKA-9大孔樹脂在不同濃度下吸附效果不同濃度下NKA-9大孔樹脂的吸附曲線見圖7。

圖7 不同濃度下NKA-9大孔樹脂的吸附曲線Figure 7 Adsorption curve of NKA-9 macroporous resin with different concentration

從圖7可以看出，不同濃度的提取液其吸附效果具有較為明顯的差異。濃度越大時(shí)，提取液中的溶質(zhì)極易造成大孔樹脂堵塞，導(dǎo)致吸附效果上升緩慢；提取液濃度越小，其吸附時(shí)達(dá)到飽和所需要的提取液就越多。因此，羊棲菜多糖吸附的最適濃度為1.671 mg／mL。

2.5 動(dòng)態(tài)洗脫

2.5.1 不同乙醇濃度下洗脫效果不同濃度下NKA-9大孔樹脂的洗脫曲線見圖8。

從表8可以看出，乙醇濃度越大其洗脫效果越好，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到70%時(shí)洗脫率最高，但到洗脫后期出現(xiàn)較明顯的尾部。當(dāng)乙醇濃度達(dá)到50%時(shí)，其洗脫效果遠(yuǎn)不及60%和70%乙醇的洗脫效果，故以60%乙醇為最佳洗脫濃度。

2.5.2 不同流速下洗脫效果不同流速下 NKA-9大孔樹脂的洗脫曲線見圖9。

圖9 不同流速下NKA-9大孔樹脂的洗脫曲線Figure 9 Elution curve of NKA-9 macroporous resin with different flow rate

從圖9可以看出，NKA-9大孔樹脂的洗脫效果與流速呈正相關(guān)。當(dāng)流速達(dá)到3 BV時(shí)，洗脫出現(xiàn)高點(diǎn)，但在2 BV時(shí)其洗脫曲線呈現(xiàn)出更好的對(duì)稱性，據(jù)此確定出2 BV的乙醇為最佳洗脫時(shí)的流速。

2.5.3 純度測(cè)定精密稱取冷凍干燥后的樣品 0.0056 g，測(cè)定溶液吸光度，計(jì)算得到分離后的果皮多糖濃度為 0.353 mg／mL，純度達(dá)到了 63.1%。

3 結(jié)論

羊棲菜多糖是從全藻中提取的一種水溶性多糖，包括褐藻酸、褐藻多糖硫酸酯及褐藻淀粉，具有抗腫瘤、抗氧化、降血脂、降血糖和促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育等多種藥理活性。試驗(yàn)表明：羊棲菜在1∶15的固液比，90℃溫度加熱3 h后，其提取效果最好。選用NKA-9大孔樹脂進(jìn)行吸附時(shí)，最適上樣濃度為1.671 mg／mL，最適流速為2 BV；洗脫時(shí)流速為2 BV，乙醇濃度為60%，獲得羊棲菜多糖的純度達(dá)到63.1%。