徐 華 張 茹 劉連亮 張進杰 楊文鴿 樓喬明

(寧波大學海洋學院，寧波 315211)

裂殖壺菌(Schizochytriumsp.)，又名裂壺藻，其屬于真菌門(Eumycota)、網(wǎng)粘菌綱(Labyrinthulomycetes)、破囊壺菌目(Thraustochytriales)、破囊壺菌科(Thraustochytriaceae)的一類類藻的海洋微生物[1]。裂殖壺菌的菌體脂質(zhì)含量豐富，且以甘油三酯為主，DHA占總脂肪酸含量的30%～40%，被認為是一種理想的DHA新生資源。目前，從裂殖壺菌中提取制備高純度DHA已日益成為國內(nèi)外海洋生物技術(shù)的研究熱點[2-3]。

水酶法是近年來廣泛研究的一種油脂提取新技術(shù)，是將生物酶制劑應用于油脂分離的方法，通過酶制劑對油料底物的降解作用，提高油脂出油率；該方法具有選擇性降解、副產(chǎn)物少、出油率高、油質(zhì)好等優(yōu)點[4-5]。因此，本實驗采用水酶法對裂殖壺菌油脂的提取工藝進行研究和優(yōu)化，以期為裂殖壺菌油脂提取及后續(xù)工業(yè)化應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

裂殖壺菌(Schizochytriumlimacinum)干粉：廈門匯盛生物有限公司，經(jīng)Folch法測定，其油脂質(zhì)量分數(shù)為44.63%。菠蘿蛋白酶(50萬U/g)、木瓜蛋白酶(80萬U/g)、酸性蛋白酶(80萬U/g)、堿性蛋白酶(20萬U/g)、中性蛋白酶(20萬U/g)、纖維素酶(5萬U/g)：均為食品級試劑酶，江蘇銳陽生物科技有限公司；37種脂肪酸甲酯混合標準品：美國Sigma公司；甲醇、氯仿、正己烷：均為分析純，天津市科密歐化學試劑公司。

1.2 儀器和設備

6890N型氣相色譜儀、5973型質(zhì)譜儀：美國Agilent公司；Laborota 4000 efficient旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：德國海道爾夫公司；THZ-82型水浴恒溫振蕩器：常州國華電器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 水酶法提取的工藝流程

裂殖壺菌干粉→加水→微波預處理→酶解→正己烷萃取→減壓濃縮→油脂

提取工藝要點：取2 g裂殖壺菌干粉，按一定液料比加入蒸餾水，并微波5 min(微波頻率2 450 MHz，輸出功率450 W)；待樣品冷卻至室溫，加入一定量的酶制劑，放于水浴恒溫振蕩器中60 r/min進行酶解。酶解結(jié)束后，按裂殖壺菌干粉質(zhì)量，以2 mL/g的用量加入正己烷，振蕩萃取2 min，于5 000 r/min離心5 min，收集上層正己烷相，重復萃取2次，合并正己烷相；經(jīng)40 ℃減壓濃縮后，于105 ℃干燥至恒重，稱取油脂質(zhì)量，并計算裂殖壺菌油脂提取率。油脂提取率的計算公式為：

1.3.2 酶的選取和復合酶配比的確定

取2 g裂殖壺菌干粉，按2 mL/g的液料比加入蒸餾水，微波處理后，按1 000 U/g的添加量分別加入纖維素酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶，并以不加酶制劑為對照，于50 ℃恒溫水浴酶解3 h，酶解結(jié)束后用正己烷萃取油脂，計算裂殖壺菌的油脂提取率；并以纖維素酶和中性蛋白酶組成復合酶，測定兩者間的配比對裂殖壺菌油脂提取率的影響。

1.3.3 單因素和正交優(yōu)化實驗

在復合酶配比為2:8(纖維素酶:中性蛋白酶，U:U)的基礎上，以液料比、加酶量、酶解溫度和酶解時間為因素，以油脂提取率為指標進行單因素實驗；并綜合單因素實驗結(jié)果，采用極差法對上述4個因素進行正交優(yōu)化實驗，正交因素水平表見表1。

表1 正交設計因素水平表

1.3.4 脂肪酸分析

甲酯化衍生取10 mg所提的裂殖壺菌油脂，加入1 mL的2 mol/L HCl-甲醇溶液，于60 ℃水浴中甲酯化15 min，冷卻后加入1 mL正己烷振蕩，靜置分層后，取上清液用無水硫酸鈉干燥，供GC-MS分析。

色譜條件HP-INNOWax石英毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，高純氦氣為載氣，采用恒壓模式，壓力為54 kPa，分流比為25:1。進樣口溫度為230 ℃，檢測器溫度為250 ℃，柱溫以3 ℃/min由120 ℃升到210 ℃，并在210 ℃下保持10 min，整個分析過程為40 min。

質(zhì)譜條件GC-MS接口溫度280 ℃，EI離子源,電離能量70 eV，離子源溫度230 ℃，掃描周期2.84次/s，質(zhì)量掃描范圍m/z50～500 u。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每次實驗平行測定3次，利用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示；采用單因素方差分析法(ANOVE，Tukey檢驗)進行顯著性檢驗，并通過Duncan’s法進行單因素多重比較分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶制劑的選擇與配比優(yōu)化

在液料比2 mL/g條件下，按1 000 U/g的加酶量分別添加纖維素酶(Cel)、菠蘿蛋白酶(Bro)、木瓜蛋白酶(Pap)、酸性蛋白酶(Aci)、堿性蛋白酶(Alc)和中性蛋白酶(Neu)，并以不加酶制劑為對照(Con)，置于50 ℃恒溫水浴振蕩酶解3 h，不同酶制劑對油脂提取的影響如圖1所示。

圖1 酶制劑對油脂提取率的影響

由圖1可知，添加纖維素酶或蛋白酶能顯著增加裂殖壺菌的油脂提取率(P<0.05)，且不同酶制劑對油脂提取率具有顯著差異(P<0.05)，其中中性蛋白酶的油脂提取率最高(44.96%)，菠蘿蛋白酶(40.04%)、堿性蛋白酶(37.13%)、木瓜蛋白酶(36.84%)和酸性蛋白酶(35.61%)的提取率依次降低，而纖維素酶的油脂提取率最低，僅為20.61%。這是因為纖維素酶和不同蛋白酶的酶解底物、作用位點和催化活力不同[6]。裂殖壺菌的細胞壁結(jié)構(gòu)，以及細胞中存在的脂蛋白復合體，對油脂分子具有包埋作用，不利于油脂的提取。單獨水提熱處理很難破壞細胞壁和脂蛋白復合體對油脂分子的包埋作用，而纖維素酶和蛋白酶能分別有效降解裂殖壺菌的細胞壁結(jié)構(gòu)和脂蛋白復合體，使包埋的油脂釋放出來，提高油脂提取率[5]。實驗結(jié)果表明添加纖維素酶和不同蛋白酶能分別有效降解破壞裂殖壺菌細胞壁結(jié)構(gòu)和脂蛋白復合體，釋放油脂，從而顯著提高裂殖壺菌的油脂提取率。

酶制劑具有較強的底物專一性，這意味著采用單一酶制劑在酶解提取油脂的工藝應用中具有一定的局限性；根據(jù)酶解底物基本性質(zhì)，選擇合適的幾種酶制劑復合使用，能兼具多種生物酶的不同活性，并對酶解過程產(chǎn)生協(xié)同促進作用，更有利于細胞中油脂的析出和聚集，進而提高油脂提取率[7]。因此根據(jù)單一酶制劑的實驗結(jié)果，并結(jié)合裂殖壺菌細胞壁構(gòu)成和胞內(nèi)脂蛋白復合物的底物性質(zhì)，采用纖維素酶和中性蛋白酶進行復合配比實驗，復合酶不同配比對油脂提取率的影響如圖2所示。

圖2 復合酶配比對油脂提取率的影響

由圖2可知，在復合酶的總酶活為1 000 U/g的前提下，纖維素酶和中性蛋白酶的不同配比，對裂殖壺菌油脂的提取率產(chǎn)生顯著影響(P<0.05)。首先，隨著中性蛋白酶含量的增加，裂殖壺菌的油脂提取率顯著增加(P<0.05)；當纖維素酶和中性蛋白酶的酶活力比值為2:8時，油脂提取率達到最大值(50.16%)，遠高于單獨使用纖維素酶(20.61%)和中性蛋白酶(44.96%)。之后，隨著中性蛋白酶含量的繼續(xù)增加，油脂提取率略有降低。因此選取復合酶配比為2:8(纖維素酶:中性蛋白酶，U:U)進行后續(xù)的單因素實驗。

2.2 單因素實驗

在復合酶配比2:8(纖維素酶:中性蛋白酶，U:U)的條件下，以液料比、加酶量、酶解溫度和酶解時間為實驗因素，測定上述4種因素的不同水平對裂殖壺菌油脂提取率的影響，實驗結(jié)果見圖3。

圖3 不同因素對油脂提取率的影響

在復合酶配比2:8(纖維素酶:中性蛋白酶，U:U)、加酶量1 000 U/g、酶解溫度50 ℃和酶解時間3 h條件下，當液料比為2 mL/g時，裂殖壺菌油脂提取率為50.16%，同時隨著液料比的增大，裂殖壺菌油脂提取率顯著增加(P<0.05)；當液料比達到4 mL/g時，油脂提取率達到最大值(62.43%)；繼續(xù)增加液料比，裂殖壺菌油脂提取率顯著降低(P<0.05)。這是由于當液料比較低時，物料較為黏稠，不利于酶與底物的充分接觸，酶解反應不能有效進行，且較低的液料比不利于油脂分子的游離，致使油脂提取率較低；隨著液料比的適當增加，增加酶與底物的有效接觸，并降低溶劑中油脂濃度，增加物料與溶劑間的濃度差，降低酶解體系的乳化效應，增加物料中油脂向溶劑擴散的速度和游離速度，從而顯著增加油脂提取率[8-9]。當液料比大于4 mL/g，繼續(xù)增加液料比，使酶解體系中的酶和底物濃度雙雙降低，影響酶解作用的發(fā)揮；且較高的液料比易增加后續(xù)工藝的難度和強度。因此裂殖壺菌油脂提取的最佳液料比為4 mL/g。

在復合酶配比2:8(纖維素酶:中性蛋白酶，U:U)、液料比2 mL/g、酶解溫度50 ℃和酶解時間3 h條件下，隨著加酶量的增加，裂殖壺菌油脂提取率顯著增加(P<0.05)，當加酶量為2 500 U/g，油脂提取率達到最大值(65.39%)；繼續(xù)增加復合酶用量，油脂提取率不再增加，并有一定的降低趨勢，但下降幅度不顯著(P>0.05)。這是因為適當增加酶用量，能有效提高酶濃度，增加酶與底物的接觸幾率，促進酶解反應的進行，進而增加油脂提取率。但當加酶量超過一定范圍時，易使酶解體系發(fā)生深度水解，水解產(chǎn)物增強蛋白質(zhì)的乳化性，使油脂分子再度被蛋白質(zhì)包裹，產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，增加油脂分離難度；同時加酶量過多使得酶分子間產(chǎn)生競爭作用，降低酶的作用效率，致使油脂提取率降低[10]。因此裂殖壺菌油脂提取的最佳加酶量為2 500 U/g。

在復合酶配比2:8(纖維素酶:中性蛋白酶，U:U)、液料比2 mL/g、加酶量1 000 U/g和酶解時間3 h條件下，在一定酶解溫度范圍內(nèi)，隨著酶解溫度的上升，裂殖壺菌油脂提取率先增加，并在55 ℃時，油脂提取率達到最大值(50.83%)；繼續(xù)提高酶解溫度，油脂提取率顯著降低(P<0.05)。適當提高酶解溫度有利于提高纖維素酶和中性蛋白酶的酶解活性，纖維素酶的最適溫度為50 ℃，中性蛋白酶的最適溫度為55 ℃，故在55 ℃溫度條件下，由纖維素酶和中性蛋白酶組成的復合酶的酶解活性最強；而繼續(xù)增加酶解溫度則會破壞纖維素酶和中性蛋白酶的活性中心，進而降低裂殖壺菌的油脂提取率，且酶解溫度的增加還易造成油脂氧化，降低油脂品質(zhì)[11]。因此綜合考慮油脂提取率和后續(xù)油脂品質(zhì)，裂殖壺菌油脂提取的最佳酶解溫度為55 ℃。

在復合酶配比2:8(纖維素酶:中性蛋白酶，U:U)、液料比2 mL/g、加酶量1 000 U/g和酶解溫度50 ℃條件下，當酶解時間為1 h時，裂殖壺菌油脂提取率僅為32.54%；隨著酶解時間的增加，油脂提取率顯著增加(P<0.05)；當酶解時間為4 h時，油脂提取率達到最大值(54.23%)。之后，隨著酶解時間的增加，油脂提取率趨于平緩，繼續(xù)增加酶解時間對裂殖壺菌油脂提取率沒有顯著影響(P>0.05)；同時，進一步延長酶解時間，易使酶解體系中乳狀液趨于穩(wěn)定，造成破乳困難，降低油脂提取率[12]；且裂殖壺菌富含DHA，酶解時間過長，易使油脂發(fā)生氧化，降低油脂品質(zhì)。因此裂殖壺菌油脂提取的最佳酶解溫度為4 h。

2.3 正交優(yōu)化實驗

根據(jù)單因素實驗，以纖維素酶和中性蛋白酶為復合酶(2:8，U:U)，選取液料比、加酶量、酶解溫度和酶解時間為實驗因素，以油脂提取率為指標，采用正交方法考察各因素對裂殖壺菌油脂提取率的影響，實驗設計和結(jié)果列于表2，其方差分析結(jié)果列于表3。

表2 正交優(yōu)化設計與結(jié)果

表3 正交實驗方差分析

注：F0.05(2,2)=19.00；*表示P<0.05，差異顯著。

由表2可知，水酶法提取裂殖壺菌油脂的過程中，實驗中各因素對油脂提取率的影響依次為：加酶量>液料比>酶解時間>酶解溫度，即加酶量對裂殖壺菌油脂提取的影響最大，液料比和酶解時間次之，酶解溫度最??；并對上述4個因素進行方差分析可知，加酶量和液料比對裂殖壺菌油脂提取率有顯著影響(P<0.05)，而酶解時間和酶解溫度對油脂提取率的影響不顯著(P>0.05)，優(yōu)化后的油脂提取條件為A2B3C3D2，即液料比4 mL/g，加酶量2 500 U/g，酶解溫度55 ℃，酶解時間4 h；并在此優(yōu)化條件下進行驗證實驗，裂殖壺菌油脂提取率達到82.47%。

2.4 裂殖壺菌脂肪酸組成分析

裂殖壺菌油脂經(jīng)酸酯化衍生處理，采用GC-MS技術(shù)對其脂肪酸組成進行分析，其總離子流色譜圖見圖4；通過標準品對照和數(shù)據(jù)庫檢索等方法對其脂肪酸進行定性，并按峰面積歸一法進行定量，分析鑒定結(jié)果列于表4。

從表4可知，從裂殖壺菌油脂中共鑒定出18種脂肪酸，以C14:0(4.00%)、C16:0(54.37%)、C22:5n-6(3.94%)和C22:6n-3(DHA，32.65%)為主；其中飽和脂肪酸6種，占總脂肪酸含量的59.68%；不飽和脂肪酸12種，占總脂肪酸含量的40.32%。C22:6n-3是一種重要的n-3型多不飽和脂肪酸，能有效促進嬰幼兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，提高智力；調(diào)節(jié)血脂，預防心腦血管疾病；提高免疫力，增強抗炎、抗癌能力[13-15]。裂殖壺菌油脂富含C22:6n-3，表明其具有很高的營養(yǎng)價值，可作為C22:6n-3的重要生物來源；同時其脂肪酸組成簡單，與C22:6n-3結(jié)構(gòu)類似但功能上有拮抗作用的C20:5n-3(EPA)含量極低，僅為0.52%，這便于C22:6n-3的分離純化和高純度C22:6n-3的制備；同時這一脂肪酸組成特征也將拓展裂殖壺菌油脂在食品和醫(yī)藥等領域的應用范圍，尤其在嬰幼兒食品方面。

注：圖中序號與表4中序號一致。圖4 裂殖壺菌脂肪酸甲酯的總離子流色譜圖 表4 裂殖壺菌油脂的脂肪酸組成(n=3)

序號保留時間/min脂肪酸質(zhì)量分數(shù)/%13.91C1200.15±0.0226.66C1404.00±0.1737.02C141n-50.30±0.0348.50C1500.17±0.02510.90C16054.37±0.68611.20C161n-90.18±0.02713.41C1700.12±0.03815.44C1800.86±0.05915.77C181n-90.34±0.041015.94C181n-70.25±0.021116.82C182n-60.79±0.041218.38C183n-60.15±0.021319.09C183n-30.11±0.021422.84C204n-60.84±0.041523.96C204n-30.25±0.021624.48C205n-3(EPA)0.52±0.041730.20C225n-6(DPA)3.94±0.121833.42C226n-3(DHA)32.65±0.46

3 結(jié)論

3.1 以纖維素酶和中性蛋白酶組成水解復合酶，兩者配比為2:8(纖維素酶:中性蛋白酶，U:U)，并經(jīng)單因素和正交優(yōu)化實驗得到水酶法提取裂殖壺菌油脂的最佳工藝條件：液料比4 mL/g，加酶量2 500 U/g，酶解溫度55 ℃，酶解時間4 h；在此優(yōu)化條件下，裂殖壺菌油脂提取率為82.47%。

3.2 裂殖壺菌油脂脂肪酸組成簡單，以C14:0、C16:0、C22:5n-6和C22:6n-3為主，其中C22:6n-3質(zhì)量分數(shù)高達32.65%，表明裂殖壺菌油脂具有很高的營養(yǎng)價值和脂質(zhì)開發(fā)潛力，可以作為制備天然高純度C22:6n-3的重要生物來源。

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