袁鵬飛，張 雯，徐 風(fēng)，劉廣學(xué)，尚明英，蔡少青

(北京大學(xué)藥學(xué)院， 北京 100191)

桂枝湯是中醫(yī)常用方劑，來源于張仲景的《傷寒論》，由桂枝、白芍、炙甘草、生姜和大棗等5味中藥組成，具有解肌發(fā)表、調(diào)和營衛(wèi)之功效，用于治療外感風(fēng)寒表虛證。桂枝湯的主要有效成分為苯丙烯類化合物，周碩等[1-2]采用化學(xué)分離的方法從桂枝湯中分離鑒定了桂皮醛、桂皮醇等15種化合物；曹進等[3]采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法對桂枝湯A部分的主要色譜峰與對應(yīng)的各單味藥材進行了歸屬，但未鑒定化合物的結(jié)構(gòu)；陳璐琳[4]采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法對桂枝湯進行化學(xué)成分分析，鑒定了144種化合物并對其來源藥材進行了歸屬。桂枝湯中主要成分原兒茶酸、香豆素、芍藥苷、甘草苷、肉桂酸和桂皮醛的含量已有文獻報道[5-7]。本課題組前期采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法測定了桂枝湯中沒食子酸、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、甘草苷、香豆素、桂皮酸、桂皮醛、2-甲氧基桂皮醛和甘草酸等9種主要成分以及桂枝湯君藥桂枝中2-羥基肉桂酸、香豆素、肉桂醇、肉桂酸、2-甲氧基肉桂酸、肉桂醛和2-甲氧基肉桂醛等7種苯丙素類成分的含量[8-9]，并采用HPLC法對桂枝化學(xué)成分進行指紋圖譜研究，指認了3-羥基桂皮酸、2-羥基桂皮酸、4-羥基-3-甲氧基桂皮醛、2-羥基桂皮醛、香豆素、桂皮醇、桂皮酸、2-甲氧基桂皮酸、桂皮醛和2-甲氧基桂皮醛等10種化學(xué)成分[10]。為了全面認識桂枝湯的化學(xué)成分組成，本實驗采用HPLC/電噴霧-離子阱-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC/electrospray ionization-ion trap-time-of-flight mass spectrometry，HPLC-ESI-IT-TOF-MSn)法對桂枝湯進行了分析，根據(jù)精確的分子量信息及質(zhì)譜裂解規(guī)律進行解析，并與對照品對照或參考相關(guān)文獻數(shù)據(jù)，指認了桂枝湯中51種化合物，其中20種化合物為桂枝湯中首次報道，現(xiàn)報告如下。

1 材料

1.1 儀器

Shimadzu LC-ESI-IT-TOF-MS系統(tǒng)(日本島津公司)，包括LC-20AD 輸液泵、SIL-20AC自動進樣器、CTO-20AC柱溫箱、SPD-M20 A二極管陣列檢測器、CBM-20 A控制器、DGU-20A3在線脫氣機和ESI-IT-TOF-MS電噴霧電離-離子阱-飛行時間串連質(zhì)譜儀；BP211D型十萬分之一電子天平(德國Sartorius公司)；AR1140型萬分之一電子天平(美國OHAUS公司)；Milli-Q超純水制備儀(美國Millipore公司)。

1.2 藥品與試劑

1.2.1 藥材：桂枝(編號：6550)，產(chǎn)地廣西；灸甘草(編號：6552)，產(chǎn)地內(nèi)蒙古；以上2味藥材購自北京同仁堂崇文門藥店。白芍(編號：6554)，產(chǎn)地安徽，購自北京花園路聯(lián)康藥店。生姜、大棗購自北京海淀區(qū)花園北路超市發(fā)朗秋園店。以上藥材經(jīng)北京大學(xué)藥學(xué)院尚明英副教授鑒定，桂枝為樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl.的干燥嫩枝，白芍為毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根，灸甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根及根莖的蜜炙品，生姜為姜科植物姜ZingiberofficinaleRose.的新鮮根莖，大棗為鼠李科植物棗ZiziphusjujubaMill.的干燥果實。憑證標本保存于北京大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)標本室。

1.2.2 對照品：沒食子酸(批號：100702)；(+)-兒茶素(批號：110202)；甘草苷(批號：90108)；香豆素(批號：100606)；異甘草苷(批號：91026)；異甘草素(批號：90416)；丹皮酚(批號：100523)；甘草素(批號：90907)；甘草酸(批號：91204)；甘草次酸(批號：101004)；均購自成都曼思特生物科技有限公司。羥基芍藥苷(批號：20100923)；芍藥內(nèi)酯苷(批號：20100722)；苯甲酰芍藥苷(批號：20100715)；均購自上海展舒化學(xué)科技有限公司。桂皮醇(批號：A0198694，Acros)；桂皮酸(批號：A0218853001，Acros)；2-甲氧基桂皮酸(批號：A019482701，Acros)；桂皮醛(美國Acros公司，批號：A0295155)；2-甲氧基桂皮醛(批號：S07070-195，Aldrich)；均購自北京百靈威科技有限公司。苯甲酸(批號：100419-200301)，購自中國藥品生物制品檢定所。芍藥苷為課題組從赤芍中分離純化，經(jīng)核磁、質(zhì)譜等波譜技術(shù)鑒定結(jié)構(gòu)。經(jīng)HPLC-二極管陣列檢測器測定，異甘草苷純度為95%，其余對照品純度均≥98%(峰面積歸一化法)。

1.2.3 試劑：乙腈(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，美國Mreda公司)；超純水(Milli-Q儀制備)。

2 方法與結(jié)果

2.1 液相條件

色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速1.0 ml/min；進樣量10 μl；檢測波長200～700 nm；柱溫25 ℃。以0.1%甲酸水溶液為流動相A、乙腈為流動相B進行梯度洗脫(0 min，5%B；10 min，13%B；15 min，13%B；35 min，18%B；40 min，18%B；45 min，20%B；80 min，31%B；85 min，31%B；95 min，36%B；100 min，50%B；100 min，100 %B；120 min，100%B；125 min，5%B)。

2.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜檢測條件為ESI離子源，采集范圍一級質(zhì)譜m/z100～1 000，二級質(zhì)譜m/z50～1 000，自動母離子選擇模式；離子累積時間30 ms；接口電壓：(+)4.5 kV，(-)-3.5 kV；霧化氣流速1.50 L/min；曲型脫溶劑管溫度200 ℃；檢測器電壓1.70 kV；碰撞誘導(dǎo)解離能量50%。

2.3 對照品溶液的制備

稱取對照品適量，以甲醇為溶劑，分別配成沒食子酸420.0 μg/ml、羥基芍藥苷1 029.0 μg/ml、(+)-兒茶素408.8 μg/ml、芍藥內(nèi)酯苷1 018.0 μg/ml、芍藥苷3 351.0 μg/ml、甘草苷1 012.0 μg/ml、苯甲酸1 054.0 μg/ml、香豆素1 011.0 μg/ml、桂皮醇1 316.0 μg/ml、異甘草苷1 070.0 μg/ml、甘草素1 058.0 μg/ml、桂皮酸997.0 μg/ml、桂皮醛2 517.0 μg/ml、2-甲氧基桂皮酸1 093.0 μg/ml、苯甲酰芍藥苷1 023.0 μg/ml、丹皮酚477.6 μg/ml、2-甲氧基桂皮醛1 754.0 μg/ml、異甘草素1 013.0 μg/ml、甘草酸438.0 μg/ml和甘草次酸406.4 μg/ml的對照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備

根據(jù)處方分別取桂枝9 g、白芍9 g、炙甘草6 g、生姜9 g和大棗9 g，煎煮2次，第1次煎煮加入8倍量的去離子水，浸泡30 min，煎煮30 min，兩層紗布過濾；第2次煎煮加入6倍量的水，煎煮30 min，兩層紗布過濾。合并2次煎煮液，減壓濃縮后放至室溫(20 ℃)，稀釋至200 ml，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。同樣方法制備各單味藥的供試品溶液。

2.5 桂枝湯的HPLC-ESI-IT-TOF-MSn分析結(jié)果

按上述色譜及質(zhì)譜條件項下的檢測方法，對桂枝湯水煎液進行HPLC-ESI-IT-TOF-MSn分析，結(jié)果見圖1—2。

A.桂枝湯對照品；B.桂枝湯水煎液A.Guizhi decoction control substance；B.Guizhi decoction圖1 桂枝湯對照品和水煎液的HPLC圖(波長為254 nm)Fig 1 HPLC of Guizhi decoction control substance and Guizhi decoction(with wavelength of 254 nm)

2.6 桂枝湯中主要化學(xué)成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律及結(jié)構(gòu)解析

通過離子阱-飛行時間液質(zhì)聯(lián)用法指認了桂枝湯中51種化合物，并給出了可能的分子式，其中通過對照品確認的化合物有20種，分別為沒食子酸、氧化芍藥苷、兒茶素、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、苯甲酸、香豆素、桂皮醇、異甘草苷、異甘草素、桂皮酸、桂皮醛、2-甲氧基桂皮酸、苯甲酰芍藥苷、丹皮酚、2-甲氧基桂皮醛、甘草素、甘草酸和甘草次酸。分析結(jié)果與各化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)見表1。部分化合物的結(jié)構(gòu)解析如下：

A.桂枝湯對照品；B.桂枝湯水煎液A.Guizhi decoction control substance；B.Guizhi decoction圖2 桂枝湯對照品和水煎液的總離子流圖Fig 2 Total ion chromatogram of Guizhi decoction control substance and Guizhi decoction

2.6.1 化合物2(tR=8.33 min)的結(jié)構(gòu)分析：一級質(zhì)譜圖給出準分子離子峰為m/z559.117 1([M-H]-)，預(yù)測分子式為C23H28O14S。二級質(zhì)譜圖中可見碎片離子峰(m/z)為513.106 4[M-H-HCOOH]-、421.080 8[M-H-pOHBA]-、375.078 7[M-H-pOHBA-HCOOH]-、259.029 9[M-H-pOHBA-Glc]-和213.023 2[M-H-HCOOH-pOHBA-Glc]-(pOHBA=4-羥基苯甲酸)。以上信息符合氧化芍藥苷亞硫酸酯的裂解規(guī)律(見圖3)，并與文獻[11]報道數(shù)據(jù)基本一致。因此，推測2號峰為氧化芍藥苷亞硫酸酯。

表1 桂枝湯中指認的化學(xué)成分及其質(zhì)譜數(shù)據(jù)Tab 1 The identified chemical constituents and MS data of Guizhi decoction

續(xù)表1

編號保留時間/min分子式離子類型測定分子量/(m/z)誤差/ppm特征碎片離子化合物名稱1838118C7H6O2[M?H]-12103101652苯甲酸a1945643C30H32O15[M?H]-631167604651421[M?H?BA?CO2]-，3130567[GA+Glc?H?H2O]-沒食子酰芍藥苷及其異構(gòu)體b[13?14]2046728C21H22O10[M?H]-43311641622710614[M?H?Glc]-5?羥基甘草苷[12]2147148C9H6O2[M+H]+14704460681030498[M+H?CO2]+香豆素a2248373C23H28O11[M+HCOO]-52516480194791576[M?H]-，3571215[M?H?BA]-，2830806[BA+Glc?H2O?H]-異芍藥苷或芍藥內(nèi)酯苷R1b[11]2349948C9H8O3[M+H?H2O]+14902521341210301[M+H?CO]+，1080497[M+H?C2O]+，910023[M+H?C2O?H2O]+2?羥基桂皮醛b[15]2451768C30H32O14S[M?H]-647141505251080[M?H?BA]-，4791025[M?H?BA?HCOOH]-，3810646[M?H?BA?Glc]-，2590275[M?H?2BA?Glc]-，2130233[M?H?2BA?Glc?HCOOH]-苯甲酰芍藥苷亞硫酸酯[11]2555758C9H10O[M+H?H2O]+1170702-171桂皮醇a2657123C21H22O9[M?H]-4171205-0482550651[M?H?Glc]-，1350130[M?H?C8H8O]-異甘草苷a2762513C15H12O4[M?H]-2550656-0391350113[M?H?C8H8O]-，1190558[M?H?C8H8O2]-異甘草素a2864403C9H8O2[M+H]+1490245-7381310441[M+H?H2O]+，930222[M+H?H2O?CO]+桂皮酸a2970388C42H64O16[M?H]-82341342197613988[M?H?H2O?CO2]-，6473780[M?H?Glucuronicacid]-，4713504[M?H?2Glucuronicacid]-，3510557[2Glucuronicacid?2H2O?H]-，2890553[2Glucuronicacid?3H2O?CO2]-甘草皂苷J2[12]3070878C9H8O[M+H]+133065301150477[M+H?H2O]+桂皮醛a3174098C10H10O3[M+H]+179068902?甲氧基桂皮酸a3276198C30H32O12[M?H]-5831766-0865531689[M?H?HCHO]-，4311336[M?H?HCHO?BA]-苯甲酰芍藥苷a3376233C42H62O16[M?H]-82140271467593882[M?H?H2O?CO2]-，6453689[M?H?Glucuronicacid]-，3510544[2Glucuronicacid?2H2O?H]-，2890585[2Glucuronicacid?3H2O?CO2]-甘草皂苷H2或K2b[12]3478298C48H72O21[M?H]-98344901737594095[M?H?Glc?H2O?CO2]-，6453656[M?H?Glucuronicacid?Glc]-，4693362[M?H?2Glucuronicacid?Glc]-，3510579[2Glucuronicacid?2H2O?H]-甘草皂苷A3[12]3579733C9H10O3[M+H]+1670714-061490598[M+H?H2O]+丹皮酚a，b3682218C42H60O17[M?H]-8353785-067913852[M?H?CO2]-，6593379[M?H?Glucuronicacid]-，3510564[2Glucuronicacid?2H2O?H]-，2890539[2Glucuronicacid?3H2O?CO2]-23?羥基甘草皂苷E2b[12]3782568C42H62O17[M?H]-83739282277753933[M?H?H2O?CO2]-，6613579[M?H?Glucuronicacid]-，4853294[M?H?2Glucuronicacid]-，3510555[2Glucuronicacid?2H2O?H]-，2890560[2Glucuronicacid?3H2O?CO2]-甘草皂苷G2[12]3882918C44H64O18[M?H]-87940760346433455[M?H?Glucuronicacid?Acetoxyl]-，4233288[M?H?2Glucuronicacid?Acetoxyl?CO2]-，3510573[2Glucuronicacid?H?2H2O]-，2890566[2Glucuronicacid?H?3H2O?CO2]-22β?乙?；什菟醔[12]3986348C10H10O2[M+H]+1630751-4911450672[M+H?H2O]+2?甲氧基桂皮醛a4091178C42H62O17[M?H]-83739120367753899[M?H?H2O?CO2]-，6613584[M?H?Glucuronicacid]-，4853287[M?H?2Glucuronicacid]-，3510575[2Glucuronicacid?2H2O?H]-，2890552[2Glucuronicacid?3H2O?CO2]-甘草皂苷G2異構(gòu)體b[12]4191808C42H60O16[M?H]-8193843-0737573786[M?H?H2O?CO2]-，6433532[M?H?Glucuronicacid]-，4673246[M?H?2Glucuronicacid]-，3510548[2Glucuronicacid?2H2O?H]-，2890568[2Glucuronicacid?3H2O?CO2?H]-甘草皂苷E2b[12，16]4292350C15H12O4[M?H]-25506580391350119[M?H?C8H8O]-，1190135[M?H?C8H8O2]-甘草素a4392718C42H60O16[M?H]-819381106433386[M?H?Glucuronicacid]-，3510559[2Glucuronicacid?2H2O?H]-，2890564[2Glucuronicacid?3H2O?CO2]-異甘草皂苷E2b[12]4494853C42H62O17[M?H]-83739061677754061[M?H?H2O?CO2]-，6433512[M?H?Glucuronicacid?H2O]-，4853279[M?H?2Glucuronicacid]-，3510568[2Glucuronicacid?2H2O?H]-，2890563[2Glucuronicacid?3H2O?CO2]-甘草皂苷G2[12]4596358C42H62O17[M?H]-83739460847753910[M?H?H2O?CO2]-，6613613[M?H?Glucuronicacid]-，5993365[M?H?Glucuronicacid?CO2?H2O]-，4413322[M?H?2Glucuronicacid?CO2]-，3510557[2Glucuronicacid?2H2O?H]-，2890578[2Glucuronicacid?3H2O?CO2]-甘草皂苷G2異構(gòu)體[12]4698388C42H62O16[M?H]-82140001587593895[M?H?H2O?CO2]-，6453643[M?H?Glucuronicacid]-，4693322[M?H?2Glucuronicacid]-，3510583[2Glucuronicacid?2H2O?H]-，2890551[2Glucuronicacid?3H2O?CO2]-甘草酸a

續(xù)表1

編號保留時間/min分子式離子類型測定分子量/(m/z)誤差/ppm特征碎片離子化合物名稱47100628C42H62O16[M?H]-82139903657593957[M?H?H2O?CO2]-，6453600[M?H?Glucuronicacid]-，4693332[M?H?2Glucuronicacid]-，3510552[2Glucuronicacid?2H2O?H]-，2890546[2Glucuronicacid?3H2O?CO2]-異甘草酸[12，16]48101188C42H62O16[M?H]-82140136456273541[M?H?Glucuronicacid?H2O]-，4253399[M?H?2Glucuronicacid?CO2]-，3510572[2Glucuronicacid?2H2O?H]-，2890605[2Glucuronicacid?3H2O?CO2]-甘草皂苷H2或K2[12]49101678C42H64O16[M?H]-82341304137614035[M?H?H2O?CO2]-，6473741[M?H?Glucuronicacid]-，4713493[M?H?2Glucuronicacid]-，3510551[2Glucuronicacid?2H2O?H]-，2890582[2Glucuronicacid?3H2O?CO2]-甘草皂苷J2異構(gòu)體[12]50103673C17H26O4[M?H]-29317797162491827[M?H?C3H8]-，2371123[M?H?C4H9]-，2211567[M?H?C5H12]-6?姜酚b[17]51111537C30H46O4[M?H]-46933630644233264[M?H?CO2]-甘草次酸a

注：a.與對照品對照鑒定的化合物；b.桂枝湯中首次報道的化合物；pOHBA=4-羥基苯甲酸；Va=4-羥基-3-甲氧基-苯甲酸；BA=苯甲酸；GA=沒食子酸

Note：a. chemical compound for contrasting and identification with control substance；b. chemical compound reported for the first time in Guizhi decoction；pOHBA=4-hydroxybenzoic acid；Va=4-hydroxy-3-methoxy- benzoic acid；BA=benzoic acid；GA=gallic acid

圖3 氧化芍藥苷亞硫酸酯可能的質(zhì)譜裂解途徑Fig 3 Possible MS cleavage pathway of paeoniflorin sulfuric acid ester

2.6.2 化合物3(tR=9.59 min)的結(jié)構(gòu)分析：在負離子模式下，一級質(zhì)譜圖給出準分子離子峰m/z589.124 1([M-H]-)，預(yù)測分子式為C24H30O15S。二級質(zhì)譜圖中可見碎片離子峰(m/z)421.084 4[M-H-Va]-、375.075 0[M-H-Va-HCOOH]-、259.029 7[M-H-Va-Glc]-和213.025 1[M-H-HCOOH-Va-Glc]-(Va=4-羥基-3-甲氧基-苯甲酸)。以上信息符合牡丹皮苷E亞硫酸酯的裂解規(guī)律，并與文獻[11]報道數(shù)據(jù)基本一致。因此，推測3號峰為牡丹皮苷E亞硫酸酯。

2.6.3 化合物4(tR=11.20 min)的結(jié)構(gòu)分析：在負離子模式下，一級質(zhì)譜圖給出準分子離子峰為m/z705.172 2([M-H]-)，預(yù)測分子式為C29H38O18S。二級質(zhì)譜圖中可見碎片離子峰(m/z)583.132 2[M-H-BA]-、543.116 3[M-H-Glc]-、537.128 9[M-H-BA-HCOOH]-、497.128 9[M-H-Glc-HCOOH]-、421.080 0[M-H-BA-Glc]-、381.066 0[M-H-2Glc]-、259.027 1[M-H-BA-2Glc]-和213.024 1[M-H-BA-HCOOH-2Glc]-(BA=苯甲酸)。以上信息符合異麥芽糖芍藥苷亞硫酸酯的裂解規(guī)律，并與文獻[11]報道數(shù)據(jù)基本一致。因此，推測4號峰為異麥芽糖芍藥苷亞硫酸酯。

2.6.4 化合物8(tR=15.30 min)的結(jié)構(gòu)分析：在負離子模式下，一級質(zhì)譜圖給出m/z525.162 2([M+HCOO]-)，預(yù)測分子式為C24H30O13。提取該離子流圖，發(fā)現(xiàn)與10、12、14和22號峰分子量相同。二級質(zhì)譜圖中可見碎片離子峰(m/z)495.157 0[M-H-HCHO]-、363.104 5[M-H-Glc]-、329.084 4[Glc+BA-H]-、327.110 8[M-H-HCHO-BA]-和167.039 1[M-H-HCHO-BA-Glc]-。以上信息符合牡丹皮苷E的裂解規(guī)律，并與文獻[11]報道數(shù)據(jù)基本一致。因此，推測8號峰為牡丹皮苷E。

2.6.5 化合物13(tR=26.42 min)的結(jié)構(gòu)分析：在負離子模式下，一級質(zhì)譜圖給出m/z495.154 7([M-H]-)，預(yù)測分子式為C23H28O12。二級質(zhì)譜產(chǎn)生碎片離子峰m/z465.145 4[M-H-HCHO]-。以上信息符合鄰氧化芍藥苷的裂解規(guī)律，并與文獻[11]報道數(shù)據(jù)基本一致。因此，推測13號峰為鄰氧化芍藥苷。

2.6.6 化合物14(tR=32.90 min)的結(jié)構(gòu)分析：在負離子模式下，一級質(zhì)譜圖給出m/z525.162 1([M+HCOO]-)，預(yù)測分子式為C23H28O11。提取該離子流圖，發(fā)現(xiàn)與8、10、12和22號峰分子量相同。二級質(zhì)譜圖中可見碎片離子峰(m/z)479.158 1[M-H]-、449.143 6[M-H-HCHO]-、357.121 9[M-H-BA]-、327.110 6[M-H-HCHO-BA]-、283.082 8[BA+Glc-H]-和195.059 1[M-H-BA-Glc]-。以上信息符合芍藥內(nèi)酯苷R1的裂解規(guī)律，并與文獻[11]報道數(shù)據(jù)基本一致。因此，推測14號峰為芍藥內(nèi)酯苷R1。

2.6.7 化合物16(tR=34.20 min)的結(jié)構(gòu)分析：在負離子模式下，一級質(zhì)譜圖給出m/z549.163 4([M-H]-)，預(yù)測分子式為C26H30O13。二級質(zhì)譜圖中可見碎片離子峰(m/z)417.121 9[M-H-Apiosyl]-、297.073 2[Apiosyl+Glc-H]-和255.065 4[M-H-Apiosyl-Glc]-(Apiosyl=芹糖)。以上信息符合甘草苷元4′-O-芹糖-O-葡萄糖苷的裂解規(guī)律，并與文獻[12]報道數(shù)據(jù)基本一致。因此，推測16號峰為甘草苷元4′-O-芹糖-O-葡萄糖苷。

2.6.8 化合物19(tR=45.68 min)的結(jié)構(gòu)分析：在負離子模式下，一級質(zhì)譜圖給出m/z631.167 6([M-H]-)，預(yù)測分子式為C30H32O15。提取該離子，發(fā)現(xiàn)與17號峰有相同分子量。二級質(zhì)譜圖中可見碎片離子峰(m/z)465.142 1[M-H-BA-CO2]-、313.056 7[GA+Glc-H-H2O]-(BA=苯甲酸，GA=沒食子酸)。以上信息符合沒食子酰芍藥苷的裂解規(guī)律，并與文獻[13-14]報道數(shù)據(jù)基本一致。因此，推測19號峰為沒食子酰芍藥苷。

2.6.9 化合物22(tR=48.44 min)的結(jié)構(gòu)分析：在負離子模式下，一級質(zhì)譜圖給出m/z525.164 8([M+HCOO]-)，預(yù)測分子式為C23H28O11。提取該離子流圖，發(fā)現(xiàn)與8、10、12和14號峰分子量相同。二級質(zhì)譜圖中可見碎片離子峰(m/z)479.157 6[M-H]-、357.121 5[M-H-BA]-和283.080 6[BA+Glc-H2O-H]-(BA=苯甲酸)。以上信息符合異芍藥苷的裂解規(guī)律，并與文獻[11]報道數(shù)據(jù)基本一致。因此，推測22號峰為異芍藥苷。

2.6.10 化合物23(tR=49.95 min)的結(jié)構(gòu)分析：在正離子模式下，一級質(zhì)譜圖給出m/z149.025 2([M+H]+)，預(yù)測分子式為C9H8O3。二級質(zhì)譜圖中可見碎片離子峰(m/z)121.030 1[M+H-CO]+、108.0497[M+H-CO]+和91.002 3[M+H-C2O-H2O]+。以上信息符合2-羥基桂皮醛的裂解規(guī)律，并與文獻[15]報道數(shù)據(jù)基本一致。因此，推測23號峰為2-羥基桂皮醛。

2.6.11 化合物33(tR=76.34 min)的結(jié)構(gòu)分析：在負離子模式下，一級質(zhì)譜圖給出821.402 7([M-H]-)，預(yù)測分子式為C42H62O16。提取該離子流圖，發(fā)現(xiàn)與46、47和48號峰的分子質(zhì)量相同。二級質(zhì)譜圖中可見碎片離子峰(m/z)759.388 2[M-H-H2O-CO2]-、645.368 9[M-H-Glucuronic acid]-、351.054 4[2Glucuronic acid-2H2O-H]-和289.058 5[2Glucuronic acid-3H2O-CO2]-。以上信息符合甘草皂苷H2或K2的裂解規(guī)律，且與48號峰二級質(zhì)譜相同，并與文獻[12]報道數(shù)據(jù)基本一致。因此，推測33號峰為甘草皂苷H2或K2。

2.6.12 化合物36(tR=82.08 min)的結(jié)構(gòu)分析：在負離子模式下，一級質(zhì)譜圖給出835.378 5([M-H]-)，預(yù)測分子式為C42H60O17。二級質(zhì)譜圖中可見碎片離子峰(m/z)791.385 2[M-H-CO2]-、659.337 9[M-H-Glucuronic acid]-、351.056 4[2Glucuronic acid-2H2O-H]-和289.053 9[2Glucuronic acid-3H2O-CO2]-。以上信息符合23-羥基甘草皂苷E2的裂解規(guī)律(見圖4)，并與文獻[12]報道數(shù)據(jù)基本一致。因此，推測36號峰為23-羥基甘草皂苷E2。

2.6.13 化合物38(tR=82.92 min)的結(jié)構(gòu)分析：在負離子模式下，一級質(zhì)譜圖給出879.407 6([M-H]-)，預(yù)測分子式為C44H64O18。二級質(zhì)譜圖中可見碎片離子峰(m/z)643.345 5[M-H-Glucuronic acid-Acetoxyl]-、423.328 8[M-H-2Glucuronic acid-Acetoxyl-CO2]-、351.057 3[2Glucuronic acid-H-2H2O]-和289.056 6[2Glucuronic acid-H-3H2O-CO2]-。以上信息符合22β-乙酰基甘草酸的裂解規(guī)律，并與文獻[12]報道數(shù)據(jù)基本一致。因此，推測38號峰為22β-乙?；什菟帷?/p>

2.6.14 化合物40(tR=91.18 min)的結(jié)構(gòu)分析：在負離子模式下，一級質(zhì)譜圖給出837.391 2([M-H]-)，預(yù)測分子式為C42H62O17。提取該離子流圖，發(fā)現(xiàn)與37、44和45號峰的分子質(zhì)量相同。二級質(zhì)譜圖中可見碎片離子峰(m/z)775.389 9[M-H-H2O-CO2]-、661.358 4[M-H-Glucuronic acid]-、485.328 7[M-H-2Glucuronic acid]-、351.057 5[2Glucuronic acid-2H2O-H]-和289.055 2[2Glucuronic acid-3H2O-CO2]-。以上信息符合甘草皂苷G2的裂解規(guī)律，且與37、44和46號峰二級質(zhì)譜圖基本一致，并與文獻[12]報道數(shù)據(jù)基本一致。因此，推測40號峰為甘草皂苷G2異構(gòu)體。

2.6.15 化合物41(tR=91.88 min)的結(jié)構(gòu)分析：在負離子模式下，一級質(zhì)譜圖給出819.384 3([M-H]-)，預(yù)測分子式為C42H60O16。提取該離子流圖，發(fā)現(xiàn)與43號峰的分子質(zhì)量相同。二級質(zhì)譜圖中可見碎片離子峰(m/z)757.378 6[M-H-H2O-CO2]-、643.353 2[M-H-Glucuronic acid]-、467.324 6[M-H-2Glucuronic acid]-、351.054 8[2Glucuronic acid-2H2O-H]-和289.056 8[2Glucuronic acid-3H2O-CO2-H]-。以上信息符合甘草皂苷E2的裂解規(guī)律，且與43號峰二級質(zhì)譜圖基本一致，并與文獻[12，16]報道數(shù)據(jù)基本一致。因此，推測41號峰為甘草皂苷E2。

2.6.16 化合物43(tR=92.79 min)的結(jié)構(gòu)分析：在負離子模式下，一級質(zhì)譜圖給出819.381 1([M-H]-)，預(yù)測分子式為C42H60O16。提取該離子流圖，發(fā)現(xiàn)與41號峰的分子質(zhì)量相同。二級質(zhì)譜圖中可見碎片離子峰(m/z)643.338 6[M-H-Glucuronic acid]-、351.055 9[2Glucuronic acid-2H2O-H]-和289.056 4[2Glucuronic acid-3H2O-CO2]-。以上信息與41號峰二級質(zhì)譜圖基本一致，并與文獻[12]報道數(shù)據(jù)基本一致。因此，推測43號峰為甘草皂苷E2異構(gòu)體。

2.6.17 化合物50(tR=103.68 min)的結(jié)構(gòu)分析：在負離子模式下，一級質(zhì)譜圖給出293.177 9([M-H]-)，預(yù)測分子式為C17H26O4。二級質(zhì)譜圖中可見碎片離子峰(m/z)249.182 7[M-H-C3H8]-、237.112 3[M-H-C4H9]-和221.156 7[M-H-C5H12]-。以上信息符合6-姜酚的裂解規(guī)律，并與文獻[17]報道的數(shù)據(jù)基本一致。因此，推測50號峰為6-姜酚。

圖4 23-羥基甘草皂苷E2可能的質(zhì)譜裂解途徑Fig 4 Possible MS cleavage pathway of 23-hydroxyglycyrrhizin E2

3 討論

本研究采用HPLC-ESI-IT-TOF-MSn技術(shù)對桂枝湯中所含的化學(xué)成分進行分析，通過質(zhì)譜中準分子離子峰和二級質(zhì)譜中碎片離子峰的信息，結(jié)合文獻數(shù)據(jù)及對照品質(zhì)譜信息，指認了桂枝湯中51種化合物，其中通過對照品確認的化合物有20種、桂枝湯中首次報道的化合物有20種。

桂枝湯臨床療效確切，使用歷史悠久，是中醫(yī)著名方劑，其發(fā)揮治療作用的物質(zhì)基礎(chǔ)在于其所含有的化學(xué)成分。雖然組成桂枝湯的桂枝、芍藥和甘草等單味藥的化學(xué)成分研究報道較多，但對作為中藥復(fù)方的桂枝湯的化學(xué)成分研究少有報道。通過HPLC-ESI-IT-TOF-MSn技術(shù)快速準確地對桂枝湯中主要化學(xué)成分進行分析，豐富了桂枝湯中化學(xué)成分的信息，為明確桂枝湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、探索桂枝湯的質(zhì)量控制方法提供了依據(jù)。

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