鄭 偉 許守平 龐 達

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率為22.9%，死亡率達13.7%[1]，乳腺癌嚴重影響患者生活質(zhì)量和心理健康。因此，尋找與乳腺癌致病相關的基因十分迫切。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一種轉(zhuǎn)錄本長度>200 nt，缺少開放性閱讀框，不能編碼蛋白質(zhì)的RNA[2]。Linc00152位于染色體2p11.2，長約828 bp。研究表明，高表達Linc00152的結直腸癌患者預后往往比較差，Linc00152在胃癌中高表達且與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉(zhuǎn)移、TNM分期呈正相關[3]，舌鱗狀細胞癌和肺癌中Linc00152高表達提示患者預后較差[4-5]，然而，Linc00152在乳腺癌中的研究報道較少。本文主要研究Linc00152在乳腺癌中的表達及預后關系，并探討Linc00152對乳腺癌生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺癌細胞系MDA-MB-231、胃癌細胞系SGC-7901、腎癌細胞系786-O(中科院上海細胞庫)；DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Invitrogen，Carlsbad，CA)；Ribo-Zero TM Gold試劑盒(Epicentre，Wisconsin，USA)；敲降Linc00152的慢病毒載體(上海吉凱基因公司)；Matrigel基質(zhì)膠、Transwell小室(上海Corning公司)；CCK-8試劑(上海碧云天公司)；Annexin-PE試劑盒(BD Biosciences，San Jose，CA)。

1.2 臨床樣本、RNA-seq和預后指標

選取哈醫(yī)大附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科未治療患者組織樣本33例，進行RNA測序(15例癌組織、18例正常乳腺組織)，后續(xù)采用50對癌組織和配對正常組織行qPCR驗證。使用Ribo-Zero TM Gold試劑盒除去核糖體RNA，Illumina的NEBNext?UltraTM定向構建RNA文庫，Illumina HiSeq 2500平臺進行測序。測序原始結果已經(jīng)上傳至GEO(GSE71651)?？偵嫫?OS)為從手術后算起一直到死亡的時間。無事件生存期(EFS)是從手術到發(fā)生任何復發(fā)或死亡的時間。無轉(zhuǎn)移生存期(MFS)為從手術時間開始，直到發(fā)生遠處復發(fā)的時間。

1.3 GEO和TCGA數(shù)據(jù)分析

從NCBI網(wǎng)站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載GEO數(shù)據(jù)集。TCGA下載Linc00152表達譜數(shù)據(jù)(https：//tcga-data.nci.nih.gov/)。計算Linc00152的表達與所有基因間的Pearson相關性，僅保留r≥0.6顯著相關的基因(P<0.05)進行分析。

1.4 細胞培養(yǎng)實驗

乳腺癌細胞系MDA-MB-231用含有10%胎牛血清和100單位/mL青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)。胃癌細胞系SGC-7901和腎癌細胞系786-O在含有10%胎牛血清和100單位/mL青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，37℃、含有5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，相關實驗均采用對數(shù)生長期的細胞。

1.5 Linc00152敲降和qRT-PCR

構建Linc00152的shRNA序列，導入慢病毒載體沉默Linc00152。shRNA序列分別為shR_1：5′-TGTGGACTCTGAGGCCTCTGCATTT-3′和shR_2：5′-TCTATGTGTCTTAATCCCTTGTCC T-3′。嘌呤霉素篩選Linc00152 shRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，進行qRT-PCR(用于檢測Linc00152的敲降效率)，Linc00152 PCR引物特異性序列為5′-CTGGATGGTCGCTGCTTTTT-3′(正向)和5′-GATCTGAAGACAGGCACGGG-3′(反向)；GAPDH為5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′(正向)和5′-GGATCTCGCTCCTGGAAGATG-3′(反向)。GAPDH作為內(nèi)參，通過CT(2-ΔΔCT)方法分析Linc00152相對水平。

1.6 細胞增殖、遷移和侵襲實驗

CCK-8法檢測細胞增殖能力：將2×103個細胞接種到96孔板，于24 h、48 h和72 h評估細胞增殖情況。每孔加入20 μL WST-8試劑，孵育2 h，酶標儀測450 nm處吸光度。細胞遷移能力測定：MDA-MB-231細胞接種到Transwell培養(yǎng)板的上室，含有20%FBS的L-15培養(yǎng)基置于下室。細胞侵襲能力測定：用基質(zhì)膠溶液涂布Transwell腔室，MDA-MB-231細胞接種到通孔上腔室，含有20%FBS(600 μL)的L-15培養(yǎng)基加入下腔室。孵育48 h，滲透至膜下表面的細胞，用4%多聚甲醛固定30 min，結晶紫染色30 min，隨機選擇6個區(qū)進行細胞計數(shù)以測定細胞遷移和侵襲性。以上所有實驗均重復三次。

1.7 流式細胞術

采用Annexin-PE試劑盒進行細胞凋亡檢測。常規(guī)消化細胞，冷PBS洗兩次，緩沖液吹勻。將100 μL細胞溶液(1×105個細胞)轉(zhuǎn)移到5 mL的培養(yǎng)管中，加入5 μL的V-PE和5 μL的7-AAD。充分混勻，25℃恒溫箱中孵育15 min。每管加入400 μL的緩沖液，F(xiàn)ACScan儀器行細胞凋亡分析，實驗重復三次。

1.8 統(tǒng)計分析

使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗分析和方差分析，多重比較使用LSD-t檢驗，相關性分析使用Pearson相關性分析，生存資料利用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗進行分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Linc00152在乳腺癌組織中表達情況

通過對33例乳腺樣本(癌組織15例、正常乳腺組織18例)進行RNA-Seq分析，結果表明Linc00152在癌組織中表達高于正常組織(圖1A)。為證實本研究結果，對TCGA(n=837)和GEO(n=1215)(GSE20685，GSE12763，GSE21422，GSE10810，GSE7904，GSE29431，GSE42568，GSE10780，GSE48390和GSE21653)數(shù)據(jù)進行分析，結果表明，在乳腺癌組織中Linc00152的表達較正常乳腺要高(圖1B)。后續(xù)通過對50例配對乳腺癌組織和正常組織進行qPCR再次驗證，發(fā)現(xiàn)Linc00152在癌組織中的表達顯著高于正常組織(P<0.001)(圖1C)。

圖1 Linc00152在乳腺癌中表達情況Figure 1 Expression of Linc00152 in breast cancer tissues and adjacent tissuesNote：(A)Hierarchical clustering of differentially expressed genes in breast cancer relative to normal tissues(N=33)；(B)Hierarchical clustering of differentially expressed genes in breast cancer relative to normal tissue in the TCGA cohort；(C)The expression of Linc00152 in 50 paired breast cancer and non-cancer tissues.The red columns indicate the high level of linc00152 expression in cancer tissues.*** P<0.001，when compared to the normal tissues.

2.2 Linc00152與腫瘤惡性程度的相關性

分析TCGA數(shù)據(jù)，Linc00152在HER2型患者中表達顯著高于其他類型乳腺癌(P<0.0001)(圖2A)。通過亞層分析，Linc00152高表達于ER陰性患者、PR陰性患者和HER2陽性患者(圖2B，2C和2D)。通過可視化分析，Linc00152在Luminal A型表達較低，而在其他亞型中表達較高(圖2E)。分析CCLE乳腺癌細胞系數(shù)據(jù)，三陰性和HER2型細胞系Linc00152的表達高于Luminal型細胞系(圖2F)。分析TCGA泛癌數(shù)據(jù)顯示，膀胱癌、宮頸鱗狀細胞癌、子宮頸腺癌、結腸腺癌、腎透明細胞癌、腎乳頭狀細胞癌、肝細胞癌、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、胃腺癌、甲狀腺癌和子宮內(nèi)膜癌中Linc00152的表達水平均高于癌旁組織(圖2G)。膀胱癌和腎透明細胞癌患者中，組織分級和TNM分期越高，Linc00152表達也越高(圖2H和2I)。

2.3 Linc00152對患者的OS、EFS、MFS的影響

分析TCGA和GEO數(shù)據(jù)，右腎透明細胞癌、肺腺癌和低級別膠質(zhì)瘤患者中，Linc00152高表達者的OS差(P<0.001；P=0.033；P<0.001)(圖3A，3B和3C)。通過GEO數(shù)據(jù)分析，乳腺癌患者中Linc00152表達越高，EFS和MFS越差(P<0.001；P<0.01)(圖3D，3E)。對19個數(shù)據(jù)集進行Meta分析，Linc00152高表達患者EFS和MFS也越差(P<0.001，HR=1.28；P<0.001，HR=1.35)(圖3F和3G)。

2.4 不同腫瘤細胞系中Linc00152的敲降效率

對慢病毒載體穩(wěn)轉(zhuǎn)后的乳腺癌細胞系(MDA-MB-231)、胃癌細胞系(SGC-7901)和腎癌細胞系(786-O)進行qRT-PCR檢測，與親本細胞相比，Linc00152的表達在轉(zhuǎn)染細胞中明顯降低(P<0.05)。

2.5 Linc00152能促進腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲以及能抑制細胞凋亡

用敲降后的乳腺癌細胞系(MDA-MB-231)、胃癌細胞系(SGC-7901)和腎癌細胞系(786-O)進行相關功能實驗研究。CCK-8測定和克隆形成實驗表明，敲降Linc00152后，三種癌細胞的增殖和克隆形成降低(P<0.05)(圖5A和5B)。通過流式細胞技術分析，敲降Linc00152后，三種癌細胞凋亡增加(P<0.05)(圖5C)。在MDA-MB-231細胞系中敲低Linc00152，遷移和侵襲都降低(P<0.05)(圖5D)。

圖2 Linc00152與腫瘤惡性程度密切相關Figure 2 The correlation of linc00152 with progressive characteristics of breast cancerNote：(A)The expression of linc00152 in different molecular subtypes of breast cancer in TCGA；(B)The expression of linc00152 in ER-positive and -negative breast cancer in TCGA；(C)The expression of linc00152 in PR-positive and-negative breast cancer in TCGA；(D)The expression of linc00152 in HER2-positive and -negative breast cancer in TCGA；(E)The visualization of linc00152 in 33 samples with different subtypes by RNA-Seq data；(F)The expression of linc00152 in different breast cancer cell lines in CCLE；(G)The expression of linc00152 in different types of cancer in TCGA；(H)The expression of linc00152 in different grades of cancer in TCGA；(I)The expression of linc00152 in different TNM stages of cancer in TCGA.The level of linc00152 expression was measured by log2 FPKM.*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，when compared to the corresponding group.

圖3 Linc00152影響腫瘤患者預后Figure 3 High expression of linc00152 leads to a worse prognosis in pan-cancer patientsNote：(A-C)The high expression of linc00152 was correlated with a worse overall prognosis in patients with renal clear cell carcinoma(A)or lung adenocarcinoma(B)or lower grade glioma(C)in TCGA；D-E，The high expression of linc00152 was correlated with a worse any event-free survival(D)and metastasis-free survival(E)in 12 datasets with 5802 breast patients in GEO；G-H，Meta-analyses for the relationship between the expression of linc00152 in breast cancer patients and any event-free survival(F，N=1830)or metastasis-free survival(G，N=1130)in GEO.

圖4 不同惡性腫瘤細胞中Linc00152的敲降效率Figure 4 Linc00152 shRNA significantly decreased the expression of linc00152 in MDA-MB-231，SGC-7901 and 786-O cellsNote：**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，when compared to the parent group.

3 討論

本研究通過檢測乳腺癌組織、癌旁組織、正常組織樣本中Linc00152的表達，首次證明Linc00152在癌組織和預后較差的亞型中高表達。通過TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫分析，同樣證實乳腺癌組織中Linc00152表達較高，通過亞層分析，發(fā)現(xiàn)在ER陰性、PR陰性、HER2陽性及三陰性患者中其表達高，且與不良預后相關。除此之外，本研究進一步分析其它惡性腫瘤(胃癌、腎透明細胞癌、肺癌等)中Linc00152的表達與預后的關系，同樣證實在癌組織中Linc00152表達較正常組織高，與不良預后相關。所有結果均表明癌組織中高表達Linc00152，提示它可能是一個促癌基因。后續(xù)進行CCK-8增殖、Transwell遷移侵襲及流式凋亡實驗，發(fā)現(xiàn)敲降Linc00152后，腫瘤細胞的增殖減少、凋亡增加，遷移和侵襲能力也降低。因此，Linc00152可能具有致癌作用。

相關研究表明，Linc00152可促進腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲，影響細胞有絲分裂[6-7]，與本研究結果一致。Linc00152在不同惡性腫瘤中可能以不同分子機制發(fā)揮作用，通過原位雜交實驗，發(fā)現(xiàn)Linc00152在結直腸癌中定位于細胞質(zhì)。因此，它可能通過與蛋白質(zhì)編碼基因mRNA結合從而干擾蛋白質(zhì)的合成，引發(fā)細胞生物學功能改變，導致細胞癌變[8]；在腎癌中，Linc00152通過干擾miR-205來發(fā)揮作用[9]；在膽囊癌中，它通過Linc00152/miR-138/HIF-1α信號通路軸促進腫瘤轉(zhuǎn)移和EMT[10]；在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，Linc00152/miR-103a-3p/FEZF1/CDC25A軸影響癌細胞增殖、遷移和侵襲[6]；同樣，其他研究表明，Linc00152可能通過沉默p15和p21的基因表達或激活PI3K途徑來促進胃癌進展[11]；在結直腸癌中，低氧/miR-367c-3p/Linc00152軸調(diào)控Bcl-2、bax分子的表達，進而影響癌細胞增殖和凋亡[12]。

圖5 Linc00152促進腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲和抑制腫瘤細胞凋亡Figure 5 Linc00152 promoted cell proliferation，migration and invasion，and increased cell apoptosis in cancer cellsNote：(A)The CCK-8 assay showed that the knockdown Linc00152 could inhibit the proliferation of MDA-MB-231，SGC7901 and 786-O cells；(B)The clonogenic assay showed that the knockdown Linc00152 inhibited the clone formation of MDA-MB-231，SGC7901，and 786-O cancer cells；(C)Knockdown Linc00152 increased the apoptosis of MDA-MB-231，SGC7901，and 786-O cells by flow cytometry；(D)Knockdown Linc00152 decreased migration and invasion in MDA-MB-231 cells.Each assay was performed in triplicate.*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，when compared to the Scr group.

綜上所述，本研究證實Linc00152在惡性腫瘤中具有致癌作用，且與患者不良預后有關。Linc00152在不同的腫瘤中借助不同的通路來發(fā)揮作用，然而，在乳腺癌中的具體作用機制仍然不清楚。那么，它是否也通過相關的microRNA發(fā)揮作用，這一科學問題尚需更進一步的研究證實。

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