李梅青 周 鑫 王增蕾

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院1，合肥 230036)

(合肥農(nóng)產(chǎn)品加工研究院2，合肥 230036)

鳳丹(PaeoniaostiiT.HongetJ.X.Zhang)，因主要產(chǎn)于安徽省銅陵鳳凰山和南陵西山一帶，其具有根粗、粉足、肉厚、木心細(xì)、久貯不變質(zhì)且根皮含丹皮酚等多種生物活性物質(zhì)的特點(diǎn)，被稱為鳳丹。2011年3月，國(guó)家衛(wèi)生部批準(zhǔn)牡丹籽油為新資源食品。目前，能榨油的牡丹籽只有2種：鳳丹、紫斑牡丹。前期對(duì)牡丹籽油的研究，大多集中在產(chǎn)自洛陽(yáng)、菏澤的一些牡丹品種，研究主要為脂肪酸組成、抗氧化、抑菌等。研究發(fā)現(xiàn)，采用GC/MS分析牡丹籽油，不飽和脂肪酸占總脂肪酸含量的86.52%～92.00%，其中亞麻酸占37.4%～54.81%，亞油酸占23.26%～33.34%[2-5]。亞麻酸及亞油酸具有降血脂[6-7]、預(yù)防心血管疾病[8-9]、抗腫瘤[10]等多種重要生理功能，是營(yíng)養(yǎng)和保健功能的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。近期試驗(yàn)研究顯示[11]膳食補(bǔ)充食品功能性脂質(zhì)多不飽和脂肪酸能夠預(yù)防和改善多種炎癥和腫瘤疾病，并且對(duì)正常細(xì)胞和組織幾乎不會(huì)造成損傷。

肝癌是病死率最高的惡性腫瘤之一。我國(guó)每年約有38.3萬(wàn)人死于肝癌，占全球肝癌死亡病例數(shù)的51%[12-13]，因此有效預(yù)防肝癌的發(fā)生具有重大意義。由于不同類型以及同類型不同結(jié)構(gòu)的不飽和脂肪酸，對(duì)腫瘤的作用差異較大，有的有抑制作用，有的甚至作用相反；濃度的高低也會(huì)影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[14-16]。鳳丹籽油對(duì)腫瘤細(xì)胞，尤其是肝癌細(xì)胞是否具有抑制作用的研究鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)采用GC/MS分析鳳丹籽油脂肪酸組成，質(zhì)譜庫(kù)檢索并結(jié)合保留指數(shù)驗(yàn)證，旨在更加精準(zhǔn)地確定其脂肪酸組分；通過(guò)體外細(xì)胞試驗(yàn)方法，研究鳳丹籽油對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖抑制作用，為鳳丹籽油作為營(yíng)養(yǎng)及保健食品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

鳳丹籽：產(chǎn)自安徽銅陵，采收于2015年，由北京同仁堂安徽中藥材公司提供，晾干后經(jīng)除雜挑選于4 ℃低溫貯藏，采用索氏抽提獲得鳳丹籽油；正己烷(色譜純)：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；正構(gòu)烷烴混標(biāo)(C7—C40)：Sigma Fluka公司；HepG2細(xì)胞株：美國(guó)菌種保藏庫(kù)(ATCC)；胎牛血清：Biological Industries公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、雙抗(青鏈霉素混合液)：HyClone公司；CCK-8細(xì)胞增殖與細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒：上海貝博生物公司；5-氟尿嘧啶(5-FU)：上海瑞永生物科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO)：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC/MS-QP2010型氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀：日本島津公司；iMark酶標(biāo)儀：美國(guó)Bio-Rad公司；SC-2556低速離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；IX51倒置顯微鏡：日本Olympus公司；3111二氧化碳培養(yǎng)箱：賽默飛世爾科技有限公司；SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)：上海鼎科科學(xué)儀器有限公司。

1.3 GC/MS分析

1.3.1 甲酯化處理

取鳳丹籽油0.2 g于10 mL刻度試管中，加乙醚/石油醚混合溶劑(體積比為1∶1)2 mL使其溶解，再加入濃度為0.4 mol/L的氫氧化鉀-甲醇溶液1 mL，振搖1 min后靜置15 min，加蒸餾水至刻度，靜置使其分層，移出上層液體并加入無(wú)水硫酸鈉靜置后稀釋50倍，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后備用。

1.3.2 GC/MS分析條件

色譜條件：色譜柱：HP-5(30 m×0.25 mm×0.25 um)彈性石英毛細(xì)管色譜柱；載氣：純度為99.999%的高純氦氣；柱流量：1 mL/min；柱溫程序：初始溫度100 ℃，保持3 min，以7 ℃/min的速度升至190 ℃，保持15 min；再以10 ℃/min的速度升至260 ℃，保持8 min；分流比20∶1；進(jìn)樣口溫度260 ℃，接口溫度260 ℃；進(jìn)樣量1.0 μL。

質(zhì)譜條件：電子源(EI)電離能源：70 eV；EM電壓：1 788 V；離子源溫度：230 ℃；四級(jí)桿溫度：150 ℃；質(zhì)量掃描范圍：27～600 amu。

1.3.3 KI值測(cè)定[17]

取正構(gòu)烷烴混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品按照試驗(yàn)條件分析，記錄每個(gè)正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品出峰的保留時(shí)間，采用保留指數(shù)的線性升溫公式：KI=100n+100[(tx-tn)/(tn+1-tn)]，計(jì)算各揮發(fā)性組分的KI值，式中tx、tn和tn+1(tn

1.4 體外抑制HepG2活性

1.4.1 供試樣品的制備

完全培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗(100U/mL青霉素+100ug/mL鏈霉素)。

試驗(yàn)用鳳丹籽油：分別取適量鳳丹籽油，加入等量的DMSO溶解，用完全培養(yǎng)基稀釋成對(duì)應(yīng)濃度，并使DMSO終濃度均為1%。5-FU：精確稱取適量的5-FU粉末，用完全培養(yǎng)基溶解，得到50μg/mL溶液。均采用0.22μm細(xì)胞專用微孔濾膜過(guò)濾除菌。

1.4.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃和5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HepG2細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中呈單層貼壁生長(zhǎng)，1～2d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4.3CCK-8法測(cè)定鳳丹籽油抑制HepG2細(xì)胞增殖活性

本試驗(yàn)采用CCK-8法是一種新的檢測(cè)細(xì)胞代謝活性方法，比常用的MTT法靈敏度高，且試劑本身穩(wěn)定性高，試驗(yàn)結(jié)果更穩(wěn)定可靠[18]。

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL接種至96孔板，每孔100μL，待細(xì)胞完全貼壁后，小心吸出培養(yǎng)液，分別加入濃度為10、5、1、0.5、0.1μL/mL的試驗(yàn)用鳳丹籽油，并設(shè)有5-FU陽(yáng)性對(duì)照組、正常細(xì)胞對(duì)照組、溶劑對(duì)照組(1%DMSO)、空白組(無(wú)細(xì)胞，只加培養(yǎng)液)、調(diào)零組(加不同濃度含藥培養(yǎng)液)，每組各濃度均設(shè)6個(gè)復(fù)孔。加藥后置于CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72h后，加入10μLCCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)1.5h，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)吸光度(OD值)，采用雙波長(zhǎng)測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)450nm，參比波長(zhǎng)655nm。根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率(IR)。

IR=[1-(給藥組OD值-調(diào)零組OD值)/(對(duì)照組OD值-凋零組OD值)]×100%

1.4.4 鳳丹籽油對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響

用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，然后稀釋成6×105、3×105、1.5×105、7.5×104、3.75×104個(gè)/mL接種細(xì)胞，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。接種后培養(yǎng)4h使細(xì)胞貼壁，然后加CCK-8試劑培養(yǎng)1.5h后測(cè)定OD值，制作出以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)(x軸)，OD值為縱坐標(biāo)(y軸)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。參照方法1.4.3，將得到的吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出相應(yīng)的細(xì)胞數(shù)，即可繪出細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

1.4.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 鳳丹籽油脂肪酸組成及含量分析

對(duì)圖1中的各峰的質(zhì)譜圖進(jìn)行NIST2011質(zhì)譜庫(kù)檢索，選取相似度高的前10個(gè)可能物質(zhì)，分別通過(guò)http://webbook.nist.gov/chemistry/搜索文獻(xiàn)(HP-5柱)得到其保留指數(shù)KI值的文獻(xiàn)值，初步確定化學(xué)成分。保留指數(shù)KI文獻(xiàn)結(jié)果與保留指數(shù)KI計(jì)算結(jié)果相比較，以質(zhì)譜匹配度和保留指數(shù)KI值接近度最高的化學(xué)結(jié)構(gòu)為最佳鑒定結(jié)果，同時(shí)運(yùn)用峰面積歸一化法得各揮發(fā)性組分的相對(duì)百分含量，結(jié)果見表1。

圖1 鳳丹籽油脂肪酸甲酯的總離子流色譜圖

從表1可以看出，鳳丹籽油經(jīng)GC/MS分析后共鑒定出10種化合物。飽和脂肪酸有5種，占8.416%，以棕櫚酸(6.137%)、硬脂酸(2.023%)為主；不飽和脂肪酸有4種，占91.494%，其中單不飽和脂肪酸相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，占0.376%，多不飽和脂肪酸相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)91.118%(亞油酸30.424%、α-亞麻酸60.694%)；除主要脂肪酸外，還分析出了少量的奇數(shù)碳的脂肪酸(十七酸)和酚類。不飽和脂肪酸及亞油酸含量與錢明月等(89%、33.34%)、毛程鑫等(92%、27.58%)和李喜悅

等(>90%、28.0%)的報(bào)道接近，而亞麻酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于毛程鑫等(40.50%)、李喜悅等(44.7%)、王蕓等(37.84%)所報(bào)道的，與錢明月等(54.81%)接近。由此可看出，除了品種、氣候條件和生長(zhǎng)地域的不同對(duì)牡丹籽油脂肪酸組分存在著一定的影響，樣品前處理方式和測(cè)定方法等因素也是影響鑒定結(jié)果差異的主要原因。

常見食用植物油中不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)：橄欖油90.10%、茶油90.10%、葵花籽油86.10%、花生油77.30%、大豆油82.00%、菜籽油80.90%[19]。由此可見，鳳丹籽油的不飽和脂肪酸含量與橄欖油、茶油相當(dāng)甚至超過(guò)，遠(yuǎn)高于其他植物油含量。

表2顯示了鳳丹籽油分別作用24、48、72h對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。由表2可知，模型組與正常細(xì)胞對(duì)照組OD值差異不顯著(P>0.05)，說(shuō)明1%DMSO對(duì)HepG2細(xì)胞無(wú)抑制作用，因此可排除DMSO作為溶劑對(duì)考察細(xì)胞增殖效果的影響。除低劑量0.1μL/mL外，其他鳳丹籽油劑量組與溶劑對(duì)照組OD值均有顯著差異，表明不同劑量鳳丹籽油對(duì)HepG2細(xì)胞均有抑制作用，但與作為抗癌藥物的5-FU相比，其抑制作用均弱于5-FU。

表1 鳳丹籽油脂肪酸組分及相對(duì)含量

表2 鳳丹籽油對(duì)HepG2細(xì)胞OD值的影響

注：*.與模型組相比，有顯著性差異(P<0.05)；**.與模型組比較，有極顯著性差異(P<0.01)。#.與陽(yáng)性對(duì)照組比較，有顯著性差異(P<0.05)；##.與陽(yáng)性對(duì)照組比較，有極顯著性差異(P<0.01)。

2.2 鳳丹籽油體外抑制腫瘤細(xì)胞活性

從圖2可以看出，隨著加入鳳丹籽油劑量的增加，對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用也增加，尤其是10μL/mL劑量組的抑制率急劇上升，以作用72h為例，10μL/mL劑量組的抑制率是0.1μL/mL劑量組的13.66倍，呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)。且隨著鳳丹籽油對(duì)HepG2細(xì)胞作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其抑制率均有上升，以10μL/mL劑量組為例，作用72h的抑制率是24h抑制率的3.71倍，也表現(xiàn)出一定的時(shí)間效應(yīng)。運(yùn)用改良寇式法[20]計(jì)算鳳丹籽油作用72h的IC50為6.05μL/mL。

圖2 鳳丹籽油對(duì)HepG2細(xì)胞抑制率的影響

2.3 鳳丹籽油對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響

生長(zhǎng)曲線體現(xiàn)了細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中的增殖動(dòng)態(tài)變化。從圖3可以清晰地看出，鳳丹籽油對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響。正常細(xì)胞對(duì)照組的細(xì)胞貼壁后生長(zhǎng)迅速，細(xì)胞數(shù)量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)顯著上升，而鳳丹籽油作用后的細(xì)胞增殖速度均低于正常細(xì)胞。隨著鳳丹籽油劑量的增加，HepG2細(xì)胞增長(zhǎng)越緩慢，在72h，10、5μL/mL的鳳丹籽油作用HepG2細(xì)胞出現(xiàn)負(fù)增殖，表現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng)。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，HepG2細(xì)胞增殖降低，以10μL/mL劑量組為例，作用72h的細(xì)胞數(shù)量是48h的0.45倍，出現(xiàn)負(fù)增殖，呈現(xiàn)了一定的時(shí)間效應(yīng)。

圖3 鳳丹籽油對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響

前期資料表明，n3和n6多不飽和脂肪酸的不同配比對(duì)腫瘤抑制效果不同[21]，所以調(diào)節(jié)鳳丹籽油的n3/n6比提高其腫瘤抑制效果，值得進(jìn)一步關(guān)注。本試驗(yàn)結(jié)論僅限于體外細(xì)胞試驗(yàn)，其生物學(xué)效應(yīng)尚需開展動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)行考證。

3 結(jié)論

利用GC/MS分離檢測(cè)，采用峰面積歸一化法估算各組分相對(duì)含量，并采用MS譜庫(kù)檢索結(jié)合保留指數(shù)對(duì)鳳丹籽油組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定可知，鳳丹籽油不飽和脂肪酸占91.494%，含量最為豐富的物質(zhì)為α-亞麻酸(60.694%)，其次為亞油酸(30.424%)。從抑制率、生長(zhǎng)曲線可知，鳳丹籽油對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)增殖有效地抑制，且抑制效果呈現(xiàn)一定的時(shí)間、劑量效應(yīng)。

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