朱明釗 張淑江 張 慧 章時(shí)蕃 李 菲 王曉武 武 劍 李國(guó)亮魏云曉 岳麗昕 孫日飛

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

大白菜根腫病是由蕓薹屬根腫菌（Plasmodiophora brassicaeWoron.）侵染引起的專性寄生的世界性土傳病害，主要危害十字花科作物，最早發(fā)現(xiàn)于地中海西岸和歐洲南部，現(xiàn)在許多國(guó)家都有發(fā)生（楊永林，1990）。根腫菌的休眠孢子可以在土壤中存活7 a以上（Karling，1968），因此，田間一旦受到污染，將長(zhǎng)期不再適合十字花科作物的種植。通過(guò)田間管理和生物化學(xué)防治的方法不能從根本上防治根腫病，選育抗根腫病的大白菜新品種是最經(jīng)濟(jì)有效的方法（Kuginuki et al.，1999）。

迄今為止，在大白菜中至少有12個(gè)抗根腫病基因被定位出來(lái)，其中Crr2位于A01連鎖群（Suwabe et al.，2003），CRc位 于 A02連 鎖 群（Sakamoto et al.，2008），CRa、CRb、CRbkato、CRk、Crr3、PbBa3.1、PbBa3.3和Rcr1都位于A03連鎖群（Hirai et al.，2004；Piao et al.，2004；Sakamoto et al.，2008；Matsumoto et al.，2012；Chen et al.，2013；Kato et al.，2013；Chu et al.，2014），Crr4位于 A06連鎖群（Suwabe et al.，2006），Crr1位于A08連鎖群（Suwabe et al.，2003）；另外，Gao等（2014）將1個(gè)抗病基因定位到了與CRa相同的位置（Ueno et al.，2012），該基因可能與CRa是同一基因；王彤彤等（2012）將1個(gè)抗病基因定位到了A08連鎖群并證明了該基因與Crr1不在同一區(qū)域，是一個(gè)新的抗病基因。

以往的基因定位工作只能定位1個(gè)或2個(gè)抗病基因，而對(duì)根腫菌分化的眾多的生理小種，單個(gè)基因往往不起作用，因此，將多個(gè)抗病基因聚合到同一份材料當(dāng)中是提高材料抗病的廣泛性和耐久性的有效方法（Matsumoto et al.，2012；Hatakeyama et al.，2017）。本試驗(yàn)以根腫菌M01、M02和M03為病原菌菌源，對(duì)24份大白菜材料進(jìn)行接種鑒定和分子標(biāo)記鑒定，旨在篩選出抗多個(gè)根腫菌的抗源，并明確與之相關(guān)的抗病基因，以期為今后抗根腫病聚合育種工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試24份大白菜材料（表1）保存于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所白菜課題組，以感病大白菜作為對(duì)照。供試根腫菌M01、M02和M03分別采自遼寧沈陽(yáng)、云南昆明和河南鄭州，根腫病菌根置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 材料名稱及來(lái)源

1.2 接種方法

1.2.1 菌液的制備 2017年3月8日在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所實(shí)驗(yàn)樓406進(jìn)行，制備方法在Kawamura等（2017）的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，取20 g保存于-20 ℃冰箱的根腫病菌根，室溫下解凍后加入200 mL蒸餾水于攪拌器中攪碎，8層紗布過(guò)濾，濾液于4℃、4 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，用無(wú)菌水懸浮沉淀，用血球計(jì)數(shù)板將濃度調(diào)至2×107個(gè)·mL-1，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 接種 2017年3月在本所南圃場(chǎng)春化室進(jìn)行，采用浸根法（柴阿麗 等，2015）接種。3月2日在鋪有單層濾紙的培養(yǎng)皿中對(duì)大白菜種子進(jìn)行催芽，6 d后將根系浸入配制好的根腫菌懸浮液中，30 min后將幼苗栽入提前裝好基質(zhì)并灌透底水的50孔穴盤(pán)中，每穴1株，每處理6穴，3次重復(fù)。42 d后進(jìn)行病情調(diào)查。

1.3 病情調(diào)查

病 情 分 級(jí) 標(biāo) 準(zhǔn) 參 考 Kuginuki等（1999）、Suwabe等（2006）、Kato等（2013）的方法：0級(jí)，根部無(wú)腫大現(xiàn)象；1級(jí)，側(cè)根根部有少量小腫瘤；2級(jí)，側(cè)根根部有較大腫瘤或主根上有小腫瘤；3級(jí)，主根和側(cè)根都出現(xiàn)嚴(yán)重的腫大（圖1）。

病情指數(shù)計(jì)算及抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參考Zhang等（2015）的方法：抗病（R），病情指數(shù)≤26；感?。⊿），病情指數(shù)＞26。

病情指數(shù)=Σ（各病級(jí)株數(shù)×相應(yīng)級(jí)數(shù)）/（調(diào)查總株數(shù)×3）×100

圖1 根腫病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS軟件對(duì)調(diào)查結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析：① 針對(duì)每1份材料對(duì)3種根腫菌的抗性表現(xiàn)進(jìn)行方差分析；② 分別計(jì)算出24份材料對(duì)3種根腫菌病情指數(shù)的平均值，然后進(jìn)行方差分析。

1.5 分子鑒定

1.5.1 DNA的提取 采集24份大白菜材料的幼嫩葉片，采用改良CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法（Murray & Thompson，1980）提取單株DNA，用Nanodrop 2000分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度。

1.5.2 分子標(biāo)記檢測(cè) 對(duì)24份大白菜材料進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定，共用到22個(gè)標(biāo)記，涉及10個(gè)基因。其中，標(biāo)記HC352b-SCAR、SC2930-T-FW/-RV、SC2930-Q-FW/-RV、CRaim-T與 基 因CRa連 鎖（Hayashida et al.，2008；Matsumoto et al.，2012；Ueno et al.，2012），標(biāo)記 TCR05、TCR09、TCR79、TCR108、K-3與 基 因CRb連 鎖（Piao et al.，2004；Zhang et al.，2014；Chen et al.，2016）， 標(biāo)記KBrH129J18R與基因CRbkato連鎖（Kato et al.，2013）， 標(biāo) 記 B50-C9-FW/-RV、B50-6R-FW/-RV與 基 因CRc連 鎖（Matsumoto et al.，2012）， 標(biāo)記 HC688-4-FW/-6-RV、HC688-4-FW/-7-RV與基 因CRk連 鎖（Matsumoto et al.，2012）， 標(biāo) 記BRMS-088和BRMS-096分別與基因Crr1和Crr2連鎖（Suwabe et al.，2003），標(biāo)記OPC11-2S與基因Crr3連鎖（Saito et al.，2006），標(biāo)記M8、M9、M10與基因CR-A3連鎖（Gao et al.，2014），標(biāo)記BrID11683、BrID90269與1個(gè)尚未定位的基因連鎖（王彤彤 等，2012）。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系為10 μL：PCR mix 5 μL，1.0 μmol·L-1上下游引物各0.2 μL，50 ng·L-1模板 DNA 2 μL，ddH2O 補(bǔ)齊至10 μL。PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度≥600 bp的標(biāo)記利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度＜600 bp的標(biāo)記利用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種鑒定

從圖2可以看出，感病對(duì)照CK對(duì)3種根腫菌都表現(xiàn)感病，說(shuō)明本試驗(yàn)采用的接種方法準(zhǔn)確可靠。24份大白菜材料中，有10份抗病材料，14份感病材料。其中，材料CR004、CR007、CR013、CR015和CR016對(duì)3種根腫菌都表現(xiàn)抗病，材料CR012、CR014和CR018對(duì)根腫菌M01和M02表現(xiàn)抗病，材料CR021只對(duì)根腫菌M01表現(xiàn)抗病，材料CR023只對(duì)根腫菌M02表現(xiàn)抗病。3個(gè)根腫病小種對(duì)24份大白菜材料平均病情指數(shù)的單因素方差分析結(jié)果表明：根腫菌M01和M02在24份材料中的致病力差異不顯著，根腫菌M03在24份材料中的致病力與M01和M02差異顯著，從材料CR014、CR017和CR018的表現(xiàn)也可以看出，根腫菌M01和M02之間的致病力差異不顯著，而根腫菌M03的致病力與M01、M02差異顯著。

圖2 不同大白菜材料對(duì)3種根腫菌的抗性鑒定結(jié)果

表2 不同大白菜材料的根腫病抗性及對(duì)應(yīng)的抗性基因

2.2 分子標(biāo)記鑒定

鑒定結(jié)果表明，本試驗(yàn)用到的22個(gè)分子標(biāo)記中只有10個(gè)具有多態(tài)性，分別是SC2930-T-FW/-RV、SC2930-Q-FW/-RV、KBrH129J18R、B50-C9-FW/-RV、B50-6R-FW/-RV、HC688-4-FW/-6-RV、HC688-4-FW/-7-RV、BRMS-088、BRMS-096和OPC11-2S，共涉及7個(gè)基因，分別是CRa、CRbkato、CRc、CRk、Crr1、Crr2和Crr3。

由表2可以看出，感病材料中有的不含抗病基因，有的含有抗病基因CRk、Crr1或Crr2。材料CR012、CR014和CR018對(duì)根腫菌M01和M02表現(xiàn)出抗性，其中CR012含有基因抗病基因CRa和CRbkato，CR014和CR018含有抗病基因CRa、CRbkato和CRk； 材 料 CR004、CR007、CR013、CR015和CR016對(duì)根腫菌M01、M02和M03表現(xiàn)出抗性，其中CR004和CR007只含有抗病基因CRk，CR013含有抗病基因CRa、CRbkato、CRk和Crr3，CR015和CR016含有抗病基因CRa、CRbkato和Crr3；材料CR021只抗根腫菌M01且含有抗病基因Crr2和CRk，材料CR023只抗根腫菌M02且含有抗病基因CRc和CRk。

3 結(jié)論與討論

明確根腫菌各生理小種在我國(guó)不同地區(qū)的分布，對(duì)提高抗病品種選育的效率具有非常重要的意義。根腫菌存在生理小種的分化，目前已經(jīng)鑒定出的生理小種超過(guò)24個(gè)（孫保亞 等，2005）。我國(guó)主要的生理小種有2號(hào)、4號(hào)、7號(hào)、10號(hào)和11號(hào)，其中以4號(hào)生理小種為主（沈向群 等，2009；丁云花 等，2013）。彭沙莎等（2013）鑒定出湖南大白菜根腫菌生理小種有1號(hào)、4號(hào)、9號(hào)和13號(hào)；劉峰等（2013）鑒定出云南和西藏大白菜根腫菌生理小種有1號(hào)、2號(hào)、4號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、10號(hào)、11號(hào)和12號(hào)；李寧等（2015）鑒定出陜西太白縣根腫菌生理小種為7號(hào)。因此，明確抗源對(duì)不同生理小種或不同地區(qū)生理小種的抗性對(duì)育種工作十分重要。

分子標(biāo)記在輔助選擇育種、遺傳多樣分析和基因定位及克隆等方面的應(yīng)用具有十分明顯的優(yōu)越性（McCouch et al.，1997；Liu et al.，2013）。孫保亞等（2005）從國(guó)外引進(jìn)的大白菜品種中分離出48個(gè)抗根腫病大白菜自交系；樸鐘云等（2010）通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇的方法加速回交選育，培育出大白菜優(yōu)良自交系BJN3的9份抗根腫病近等基因系。Matsumoto等（2012）利用分子標(biāo)記輔助選擇和傳統(tǒng)育種相結(jié)合的方法實(shí)現(xiàn)了3個(gè)抗根腫病基因CRa、CRc和CRk的聚合，并證明了聚合之后作物的抗病能力有所加強(qiáng)。本試驗(yàn)中，抗病基因CRk、Crr1和Crr2也存在于感病材料中，筆者推測(cè)這3個(gè)基因?qū)Σ牧系目共⌒詻](méi)有貢獻(xiàn)。材料CR012、CR014和CR018對(duì)根腫菌M01和M02表現(xiàn)出抗性，其中CR012含有抗病基因CRa和CRbkato，CR014和CR018含有抗病基因CRa、CRbkato和CRk，由此推測(cè)材料對(duì)M01和M02的抗性可能與CRa或CRbkato有關(guān)，也可能與兩者都有關(guān)。材料CR013、CR015和CR016對(duì)根腫菌M01、M02和M03都表現(xiàn)出抗性，其中CR013含有抗病基因CRa、CRbkato、CRk和Crr3，CR015和CR016含有抗病基因CRa、CRbkato和Crr3，推測(cè)基因Crr3對(duì)M03具有特異抗性。材料CR023只抗根腫菌M02且含有抗病基因CRc和CRk，因此認(rèn)為基因CRc可能對(duì)M02具有特異抗性。CR004、CR007和CR021是3份比較特殊的材料，其中CR004和CR007對(duì)根腫菌M01、M02和M03都表現(xiàn)出抗性但只含有抗病基因CRk，CR021只抗根腫菌M01且含有抗病基因Crr2和CRk；由于本試驗(yàn)感病材料中也含有基因Crr2和CRk，因此推測(cè)這3份材料中可能還含有其他抗病基因，有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)對(duì)24份大白菜材料進(jìn)行接種鑒定，首次明確了它們對(duì)3個(gè)不同地區(qū)根腫菌的抗性，并篩選出10份抗病材料。同時(shí)，利用已經(jīng)開(kāi)發(fā)出的與抗病基因連鎖的分子標(biāo)記對(duì)24份材料進(jìn)行了分子鑒定，明確了與材料抗病性相關(guān)的基因，對(duì)今后抗病材料的篩選和抗病基因的分子聚合育種具有較高的參考價(jià)值。

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