胡楚璇+李穗華+張霞

[摘要] 目的 觀察人參皂苷Rg1對(duì)大鼠視神經(jīng)損傷的保護(hù)作用，并探討其保護(hù)機(jī)制。 方法 將Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和治療組，每組30只。對(duì)照組大鼠不建模腹腔注射生理鹽水，模型組大鼠腹腔注射生理鹽水，治療組大鼠建模后腹腔注射人參皂苷Rg1（50 mg/kg），連續(xù)給藥7 d。采用視神經(jīng)夾挫傷法建立視神經(jīng)損傷大鼠模型，建模5 d后所有大鼠右側(cè)上丘注射熒光金標(biāo)記視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGCs），處死前行閃光視覺(jué)誘發(fā)電位檢測(cè)，處死后比較眼球RGCs密度、RGCs凋亡情況、誘發(fā)電位P1波、視神經(jīng)膽固醇含量、沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）蛋白和羥甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGCR）表達(dá)情況。 結(jié)果 在大鼠處死后7、14、21 d，隨著處死時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組視覺(jué)誘發(fā)電位、視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞數(shù)沒(méi)有顯著性變化，模型組、治療組視覺(jué)誘發(fā)電位、視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；相同時(shí)間點(diǎn)模型組視覺(jué)誘發(fā)電位、視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組，治療組視覺(jué)誘發(fā)電位、視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞數(shù)顯著低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。隨著處死時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組、治療組RGCs密度、視神經(jīng)膽固醇、SIRT1和HMGCR蛋白水平逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；相同時(shí)間點(diǎn)模型組RGCs密度、視神經(jīng)膽固醇、SIRT1和HMGCR蛋白水平顯著高于對(duì)照組，治療組RGCs密度、視神經(jīng)膽固醇、SIRT1和HMGCR蛋白水平顯著低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 人參皂苷Rg1對(duì)大鼠視神經(jīng)損傷性疾病有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與上調(diào)SIRT1和HMGCR基因的表達(dá)，進(jìn)而影響視神經(jīng)膽固醇合成有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 視神經(jīng)損傷；大鼠；人參皂苷Rg1；視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞

[中圖分類(lèi)號(hào)] R737.31 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）01（c）-0017-05

[Abstract] Objective To observe the protective effect of ginsenoside Rg1 on optic nerve injury in rats and its protective mechanism. Methods Wistar rats were randomly divided into control group， model group and treatment group， with 30 rats in each group. Rats in the control group were injected intraperitoneally with saline without modeling. Rats in the model group were intraperitoneally injected with saline. Rats in the treatment group were intraperitoneally injected with ginsenoside Rg1 （50 mg/kg） for 7 d. The model of optic nerve injury was established by occlusion of the optic nerve. After 5 days of modeling， fluorescein-labeled retinal ganglion cells （RGCs） were injected into the right superior colliculus on the right side of the rats. Flash visual evoked potentials were detected before the rats were sacrificed. RGCs density， apoptosis of RGCs， P1 wave of evoked potential， optic nerve cholesterol content， silent information regulator 1 （SIRT1） protein and HMG-CoA reductase （HMGCR） expression were detected after the rats were sacrificed. Results At 7， 14， 21 days after sacrifice， the visual evoked potentials and the number of retinal apoptotic cells in the control group did not change significantly with the prolongation of sacrifice time. The visual evoked potentials and the number of retinal apoptotic cells in the model group and treatment group were increased gradually （P < 0.05）. At the same time point， the number of visual evoked potentials and retinal apoptotic cells in the model group were significantly higher than those in the control group， the visual evoked potential， the number of retinal apoptotic cells in the treatment group were lower than those in the model group （P < 0.05）. The RGCs density， optic nerve cholesterol， SIRT1 and HMGCR protein levels in the model group and treatment group were increased gradually with the prolongation of sacrifice time （P < 0.05）； at the same time， RGCs density， optic nerve cholesterol， SIRT1 and HMGCR protein levels in the model group were significantly higher than those in the control group， the RGCs density， optic nerve cholesterol， SIRT1 and HMGCR protein levels in the treatment group were lower than those in the model group （P < 0.05）. Conclusion Ginsenoside Rg1 has a significant protective effect on optic nerve injury in rats， the mechanism may be related to the up-regulation of the expression of SIRT1 and HMGCR genes and the synthesis of optic nerve cholesterol.endprint

[Key words] Optic nerve injury； Rat； Ginsenoside Rg1； Retinal ganglion cells

視神經(jīng)損傷是眼科最常見(jiàn)的外傷性疾病之一，隨著交通事故的不斷增加，其發(fā)病率呈逐年遞增的趨勢(shì)[1]。由于視神經(jīng)細(xì)胞和RGCs再生修復(fù)能力弱，且具有連鎖反應(yīng)，小部分細(xì)胞受到暴力因素壞死后將引起大部分細(xì)胞凋亡[2]。如何阻止RGCs凋亡的進(jìn)程，從而最大程度保護(hù)視力是目前研究的熱點(diǎn)[3-4]。人參是著名的傳統(tǒng)中藥，藥理作用廣泛，隨著中藥藥理學(xué)的發(fā)展，人參的活性成分不斷被提煉、萃取[5-6]。最新研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1在抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡方面具有一定的療效，但人參皂苷Rg1對(duì)RGCs的作用尚未完全清楚。本研究旨在探究Rg1對(duì)大鼠RGCs的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠90只，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室（合格證號(hào)：SCXK2012-0007），9～10周齡，體重（250±20）g。動(dòng)物室保持空氣流動(dòng)通暢，相對(duì)濕度55%～65%，溫度（23±2）℃。所有大鼠按常規(guī)方法飼養(yǎng)，全程監(jiān)測(cè)并對(duì)一般情況進(jìn)行記錄。

1.2 試劑

人參皂苷Rg1粉劑（購(gòu)自中國(guó)成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)：A0237），溶于生理鹽水配成12 g/L溶液；Fluorochrome熒光金（深圳市豪地華拓生物科技有限公司，批號(hào)：52-9500）；SIRT1、HMGCR及GAPDH兔抗大鼠多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 儀器

德國(guó)Medicon動(dòng)脈夾（北京科惠康醫(yī)療器械有限公司）；Leica M525手術(shù)顯微鏡（德國(guó)徠卡公司）；Olympus CX23熒光顯微鏡（上海維翰光電科技有限公司）；MoreChina分光光度計(jì)和IVE-205A視覺(jué)電生理檢查儀（重慶上邦醫(yī)療設(shè)備有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 建模及分組 模型建立參考文獻(xiàn)[7]，并作適當(dāng)修改。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（350 mg/kg），麻醉成功后消毒右眼，于顯微鏡下將球結(jié)膜剪開(kāi)作鈍性分離，暴露右側(cè)視神經(jīng)眶內(nèi)段，用動(dòng)脈夾在距視神經(jīng)根部2 mm處夾持15 s，逐層縫合后于結(jié)膜囊內(nèi)涂紅霉素眼膏。術(shù)后大鼠右眼瞳孔散大，無(wú)視網(wǎng)膜出血、眼瞼閉合不全及眼球突出認(rèn)為建模成功。將大鼠隨機(jī)分為三組，每組30只。對(duì)照組大鼠不建模腹腔注射生理鹽水，模型組大鼠腹腔注射生理鹽水，治療組大鼠建模后腹腔注射人參皂苷Rg1（50 mg/kg），連續(xù)給藥7 d。所有大鼠于建模后5 d在右側(cè)上丘注射熒光金標(biāo)記RGCs。

1.4.2 閃光視覺(jué)誘發(fā)電位檢查 大鼠腹腔注射10%水合氯醛（350 mg/kg），麻醉成功后備皮消毒，將視覺(jué)電生理檢查儀的電極針刺入皮下，設(shè)定右側(cè)耳廓為地電極，右側(cè)頰部為參考電極，記錄電極為兩耳尖連線中點(diǎn)在頸項(xiàng)部的投射點(diǎn)，阻抗標(biāo)準(zhǔn)≤4Ω。左眼用黑眼罩遮擋，適應(yīng)10 min后對(duì)右眼進(jìn)行強(qiáng)度為3.85 cd/m2的光刺激，頻率為2.1 Hz，獲取誘發(fā)電位P1波的潛伏期及波幅，重復(fù)測(cè)量3次取平均值。

1.4.3 RGCs觀察 頸椎脫臼法處死大鼠，摘取右側(cè)眼球，多聚甲醛-PB固定液（0.15 mol/L，pH 7.4）浸泡20 min，于顯微鏡下依次剝除角膜、晶狀體和玻璃體，取出視網(wǎng)膜并標(biāo)記面積相等的4個(gè)象限，分別代表鼻上、鼻下、顳上和顳下，固定液浸泡30 min。用PBS緩沖液（0.15 mol/L，pH 7.4）漂洗3次后平鋪于載玻片，蓋玻片封片。每個(gè)象限于低倍鏡下隨機(jī)選取3個(gè)樣本區(qū)，調(diào)整為紫外光激發(fā)模式，于高倍鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)樣本區(qū)的存活RGCs，取平均值得到存活RGCs密度。

1.4.4 視神經(jīng)膽固醇、SIRT1和HMGCR基因的蛋白檢測(cè) 將計(jì)數(shù)后的視網(wǎng)膜剪碎，制備成2 mL勻漿，以3000 r/min離心20 min，取上清液等分為2份，其中1份經(jīng)氧化酶-過(guò)氧化物酶法測(cè)定膽固醇含量，具體為：將上清液加入到1 mL工作液（緩沖液和過(guò)氧化酶1∶1混合）中37℃水浴15 min，然后在500 nm波長(zhǎng)分光光度計(jì)下測(cè)定吸光度值A(chǔ)，每10克細(xì)胞蛋白中膽固醇含量=（測(cè)定A/標(biāo)準(zhǔn)A×標(biāo)準(zhǔn)液濃度×150）/樣品重量×10；另1份先通過(guò)Bradford法測(cè)定總蛋白濃度，再取SIRT1、HMGCR及GAPDH兔抗大鼠多克隆抗體經(jīng)濃縮膠、分離膠恒壓處理后，分別用TBST緩沖液洗膜4次，5 min/次。最后用TBS緩沖液洗膜15 min后顯色。將結(jié)果掃描到計(jì)算機(jī)中，用Quantity one軟件分析，GAPDH為標(biāo)準(zhǔn)濃度，SIRT1和HMGCR為待測(cè)濃度，用灰度積分的比值計(jì)算SIRT1和HMGCR蛋白的含量。

1.4.5 TUNEL法檢測(cè)RGCs凋亡情況 分別于給藥后不同時(shí)間點(diǎn)處死Wistar大鼠，摘除右眼眼球，4%甲醛固定24 h后制成石蠟切片，按TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒（瑞士，Roch公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行視網(wǎng)膜RGCs的凋亡檢測(cè)。所有切片在同一光照強(qiáng)度下，隨機(jī)在每個(gè)切片中取3個(gè)視野進(jìn)行觀察，計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，取其平均數(shù)（每高倍視野均數(shù)）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用重復(fù)測(cè)量方差分析。經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊性則組間兩兩比較采用最小差值法（LSD）法，若方差不齊將采用Dunnett T3法進(jìn)行兩兩比較。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠視覺(jué)誘發(fā)電位檢查結(jié)果比較

隨著處死時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組視覺(jué)誘發(fā)電位沒(méi)有顯著性變化（P > 0.05），模型組、治療組視覺(jué)誘發(fā)電位逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；相同時(shí)間點(diǎn)模型組視覺(jué)誘發(fā)電位顯著高于對(duì)照組，治療組視覺(jué)誘發(fā)電位低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表1。endprint

2.2 各組大鼠存活RCGs密度比較

隨著處死時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組RGCs密度沒(méi)有顯著性變化（P > 0.05），模型組、治療組RGCs密度逐漸下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；相同時(shí)間點(diǎn)模型組RGCs密度顯著顯著低于對(duì)照組，治療組RGCs密度高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 各組大鼠視神經(jīng)膽固醇、SIRT1和HMGCR蛋白水平比較

隨著處死時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組視神經(jīng)膽固醇、SIRT1和HMGCR蛋白水平?jīng)]有顯著性變化（P > 0.05），模型組、治療組視神經(jīng)膽固醇、SIRT1和HMGCR蛋白水平逐漸下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；相同時(shí)間點(diǎn)模型組視神經(jīng)膽固醇、SIRT1和HMGCR蛋白水平顯著低于對(duì)照組，治療組視神經(jīng)膽固醇、SIRT1和HMGCR蛋白水平高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表3～4。

2.4 視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞數(shù)的變化

隨著處死時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞數(shù)沒(méi)有顯著性變化（P > 0.05），模型組、治療組視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；相同時(shí)間點(diǎn)模型組視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組，治療組視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞數(shù)低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表5。

3 討論

車(chē)禍、墜落和打擊傷是視神經(jīng)損傷最常見(jiàn)的原因，主要表現(xiàn)為視力下降及視野缺損。研究發(fā)現(xiàn)，視神經(jīng)在受到擠壓后早期僅有少量RGCs壞死，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，周?chē)词艿綌D壓的RGCs不斷發(fā)生凋亡[8]。以大鼠為例，在視神經(jīng)受到擠壓后10% RGCs壞死的情況下，傷后7 d RGCs死亡比例可達(dá)40%，傷后14 d高達(dá)70%，最終僅剩10%左右的RGCs存活。除視神經(jīng)損傷外，RGCs數(shù)量下降同樣是青光眼、視神經(jīng)炎等多種眼科疾病的病理特征[9-10]。以往在治療嚴(yán)重視神經(jīng)損傷方面無(wú)特效方法，多數(shù)患者視力不斷下降，僅能維持在光感水平，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量[11]。

人參活性成分最具代表性的是皂苷類(lèi)，其中Rg1具有抗衰老[12]、抗氧化[13]、提高免疫力[14]及增強(qiáng)記憶力的功效[15]，在抗心肌細(xì)胞及神經(jīng)元損傷中效果顯著，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有明顯的興奮作用，其機(jī)制可能與多種途徑有關(guān)[16]。研究發(fā)現(xiàn)Rg1可通過(guò)降低小鼠腦組織中H2O2和羧基化蛋白含量，提高SOD含量，從而降低神經(jīng)元中脂褐素的積累，減輕線粒體結(jié)構(gòu)的損傷[17]。彭彬[18]研究認(rèn)為Rg1可通過(guò)促進(jìn)腦內(nèi)DNA、RNA及蛋白質(zhì)的合成，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。視神經(jīng)擠壓傷后給予腹腔注射Rg1治療，在一定程度上能延緩RGCs死亡，提高RGCs存活率，具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用[19]。研究表明，人參皂苷Rg1對(duì)視網(wǎng)膜氧化應(yīng)激損傷有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抑制大鼠視網(wǎng)膜BACE1表達(dá)上調(diào)有關(guān)[20]。體外研究表明，人參皂苷Rg1具有良好的保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞免受損傷的作用[21]。人參皂苷Rg1具有對(duì)抗NMDA誘導(dǎo)的RGCs凋亡、保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、增強(qiáng)其活性的作用[22]。因此筆者推測(cè)人參皂苷Rg1對(duì)視神經(jīng)損傷后的RGCs同樣具有保護(hù)作用。本研究選用了國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的大鼠視神經(jīng)夾挫傷模型，其具有直視下操作、損傷程度可定量等優(yōu)勢(shì)。

本研究結(jié)果顯示，隨著處死時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組視覺(jué)誘發(fā)電位、視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞數(shù)沒(méi)有顯著性變化，模型組、治療組視覺(jué)誘發(fā)電位、視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；相同時(shí)間點(diǎn)模型組視覺(jué)誘發(fā)電位、視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞數(shù)顯著高于對(duì)照組，治療組視覺(jué)誘發(fā)電位、視網(wǎng)膜凋亡細(xì)胞數(shù)低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。隨著處死時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組、治療組RGCs密度、視神經(jīng)膽固醇、SIRT1和HMGCR蛋白水平逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；相同時(shí)間點(diǎn)模型組RGCs密度、視神經(jīng)膽固醇、SIRT1和HMGCR蛋白水平顯著高于對(duì)照組，治療組RGCs密度、視神經(jīng)膽固醇、SIRT1和HMGCR蛋白水平低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與Wang等[10]的結(jié)論一致，說(shuō)明Rg1在阻止RGCs凋亡進(jìn)程上效果顯著。細(xì)胞損傷后的凋亡過(guò)程受基因調(diào)控，張燕等[23]研究發(fā)現(xiàn)，視神經(jīng)損傷后小鼠視網(wǎng)膜中膽固醇水平隨損傷時(shí)間延長(zhǎng)不斷下降，而在膽固醇的合成代謝過(guò)程中，SIRT1-HMGCR調(diào)控通路起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，不同組別SIRT1和HMGCR蛋白表達(dá)差異顯著，因此筆者推測(cè)人參皂苷Rg1對(duì)RGCs的保護(hù)作用可能與上調(diào)SIRT1和HMGCR基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)膽固醇合成有關(guān)。本研究仍存在以下三點(diǎn)不足：①Rg1濃度、劑量單一，Rg1的保護(hù)作用是否為劑量和濃度依賴(lài)性仍需進(jìn)一步探究；②給藥方式單一，血視網(wǎng)膜屏障可阻擋一部分Rg1進(jìn)入視網(wǎng)膜，從而削弱藥效，下一階段的實(shí)驗(yàn)應(yīng)補(bǔ)充玻璃體內(nèi)注射等局部給藥方式；③本研究為動(dòng)物性實(shí)驗(yàn)，在生理結(jié)構(gòu)及藥物體內(nèi)代謝方面與人體存在一定差異，是否適用于人體有待進(jìn)一步探究。

綜上所述，人參皂苷Rg1對(duì)大鼠視神經(jīng)損傷性疾病有明顯保護(hù)作用，顯著減緩RGCs的凋亡速度，其機(jī)制可能與影響SIRT1和HMGCR基因的蛋白表達(dá)有關(guān)。

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（收稿日期：2017-09-13 本文編輯：張瑜杰）endprint