楊俊霞+夏蓀暉+張成標(biāo)

[摘要] 目的 探討β-甲基-環(huán)糊精（Methyl-β-cyclodextri，M-β-CD）對KCl刺激引起的原代培養(yǎng)的小鼠皮層神經(jīng)元鈣離子內(nèi)流的影響。 方法 2016年9—12月，徐州醫(yī)科大學(xué)麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。將原代培養(yǎng)1周的小鼠皮層神經(jīng)元隨機(jī)分為3組：正常（Con）組、KCl組、M-β-CD -KCl組。采用熒光顯微鏡觀察各組細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度的變化，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)一步檢測各組細(xì)胞鈣離子熒光強(qiáng)度的變化。 結(jié)果 熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀檢測均顯示0.1 mol/L KCl 作用于原代培養(yǎng)的小鼠皮層神經(jīng)元 12 h，可使神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子增加[M-β-CD -KCl組 vs KCl組：（96.75±2.23） vs （145.43±4.32）， P<0.01 ]。0.002 mol·L-1 M-β-CD預(yù)處理 25 min可明顯降低KCl引起的細(xì)胞內(nèi)鈣離子的增加[M-β-CD -KCl組 vs KCl組：（1 093.89±6.53） vs （1 498.56±9.03），P<0.01]。 結(jié)論 β-甲基-環(huán)糊精可降低KCl引起的神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子的增加。

[關(guān)鍵詞] β-甲基-環(huán)糊精；KCl；神經(jīng)元；鈣離子

[中圖分類號] R4 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）12（b）-0009-03

[Abstract] Objective To study the effect of Methyl-β-cyclodextri on the KCl-induced neuron calcium ion influx. Methods From Septmber to December 2016，Each experiment was repeated for 6 times in the Key Laboratory of Anesthesiology in the Xuzhou Medical University， and the primary cultured-cortical neuron of the mice was randomly divided into three groups： normal Con group， KCI group and M-β-CD-KCl group， and the changes of intracellular calcium fluorescence intensity of each group was observed by the fluorescence microscope， and the changes of fluorescence intensity of cell calcium ion of each group was further tested by the flow cytometry. Results The observation of fluorescence microscope and test of flow cytometry show that 0.1 mol/L KCll acts on the primary cultured-cortical neuron of the mice for 12 h， which can increase the intracellular calcium ion[M-β-CD -KCl group vs KCl group：（96.75±2.23） vs （145.43±4.32）， P<0.01]， and the pre-treatment of 0.002 mol·L-1 M-β-CD for 25min can obviously reduce the increase of intracellular calcium ion caused by KCI[M-β-CD -KCl group vs KCl group：（1 093.89±6.53） vs（1 498.56±9.03），P<0.01]. Conclusion The Methyl-β-cyclodextri can reduce the increase of intracellular calcium ion caused by KCI.

[Key words] Methyl-β-cyclodextri； KCI； Neuron； Calcium ion

β-甲基-環(huán)糊精（Methyl-β-cyclodextri，M-β-CD）對膽固醇有極強(qiáng)的親和力，是一種常用膽固醇清除劑[1-2]，小窩（caveolae）是細(xì)胞膜上富含膽固醇和鞘脂的特定區(qū)域，含有多種與細(xì)胞生物學(xué)特性相關(guān)的膜受體，是細(xì)胞內(nèi)外信號傳遞的重要通道，對細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用[3-4]。研究證實(shí)高濃度氯化鉀（KCl）可使細(xì)胞膜電位升高，細(xì)胞膜上的電壓依賴型鈣離子通道開放，胞內(nèi)鈣離子升高[1]，該研究于2016年9—12月采用KCl刺激原代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元模型，檢測M-β-CD對KCl刺激引起的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響，以期揭示細(xì)胞膜上的小窩結(jié)構(gòu)在KCl刺激引起的鈣離子濃度升高中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 孕13 ～15 d小鼠，清潔級，由徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.1.2 試劑 β-甲基-環(huán)糊精（C4555-1G，優(yōu)級純GR， SIGMA），F(xiàn)luo 3-AM（46394， SIGMA），KCl（上海生工生物科技有限公司）；DMEM 培養(yǎng)基、Neuroasal Medium、B-27 添加劑、胰酶（Life Technology Inc）；胎牛血清（Biochem 公司）；L-多聚賴氨酸、二甲基亞砜（Sigma 公司）；其余為國產(chǎn)分析純試劑。endprint

1.2 方法

1.2.1 原代小鼠皮層神經(jīng)元培養(yǎng)及各組神經(jīng)元處理 取胎齡為13～15 d 的小鼠，無菌條件下分離出大腦皮層，在D-Hank′s 平衡鹽溶液中漂洗3次，盡量剔除腦膜，剪碎后用終濃度為0.25%胰酶，37℃消化10 min，離心，棄上清，用含15%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基制備成1.0×109/L密度的細(xì)胞懸液，接種于預(yù)先用L-多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)板中，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。24 h后換成含2% B27的Neurobasal 繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換液。培養(yǎng)至第7天，換液，KCl組為終濃度為0.1 mol/L KCl 作用12 h，M-β-CD -KCl組為0.002 mol/L M-β-CD預(yù)處理25 min 后加入KCl，終濃度為0.1 mol/L，作用12 h。然后，將各組細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 熒光顯微鏡觀察各組神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度的變化

用D-hanks液洗滌細(xì)胞3次，加入終濃度為5 μmol/L的Fluo-3/AM-DMSO D-hanks液， 在37℃孵育45 min，用D-hanks液洗滌細(xì)胞5次，每孔加入1 mL D-hanks液孵育20 min，熒光顯微鏡觀察各組神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度。用 Image J 分析各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度的變化。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測各組神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度的變化 用胰酶將細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，移入離心管中1 000 r/min，5 min，棄上清，用D-hanks液重懸細(xì)胞，再次離心，1 000 r/min，5 min，棄上清，用D-hanks液2 mL重懸細(xì)胞，加入Fluo-3/AM-DMSO，使其終濃度為5 μmol/L，混勻，置入37℃水浴箱中避光孵育30 min，離心，1 000 r/min，5 min，棄上清，D-hanks重懸，離心，1 000 r/min，5 min，棄上清，D-hanks緩沖液1～2 mL重懸細(xì)胞，將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為1×106/mL，上機(jī)檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，各組數(shù)據(jù)以（x±s）表示。采用One Way ANOVA 法對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡觀察各組神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度的變化

0.1 mol/L KCl 作用于體外培養(yǎng)1周的小鼠皮層神經(jīng)元12 h，可使神經(jīng)元內(nèi)鈣離子明顯增加。0.002 mol/L M-β-CD預(yù)處理 25 min可明顯降低KCl引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子的增加[M-β-CD-KCl組 vs KCl組：（96.75±2.23） vs （145.43±4.32），P<0.01]（圖 1）。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度的變化

流式細(xì)胞術(shù)檢測大量神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)：0.1 mol/L KCl 作用于體外培養(yǎng)1周的小鼠皮層神經(jīng)元12 h，可使神經(jīng)元內(nèi)鈣離子明顯增加。0.002 mol/L M-β-CD預(yù)處理25 min可明顯降低KCl引起的細(xì)胞內(nèi)鈣離子的增加，[M-β-CD-KCl組 vs KCl組：（1093.89±6.53） vs （1498.56±9.03），P<0.01]，見圖2。

3 討論

脂筏是質(zhì)膜上富含膽固醇和鞘磷脂的微結(jié)構(gòu)域，富含膽固醇和磷脂酰肌醇，研究顯示，小窩是細(xì)胞膜上膜筏的重要一種，主要有膽固醇、鞘脂、小窩蛋白組成，是多種信號分子聚集進(jìn)行信號交易的平臺[5-7]。β-甲基-環(huán)糊精對膽固醇有極強(qiáng)的親和力，是一種常用膽固醇清除劑，科學(xué)家常利用其對膽固醇的親和力來破壞細(xì)胞膜的小窩結(jié)構(gòu)研究細(xì)胞的多種生理和病理時細(xì)胞分子變化[1-2]，該研究也利用β-甲基-環(huán)糊精的這一特點(diǎn)來研究β-甲基-環(huán)糊精對KCl刺激引起的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響，證實(shí)小窩結(jié)構(gòu)完整對細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化具有重要影響，小窩在細(xì)胞病理生理過程中扮演重要角色?，F(xiàn)已證明，大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)KCl刺激誘導(dǎo)表現(xiàn)出LTP，KCl可使細(xì)胞膜電位升高，當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞的膜電位上升到一定值時，細(xì)胞膜上的電壓依賴型鈣離子通道開放，引起細(xì)胞內(nèi)多種信號通路的激活。比如細(xì)胞受KCl刺激后引起膜的去極化，細(xì)胞外鈣內(nèi)流，激活鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶（calcium/calmodulin-dependent protein kinase， CAMK）及Ras/MAPK途徑，通過級聯(lián)反應(yīng)磷酸化環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein， CREB），激活腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（ brain derived neurotrophic factor， BDNF）發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)KCl刺激誘導(dǎo)表現(xiàn)出LTP，作為神經(jīng)細(xì)胞活動最具特征性的表現(xiàn)方式，會引發(fā)各類基因表達(dá)并合成諸多蛋白質(zhì)，從而使得神經(jīng)細(xì)胞體現(xiàn)出不同的生物學(xué)功能[8-10]研究證實(shí)高濃度氯化鉀可使細(xì)胞膜電位升高，細(xì)胞膜上的電壓依賴型鈣離子通道開放，胞內(nèi)鈣離子升高[1]，因此該研究采用高濃度氯化鉀誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子變化，用β-甲基-環(huán)糊精預(yù)處理，采用熒光顯微鏡直接觀察細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度變化，結(jié)果顯示β-甲基-環(huán)糊精預(yù)處理可明顯抑制高濃度氯化鉀引起的胞內(nèi)鈣離子濃度的升高（M-β-CD -KCl組 vs KCl組：（96.75±2.23） vs （145.43±4.32）（##P<0.01）， 并結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)測定大量細(xì)胞鈣離子熒光強(qiáng)度的變化，進(jìn)一步確定了β-甲基-環(huán)糊精預(yù)處理可明顯抑制高濃度氯化鉀引起的胞內(nèi)鈣離子濃度的升高（M-β-CD -KCl組 vs KCl組：（1 093.89±6.53） vs （1498.56±9.03）（##P<0.01）， 熒光顯微鏡觀察更直觀的記錄鈣離子的熒光強(qiáng)度，流式細(xì)胞術(shù)可以使我們記錄更多的細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)大樣本量采集數(shù)據(jù)，二者結(jié)合更有力的證明了β-甲基-環(huán)糊精預(yù)處理可有效降低高濃度氯化鉀誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高。這與之前科學(xué)家研究采用流式細(xì)胞術(shù)全面檢測胞內(nèi)離子濃度變化時結(jié)果一致[11]，但是該研究采用熒光顯微鏡直接觀察和流式細(xì)胞儀大樣本記錄更有說服力的證實(shí)了采用膽固醇清除劑β-甲基-環(huán)糊精破壞細(xì)胞膜表面小窩結(jié)構(gòu)后，可抑制KCl引起的胞內(nèi)鈣離子升高。首次證實(shí)了，細(xì)胞表面小窩結(jié)構(gòu)在KCl引起的胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流中起非常重要的作用，但是具體是通過小窩上鈣通道還是鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶或其它分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。endprint