張安世， 司清亮， 齊秀娟， 張中海

(1.焦作師范高等?？茖W(xué)校理工學(xué)院，河南 焦作 454000； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，果樹生長發(fā)育與品質(zhì)控制重點開放實驗室，河南 鄭州 450009)

獼猴桃(Actinidia)是多年生雌雄異株落葉藤本植物，是20世紀(jì)果樹栽培史上人工馴化栽培最成功的果樹之一[1]。獼猴桃種類繁多, 現(xiàn)有54個種和21個變種，共約75個分類群[2]，但生產(chǎn)上栽培品種多為美味獼猴桃和中華獼猴桃，軟棗獼猴桃在中國部分地區(qū)也已開始商業(yè)栽培。獼猴桃栽培品種的大面積種植，導(dǎo)致了品種間遺傳背景狹窄[2]，遺傳資源多樣性受到一定程度的破壞，再加上獼猴桃染色體倍性復(fù)雜，自然界種間雜交現(xiàn)象明顯[3]，使得品種間產(chǎn)生各種不同變化, “同名異物”或“同物異名” 現(xiàn)象時有發(fā)生，不利于獼猴桃種質(zhì)資源的鑒定，因此，有必要對其遺傳特性進行深入研究。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，新的分子標(biāo)記技術(shù)不斷被開發(fā)與應(yīng)用，已經(jīng)成為遺傳領(lǐng)域重要的研究工具。相關(guān)序列多態(tài)性擴增(Sequence-related amplification polymorphism, SRAP)是由Li等[4]開發(fā)的一種針對真核基因開放閱讀框(Open reading frames，ORF)而擴增的新型分子標(biāo)記技術(shù)。由于真核基因ORF本身可能是目的基因的一部分或與目的基因緊密連鎖，因而能有效對性狀進行跟蹤[5]。SRAP具有簡便、快速、穩(wěn)定等優(yōu)點，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性分析、品種鑒定、遺傳圖譜繪制等研究[6-10]。目前，SRAP標(biāo)記在獼猴桃種質(zhì)資源研究上的應(yīng)用僅有井趙斌等[2]的報道，還未見到利用SRAP標(biāo)記進行獼猴桃種質(zhì)分子指紋構(gòu)建的相關(guān)研究。本試驗采用SRAP標(biāo)記在對中國32份獼猴桃種質(zhì)進行遺傳多樣性分析的基礎(chǔ)上，進一步構(gòu)建獼猴桃種質(zhì)材料的DNA指紋圖譜，為獼猴桃種質(zhì)資源的保護、鑒定和新品種選育等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料全部來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所獼猴桃選種圃，包括應(yīng)用于生產(chǎn)的4個種中的32份品種或優(yōu)系材料(表1)。所有材料均為7年樹齡，每個品種隨機選取3株，每株采集2片健康、幼嫩葉片，置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1供試獼猴桃材料

Table1Actinidiamaterialsusedinthisstudy

編號品種(系)種學(xué)名編號品種(系)種學(xué)名1徐香美味獼猴桃A.deliciosa17早金中華獼猴桃A.chinensis2金魁美味獼猴桃A.deliciosa18金艷中華獼猴桃A.chinensis3金魁♂美味獼猴桃A.deliciosa19瓊漿中華獼猴桃A.chinensis4翠玉中華獼猴桃A.chinensis20豫皇1號中華獼猴桃A.chinensis5皖翠美味獼猴桃A.deliciosa21湘吉紅中華獼猴桃A.chinensis6金碩美味獼猴桃A.deliciosa22紅寶石星軟棗獼猴桃A.arguta7中獼2號美味獼猴桃A.deliciosa23紅寶石星♂軟棗獼猴桃A.arguta8海艷美味獼猴桃A.deliciosa24軟紅軟棗獼猴桃A.arguta9米良1號美味獼猴桃A.deliciosa25紅貝軟棗獼猴桃A.arguta10海沃德美味獼猴桃A.deliciosa26紅貝♂軟棗獼猴桃A.arguta11布魯諾美味獼猴桃A.deliciosa27華紅1號軟棗獼猴桃A.arguta12紅陽中華獼猴桃A.chinensis28華紅2號軟棗獼猴桃A.arguta13黃陽中華獼猴桃A.chinensis29魁綠軟棗獼猴桃A.arguta14黃陽♂中華獼猴桃A.chinensis30桓優(yōu)1號軟棗獼猴桃A.arguta15晚紅中華獼猴桃A.chinensis31華特♂毛花獼猴桃A.eriantha16楚紅中華獼猴桃A.chinensis32華特毛花獼猴桃A.eriantha

1.2 獼猴桃葉片基因組DNA的提取

每個獼猴桃品種取3片不同植株的幼嫩葉片等量混合，采用改良CTAB法[11]提取獼猴桃幼嫩葉片基因組DNA，所得DNA用紫外分光光度法和瓊脂糖凝膠電泳法檢測其質(zhì)量及完整性。將模板DNA濃度稀釋至20 ng/μl，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SRAP-PCR擴增反應(yīng)

選用49對SRAP引物組合對供試材料進行擴增。反應(yīng)體積10.0 μl，DNA 1.0 μl，正反引物 各0.7 μl(引物濃度為10 μmol/L)，2×TaqMasterMix 5.0 μl (含有TaqDNA Polymerase, 2×TaqPCR Buffer, 3 mmol/L MgCl2和400 μmol/L dNTP mix)，RNase-Free water 2.6 μl。SRAP-PCR擴增程序為：94 ℃，5 min；94 ℃ 1 min，35 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min， 5個循環(huán)；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min,4 ℃保存。擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠分離。SRAP引物采用張捷等[12]公布的引物序列(包括7個正向引物 Me1～Me7和7個反向引物 em1～em7)，由金唯智生物科技(北京)有限公司合成。2×TaqMasterMix和RNase-Free water購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

根據(jù)電泳結(jié)果統(tǒng)計擴增的條帶，以1和0的方式代表擴增條帶的有和無，構(gòu)建1,0矩陣。

利用POPGENE1.32軟件[13]進行遺傳多樣性參數(shù)分析，計算多態(tài)性百分率(PPL)、觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性(H)、Shannon’s多樣性指數(shù)(I)、基因流(Nm)和遺傳分化系數(shù)(Gst)，并通過GenALEx6.5軟件[14]進行分子方差分析(AMOVA)。參照黃秀等[15]方法計算引物多態(tài)性信息含量(PIC)，用NTSYS-pc 2.0軟件[13]構(gòu)建UPGMA聚類圖，同時，參照張林等[16]方法構(gòu)建34個獼猴桃品種的DNA指紋圖譜，并通過G:BOX-HR凝膠成像系統(tǒng)中的Genetool軟件計算各位點的分子量。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃SRAP擴增與引物篩選

利用7個正向引物(Me1～Me7)與7個反向引物(em1～em7)兩兩配對，組成49對SRAP引物組合，以供試的32份獼猴桃材料對49對SRAP引物進行篩選，最終篩選出條帶清晰、多態(tài)性高的12對引物。所用引物序列及多態(tài)性統(tǒng)計結(jié)果見表2。12對引物共擴增出191個條帶，其中多態(tài)性條帶186個，多態(tài)性比率為97.38%，說明所選引物在32個獼猴桃品種(系)間具有很高的多態(tài)性。在被統(tǒng)計的12對引物中，引物組合Me3-em7擴增的位點數(shù)最多，為19個，引物組合Me6-em6擴增的位點數(shù)最少，為12個，平均每對引物擴增的位點數(shù)為15.92個。引物組合Me6-em6的擴增結(jié)果見圖1。

M:分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～32供試獼猴桃材料見表1。圖1 引物組合Me6-em6對獼猴桃的SRAP擴增Fig.1 The SRAP amplification of Actinidia with primer combination of Me6-em6

2.2 獼猴桃遺傳多樣性分析

通過POPGENE1.32軟件分析得到各引物的遺傳多樣性參數(shù)(表2)，多態(tài)性信息含量(PIC)的變化范圍為 0.864 9～0.917 0，平均為0.893 3；觀測等位基因數(shù)(Na)的變化范圍為1.916 7～2.00 0，平均為1.969 0；有效等位基因數(shù)(Ne)的變化范圍為1.299 4～1.563 6，平均為1.400 6；Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)的變化范圍為0.193 0～0.317 2，平均值為0.221 0； Shannon’s信息指數(shù)(I)的變化范圍為0.316 6～0.478 4，平均值為0.387 9。種間遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.512 0，表明在總遺傳變異中有51.20%存在于種間，48.80%存在于種內(nèi)?；蛄?Nm)為0.476 5，表明種間的遺傳分化較高，基因交流頻率較低。利用GenALEx6.5軟件進行分子方差分析(AMOVA)，結(jié)果(表3)表明，種間變異占總變異的51.87%，種內(nèi)個體間變異占總變異的48.13%，與POPGENE1.32軟件分析結(jié)果一致。上述結(jié)果表明，32個獼猴桃品種(系)間存在較為豐富的遺傳多樣性。同時，利用SPSS17.0軟件對4個主要遺傳多樣性參數(shù)多態(tài)性信息含量(PIC)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s 基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon’s 信息指數(shù)(I)進行非參數(shù)Kruskal Wallis Test獨立樣本檢驗，結(jié)果顯示，32個獼猴桃品種(系)間遺傳多樣性水平存在顯著性差異(P=0，<0.001)，表明上述分析得到的各參數(shù)值能很好地說明獼猴桃品種(系)間遺傳多樣性水平。

表2SRAP引物及其多態(tài)性

Table2SRAPprimerusedinthisstudyandtheirpolymorphism

引物組合引物序列(5'→3')TNPPL(%)PICNaNeHIMe1-em4TGAGTCCAAACCGGATA/GACTGCGTACGAATTTGA1414100.000.86771.97381.39470.23480.3714Me3-em4TGAGTCCAAACCGGAAT/GACTGCGTACGAATTTGA1616100.000.90672.00001.37170.24310.3925Me3-em5TGAGTCCAAACCGGAAT/TGAGTCCAAACCGGAAG1717100.000.91142.00001.38200.24360.3876Me3-em6TGAGTCCAAACCGGAAT/TGAGTCCAAACCGGTAG171694.120.90781.94121.42890.25940.4048Me3-em7TGAGTCCAAACCGGAAT/GACTGCGTACGAATTATG1919100.000.91702.00001.41520.26240.4124Me4-em2TGAGTCCAAACCGGACC/GACTGCGTACGAATTTGC141392.860.86491.92861.35870.21190.3288Me4-em6TGAGTCCAAACCGGACC/TGAGTCCAAACCGGTAG1515100.000.90522.00001.56360.31720.4784Me4-em7TGAGTCCAAACCGGACC/GACTGCGTACGAATTATG1818100.000.88642.00001.29940.19300.3166Me5-em2TGAGTCCAAACCGGAAG/GACTGCGTACGAATTTGC131292.310.87101.92311.40520.24990.3899Me5-em4TGAGTCCAAACCGGAAG/GACTGCGTACGAATTTGA181794.440.90501.94441.34530.22630.3634Me6-em2TGAGTCCAAACCGGTAG/GACTGCGTACGAATTTGC1818100.000.89292.00001.33210.21060.3425Me6-em6TGAGTCCAAACCGGTAG/GACTGCGTACGAATTGCA121191.670.88331.91671.51060.30900.4665

T：位點總數(shù)；N:多態(tài)性位點數(shù)；PPL:多態(tài)性位點百分率；PIC:多態(tài)性信息含量；Na：觀測等位基因數(shù)；Ne：有效等位基因數(shù)；H: Nei’s 基因多樣性;I: Shannon 信息指數(shù) 。

表3基于SRAP標(biāo)記的32個獼猴桃品種的分子方差分析

Table3Analysisofmolecularvariance(AMOVA)of32ActinidiacultivarsbasedonSRAPmarker

變異來源自由度平方和均方方差組成方差比率(%)種間3434.697144.89917.23651.87種內(nèi)28447.74015.99115.99148.13

2.3 32份獼猴桃材料的聚類分析

利用NTSYS-pc軟件計算品種(系)間的遺傳相似系數(shù)(GS)，結(jié)果表明，32份獼猴桃材料兩兩間的GS在0.560 0至0.960 0之間，平均值為0.716 4，變幅為0.400 0，說明供試品種(系)間存在較大的遺傳差異。其中金魁和金魁♂的GS最大(0.960 0)，親緣關(guān)系最近；海燕和桓優(yōu)1號的GS最小(0.560 0)，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

利用NTSYS-pc軟件對32份獼猴桃材料進行聚類分析。結(jié)果(圖2)表明，在GS為0.77處可將32份獼猴桃材料分為4組。第1組包括21份獼猴桃材料：徐香、中獼2號、米良1號、海燕、皖翠、海沃德、布魯諾、湘吉紅、金魁、金魁♂、翠玉、楚紅、金碩、紅陽、晚紅、黃陽♂、瓊漿、黃陽、早金、金艷和豫皇1號；第2組為華特；第3組為華特♂；第4組包括9份獼猴桃材料：紅貝、魁綠、桓優(yōu)1號、紅貝♂、紅寶石星♂、軟紅、紅寶石星、華紅2號和華紅1號。其中第1組又可分為2個小組，第1小組包括10份獼猴桃材料：徐香、中獼2號、米良1號、海燕、皖翠、海沃德、布魯諾、湘吉紅、金魁和金魁♂；第2小組包括11份獼猴桃材料：翠玉、楚紅、金碩、紅陽、晚紅、黃陽♂、瓊漿、黃陽、早金、金艷和豫皇1號。第1小組除湘吉紅為中華獼猴桃外，其余均為美味獼猴桃，第2小組除金碩為美味獼猴桃外，其余均為中華獼猴桃。因此，在第1組內(nèi)美味獼猴桃和中華獼猴桃2大系列并未完全各自聚類，出現(xiàn)了少數(shù)品種(系)的互插現(xiàn)象。第2組和第3組的華特和華特♂均為毛花獼猴桃，兩者也未聚為1個組。第4組的9個獼猴桃品種(系)均為軟棗獼猴桃系列。所以，該聚類結(jié)果與預(yù)期存在一定差異，但從整體上看該聚類結(jié)果與獼猴桃的傳統(tǒng)分類基本吻合。

利用POPGENE1.32軟件計算種間的遺傳相似系數(shù)(GS)。結(jié)果表明，中華獼猴桃與美味獼猴桃親緣關(guān)系最近，GS為0.968 4；毛花獼猴桃與中華獼猴桃、美味獼猴桃、軟棗獼猴的GS分別為0.873 0、0.866 5和0.787 3。因此，相對于軟棗獼猴，毛花獼猴桃與中華獼猴桃和美味獼猴桃的親緣關(guān)系更近，與上述聚類結(jié)果基本一致。

1～32材料編號見表1。圖2 基于SRAP標(biāo)記的32份獼猴桃種質(zhì)聚類圖Fig.2 Dendrogram of 32 Actinidia germplasm based on SRAP marker

2.4 32份獼猴桃材料的DNA指紋圖譜

在選定的12對SRAP引物中，利用其中Me3-em4、Me3-em5、Me3-em7和Me4-em7 4對引物擴增的15個多態(tài)性位點構(gòu)建了32份獼猴桃材料的DNA指紋圖譜(圖3)。每份材料都有唯一的指紋圖譜，可以將32份獼猴桃材料區(qū)分并準(zhǔn)確鑒定。

3 討 論

3.1 獼猴桃種質(zhì)資源的遺傳多樣性

研究獼猴桃種質(zhì)資源的DNA遺傳變異是獼猴桃遺傳改良和雜交育種的基礎(chǔ)，可以為親本選配和種質(zhì)資源的保護提供指導(dǎo)。在遺傳多樣性研究中，多態(tài)性是評價遺傳多樣性的重要依據(jù)之一。在本研究中，利用SRAP標(biāo)記分析32份獼猴桃種質(zhì)資源，結(jié)果表明，用于統(tǒng)計的12對引物共擴增出191個條帶，多態(tài)性條帶186個，多態(tài)性位點百分率(PPL值)高達(dá)97.38%，此結(jié)果略低于井趙斌等[2]在獼猴桃中獲得的100%的檢測結(jié)果，但高于前人利用其他分子標(biāo)記在獼猴桃相關(guān)研究中的檢測結(jié)果[1,17-19]，也與前人利用SRAP技術(shù)在其他植物中的研究結(jié)果[12,20]一致。多態(tài)性信息量(PIC)也是衡量引物多態(tài)性信息量水平的重要指標(biāo)[21]。在本研究中，12對SRAP引物的PIC平均值為0.893 3，說明本試驗篩選的引物具有很高的多態(tài)性，可以有效地用于獼猴桃的遺傳多樣性分析。同樣，本研究結(jié)果還顯示，觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s 基因多樣性(H)和 Shannon 信息指數(shù)(I)分別為1.969 0、1.400 6、0.221 0和0.387 9，也處于較高水平。同時，32個獼猴桃品種間的遺傳相似系數(shù)(GS)在0.565 0至0.968 4之間，變幅達(dá)0.403 4。上述結(jié)果表明，供試品種(系)間存在較豐富的遺傳多樣性。通過對多態(tài)性信息量(PIC)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s 基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon’s 信息指數(shù)(I)4個主要的遺傳多樣性參數(shù)進行非參數(shù)Kruskal Wallis Test獨立樣本檢驗，發(fā)現(xiàn)32個獼猴桃品種(系)間遺傳多樣性水平存在顯著差異，具有較為豐富的遺傳變異。另外，利用POPGENE1.32軟件分析得知，在獼猴桃的4個種間基因流(Nm)為0.476 5，說明種間基因交流頻率較低。遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.512 0，種間遺傳變異水平(占總變異的51.20%)略高于種內(nèi)，而分子方差分析(AMOVA)結(jié)果表明，種間遺傳變異水平占總變異的51.87%，兩者分析結(jié)果一致。

1～32供試獼猴桃材料見表1。圖3 32份獼猴桃種質(zhì)資源的DNA指紋圖譜Fig.3 DNA fingerprints of 32 Actinidia germplasm based on SRAP marker

3.2 獼猴桃種質(zhì)資源的聚類分析

聚類分析結(jié)果表明，在遺傳相似系數(shù)(GS)為0.77處可將32份獼猴桃種質(zhì)材料分為4組。在第1組的21份獼猴桃種質(zhì)材料中，包含了10份美味獼猴桃材料和11份中華獼猴桃材料。這兩類獼猴桃并未完全各自聚類，而是出現(xiàn)了少數(shù)材料的互插現(xiàn)象。例如，中華獼猴桃湘吉紅和美味獼猴桃聚在了一起，而美味獼猴桃金碩聚在了中華獼猴桃內(nèi)。這種現(xiàn)象進一步說明中華獼猴桃和美味獼猴桃遺傳關(guān)系的復(fù)雜性。在早期的研究中，很多學(xué)者認(rèn)為美味獼猴桃是中華獼猴桃的變種，這兩個物種為遺傳近緣種，有極高的遺傳相似性[22]。賈兵等[18]認(rèn)為可將中華獼猴桃和美味獼猴桃歸為同一個種。第2組的華特和第3組華特♂均為毛花獼猴桃，各自成為一組，沒有聚在一起。華特和華特♂均為野生選種，不屬于一個姊妹系，兩者未能聚在一組，可能與此有關(guān)，也可能與分子標(biāo)記本身的局限性有關(guān)。第4組共9份材料，均為軟棗獼猴桃系列，聚為一組。因此，32份獼猴桃種質(zhì)材料基本按種的類別各自聚類，與獼猴桃的傳統(tǒng)分類相吻合。本研究的SRAP聚類分析結(jié)果還顯示，美味獼猴桃金魁及其雄株首先聚類，在所有被測材料中親緣關(guān)系最近，軟棗獼猴桃的紅寶石星及其雄株雖沒有首先聚類，但也表現(xiàn)了很近的親緣關(guān)系，與龔俊杰的研究結(jié)果[23]類似。另外，從品種選育來源分析，供試的軟棗獼猴桃中，魁綠和桓優(yōu)一號均為來源于東北地區(qū)的綠肉軟棗獼猴桃，首先聚類；紅寶石星及其雄株和華紅2號均為來源于河南伏牛山地區(qū)的紅肉軟棗獼猴桃，聚在一起。美味獼猴桃中，中獼2號獼猴桃母本為米良1號[24]，因此二者優(yōu)先聚類；皖翠是海沃德自然芽變品種[25]，而布魯諾和海沃德都是來源于新西蘭人1904年從湖北宜昌引種的一批種子[26]，三者聚在了一起。這些結(jié)果都體現(xiàn)出部分供試材料的地域一致性來源特征。同時，本研究也對中華獼猴桃、美味獼猴桃、軟棗獼猴和毛花獼猴桃4個種間遺傳關(guān)系進行了比較分析，結(jié)果顯示，中華獼猴桃與美味獼猴桃親緣關(guān)系最近，GS值高達(dá)0.968 4。相對于軟棗獼猴桃，毛花獼猴桃與中華獼猴桃和美味獼猴桃的親緣關(guān)系更近，與聚類結(jié)果相一致。

3.3 獼猴桃種質(zhì)資源鑒定與DNA指紋圖譜構(gòu)建

分子標(biāo)記具有高效、快捷、不受環(huán)境因子和時空條件影響等優(yōu)點，已成為植物品種特別是那些表型極為相似的品種鑒定不可或缺的方法。SRAP標(biāo)記技術(shù)自問世以來就在植物品種鑒定和DNA指紋圖譜構(gòu)建方面有諸多成功應(yīng)用。劉君等[27]利用2對SRAP引物構(gòu)建了9個狗牙根品種的指紋圖譜，依據(jù)該圖譜可以將9個狗牙根品種進行鑒別；徐宗大等[28]利用3對SRAP引物構(gòu)建了玫瑰品種的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，為4份野生玫瑰種質(zhì)和46個玫瑰品種的鑒定提供了有力證據(jù)。本研究利用4個SRAP引物擴增的15個多態(tài)性位點構(gòu)建了32份獼猴桃種質(zhì)材料的DNA指紋圖譜,每份材料都有唯一的指紋圖譜，為獼猴桃種質(zhì)鑒別提供了重要的科學(xué)方法。

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