祁姣姣，朱劍鋒，周海泳，胡學(xué)生，王 創(chuàng)，劉紫芊，胡文鋒，*

（1. 生物源生物技術(shù)（深圳）股份有限公司，深圳 518118；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣州 510642）

抗生素在動(dòng)物生產(chǎn)應(yīng)用中長(zhǎng)期大量濫用，可造成動(dòng)物機(jī)體免疫力下降[1]，在畜產(chǎn)品和環(huán)境中造成殘留[2]，甚至導(dǎo)致人畜共患耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生等嚴(yán)重后果，嚴(yán)重地危害著人類健康[3]。2016年7月26日的我國(guó)農(nóng)業(yè)部第2428號(hào)公告：決定停止硫酸黏菌素用于動(dòng)物促生長(zhǎng)[4]。在飼料中限制甚至禁用抗生素是消費(fèi)者的要求，是全球大趨勢(shì)，為適應(yīng)這一需求，積極開發(fā)可替代抗生素的綠色飼料添加劑具有積極的意義。中鏈脂肪酸（mediumchain fatty acids ， MCFAs）包括己酸（C6）、辛酸（C8）、癸酸（C10）和月桂酸（C12），其在動(dòng)物體內(nèi)因其獨(dú)特的消化、吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和氧化等特點(diǎn)，能迅速有效地為幼小動(dòng)物提供能量，具有顯著的抗菌和促生長(zhǎng)等功效[5]。另外，天然植物精油具有顯著的抑菌活性、廣譜抗菌性以及安全、易降解等特點(diǎn)。

目前大量學(xué)者對(duì)肉桂醛、百里香酚、丁香酚、香芹酚等植物精油主要成分的抑菌性能、相互抑菌協(xié)同作用以及其抑菌機(jī)制進(jìn)行探究。發(fā)現(xiàn)其具有高抑菌活性，但是將其和中鏈脂肪酸配合作為高效的復(fù)合型飼料酸化劑未見(jiàn)報(bào)道。為此，本試驗(yàn)以大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌等3種菌為指示菌，利用正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，得到抑菌性能最優(yōu)的復(fù)合型酸化劑，并對(duì)其抑菌性能進(jìn)行探討。試驗(yàn)旨在為探究替代抗生素促生長(zhǎng)劑的高效的復(fù)合型酸化劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

己酸（C6， 80%）、辛酸（C8， 80%）：河南雅大食品有限公司 ；癸酸（C10， 分析純）、月桂酸（C12， 分析純）：成都化夏化學(xué)試劑有限公司；肉桂醛（99%）：江西雪松天然藥用油有限公司提供；吐溫-80：廣州化學(xué)試劑廠；無(wú)水乙醇：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；香芹酚（分析純）：廣州日化化工有限公司；百里香酚（分析純）：吉安市青原區(qū)東方天然香料油提煉廠；丁香酚（分析純）：日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社。

1.1.2 培養(yǎng)基及菌種

指示菌：大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院應(yīng)用微生物教研室提供。

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：取牛肉膏3 g、蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，加水1 000 mL加熱，調(diào)節(jié)pH至7.0-7.2，分裝到三角瓶中。密封，121 ℃，0.1 mpa滅菌20 min。如需配置固體培養(yǎng)基則加入2%瓊脂，操作同上。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

LS-B75C-I立式壓力蒸汽滅菌鍋，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；HK-C2S型單人雙面垂直潔凈工作臺(tái)，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；酶標(biāo)儀，PE公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抗菌劑溶液的配制

稱取一定量的抗菌劑分別溶于0.5%（v/v）無(wú)水乙醇，然后加入含0.5%（w/v）吐溫-80的無(wú)菌液體，邊倒邊攪拌，震蕩均勻。其中乙醇含量0.5%，吐溫-80含量0.5%，在該濃度下，二者通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)證明均無(wú)抑菌性[6]。

1.2.2 復(fù)合型抗菌劑配方的初步篩選

根據(jù)李成應(yīng)等篩選中藥制劑的方法，略有改動(dòng)[7]。按L8（27）正交表(表1)和表2的劑量水平添加配置成相應(yīng)的8種抗菌劑溶液的母液，調(diào)節(jié)母液的濃度為2 000 μg/mL。將復(fù)配好的8種抗菌劑的母液，分別加入到無(wú)菌的96孔聚苯乙烯板中，其中第2至第12孔每孔加入100 μL無(wú)菌牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，第1、2孔加100 μL抗菌劑液，混合均勻，從第2孔中吸取100 μL到第3孔，以此類推，第11孔吸取100 μL棄掉，然后分別在第1到12孔加入100 μL105CFU/mL菌液，此時(shí)各孔對(duì)應(yīng)的組合抗菌劑配方的濃度依次為1 000 μg/mL、500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL、62.5 μg/mL、31.25 μg/mL、15.6 μg/mL、7.8 μg/mL、3.9 μg/mL等，將96孔板密封后置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h后測(cè)定OD600nm值。重復(fù)3次，取平均值，選取適當(dāng)組合抗菌劑配方的濃度所對(duì)應(yīng)的OD600nm值，進(jìn)行極差分析。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照和抗生素對(duì)照。

1.2.3 復(fù)合型抗菌劑配方的優(yōu)化

根據(jù)1.2.2的初篩結(jié)果，采用正交表L25（56）組合(表3)，進(jìn)一步做抗菌劑的優(yōu)化組合探究。各抗菌劑劑量水平設(shè)置見(jiàn)表4，方法同1.2.2。培養(yǎng)一定時(shí)間，測(cè)定OD600nm值。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照和抗生素對(duì)照組。重復(fù)3次，取平均值，選取適當(dāng)抗菌劑組合的濃度所對(duì)應(yīng)的OD600nm值，進(jìn)行極差分析。劑量?jī)?yōu)化后的最優(yōu)組合為抗菌基礎(chǔ)配方。

1.2.4 復(fù)合型抗菌劑最優(yōu)配方的驗(yàn)證將直觀最優(yōu)組合和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的最優(yōu)組合按表4的劑量水平配置成相應(yīng)母液，調(diào)節(jié)母液的濃度為2 000 μg/mL。按照1.2.2方法，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

1.3 復(fù)合型酸化劑抑菌性能研究

1.3.1 復(fù)合型酸化劑抑菌敏感性測(cè)定

采用打孔法。吸取100 μL 107CFU/mL指示菌的菌懸液于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿中，涂布均勻。利用8 mm無(wú)菌打孔器打孔。然后在每個(gè)孔中分別加入100 μL的對(duì)應(yīng)濃度（0.5%）的復(fù)合型酸化劑溶液。于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h，取出，測(cè)定其抑菌圈大小。同時(shí)做空白對(duì)照。

1.3.2 復(fù)合型酸化劑最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定

采用瓊脂平板稀釋法：將不同劑量的復(fù)合型酸化劑液10 mL，加入50 ℃左右的10 mL牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中，震蕩均勻，迅速傾倒平板，制成含不同遞減濃度的試劑平板。用無(wú)菌接種器，接種指示菌，最終每點(diǎn)菌數(shù)約為104CFU，形成直徑為5～8 mm的菌斑。將平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h，觀察。以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的瓊脂平板所含最低樣品濃度為MIC。同時(shí)做抗生素和陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次

1.3.3 最優(yōu)復(fù)合型酸化劑熱穩(wěn)定性研究

綜合考慮正交實(shí)驗(yàn)的直觀和優(yōu)化結(jié)果分析以及抑菌敏感性、MIC的比較，選定最優(yōu)復(fù)合型酸化劑組合做以下探究。將最優(yōu)組合分別于60 ℃、80 ℃、100 ℃水浴，121℃濕熱條件下處理15 min后[8]，然后分別再加入100 μL菌液，使最終菌液的濃度為105CFU/mL，試劑的濃度為250 μg/mL。然后置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測(cè)定OD600nm值。同時(shí)做不加抗菌劑的陰性對(duì)照和空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，觀察最優(yōu)抗菌劑組合在熱環(huán)境中對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌抑菌變化規(guī)律。

表1 L8（27）正交表

表2 各抗菌劑量水平設(shè)置

表3 L25（56）正交表

1.3.4 最優(yōu)復(fù)合型酸化劑抑菌時(shí)效的測(cè)定

將最優(yōu)組合配置成濃度為0.5%的復(fù)合液，取100 μL加入到已涂布菌液的平板中的孔內(nèi)，分別于24、48、72、144、216 h，觀察并測(cè)定抑菌圈直徑。

1.3.5 最優(yōu)復(fù)合型酸化劑在人工模擬胃、腸液環(huán)境中抑菌效能評(píng)價(jià)

1）最優(yōu)復(fù)合型酸化劑在人工模擬胃液環(huán)境中的抑菌特性

在人工胃液環(huán)境中分別加入最優(yōu)組合溶液和指示菌液，使指示菌最終濃度是105CFU/mL，最優(yōu)組合溶液的最終濃度為500 μg/mL，37 ℃，90 r/min[9]處理4 h，然后采用十倍稀釋法涂布計(jì)數(shù)[9]。同時(shí)做指示菌純培養(yǎng)4 h后的活菌計(jì)數(shù)，然后計(jì)算殺菌率。按上述同樣操作，測(cè)定指示菌在非人工胃液的配方試劑環(huán)境中（即pH7.0，用生理鹽水配置的最優(yōu)組合配方液）的殺菌率，并進(jìn)行比較。

殺菌率的計(jì)算公式如下：

2）最優(yōu)復(fù)合型酸化劑在人工模擬腸液環(huán)境中的抑菌特性

在人工腸液環(huán)境中，分別加入最優(yōu)組合和指示菌，指示菌最終濃度是105CFU/mL，最優(yōu)組合溶液的最終濃度為500 μg/mL，37 ℃，120 r/min處理4 h，然后十倍稀釋法涂布計(jì)數(shù)，同時(shí)做指示菌純培養(yǎng)4 h后的活菌數(shù)，然后計(jì)算殺菌率[9]。同時(shí)按上述同樣操作，測(cè)定在非人工腸液的配方試劑環(huán)境中（pH7.0，用生理鹽水配置的最優(yōu)組合配方）指示菌的殺菌率，并進(jìn)行比較，公式如上所示。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值（mean）±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示。數(shù)據(jù)圖、表由Excel2003軟件完成。

3 結(jié)果與分析

3.1.1 復(fù)合型酸化劑配方初步篩選結(jié)果

表4 優(yōu)選因素劑量水平設(shè)置

表5 各組合方案抗3種指示菌作用正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6 各組合配方抗3種指示菌正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5可知，抗大腸桿菌的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，主次因素依次為：肉桂醛＞己酸＞辛酸＞香芹酚＞癸酸＞百里香酚＞丁香酚；抗沙門氏菌的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，主次因素依次為：肉桂醛＞己酸＞辛酸＞香芹酚＞癸酸＞丁香酚＞百里香酚；抗金黃色葡萄球菌正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，主次因素依次為：肉桂醛＞癸酸＞香芹酚＞丁香酚＞百里香酚＞己酸＞辛酸。

綜合考慮，優(yōu)化組合肉桂醛1、香芹酚1、癸酸1、辛酸1、己酸1、百里香酚2、丁香酚1。即因素肉桂醛、香芹酚、癸酸、辛酸、己酸、丁香酚均取1水平，因素6取2水平。該組合能同時(shí)較優(yōu)地抑制大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌。

3.1.2 復(fù)合型酸化劑配方的確定

由表6可知，對(duì)大腸桿菌抑菌的直觀分析最優(yōu)組合號(hào)為4、7、8、11、21、22、25；對(duì)沙門氏菌抑菌的直觀分析最優(yōu)組合號(hào)為8、11、18、22；對(duì)金黃色葡萄球菌的直觀分析最優(yōu)組合號(hào)為8、21。由表6和表7可知，對(duì)大腸桿菌，影響其抑菌作用的主次因素依次為：肉桂醛＞辛酸＞丁香酚＞己酸＞癸酸＞香芹酚。其中肉桂醛對(duì)其具有顯著性影響（P＜0.05）。最優(yōu)組合為：2辛酸，1香芹酚，4癸酸，5肉桂醛，（3、4、2）丁香酚，1己酸；對(duì)沙門氏菌，影響其抑菌作用的主次因素依次為：肉桂醛＞癸酸＞丁香酚＞香芹酚＞辛酸＞己酸。其中肉桂醛、癸酸、丁香酚對(duì)其具有顯著性影響（P＜0.05）。最優(yōu)組合為：3（2、4）辛酸，3（1、2）香芹酚，1（2）癸酸，5肉桂醛，1（2）丁香酚，2（5、1）己酸；對(duì)金黃色葡萄球菌，影響其抑菌作用的主次因素依次為：己酸＞肉桂醛＞丁香酚＞癸酸＞香芹酚＞辛酸。其中己酸、肉桂醛、丁香酚對(duì)其具有顯著性影響（P＜0.05）。最優(yōu)組合為：4（3、5）辛酸，1香芹酚，5癸酸，5肉桂醛，（2、3、1）丁香酚，2己酸。

以上對(duì)表6與表7分析可知，直觀分析能同時(shí)抗三種指示菌的最優(yōu)組合號(hào)為8，其次為11、22，最后為19。綜合分析能同時(shí)抗三種指示菌的優(yōu)化組合為0：2辛酸、1香芹酚、1癸酸、5肉桂醛、2丁香酚、2己酸

表7 各組合配方抗3種指示菌正交實(shí)驗(yàn)方差分析

表8 正交驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表9 復(fù)合型酸化劑對(duì)指示菌抑菌圈測(cè)定結(jié)果

表10 復(fù)合型酸化劑對(duì)指示菌的MIC

3.1.3 優(yōu)化配方結(jié)果驗(yàn)證

由表8可知，濃度為250 μg/mL時(shí)，對(duì)沙門氏菌和大腸桿菌，0號(hào)組合較8號(hào)組合抑制效果好，特別是對(duì)沙門氏菌的抑制作用，0號(hào)組合明顯強(qiáng)。然而在抑制金黃色葡萄球菌時(shí)，0號(hào)組合較8號(hào)組合稍弱。這可能是因?yàn)?，在選擇對(duì)三種指示菌同時(shí)具有抑制作用的最優(yōu)組合的因素時(shí)，是經(jīng)過(guò)綜合評(píng)價(jià)并優(yōu)先選擇對(duì)革蘭氏陰性菌具有很好抑制作用的結(jié)果。

3.2 復(fù)合型酸化劑抑菌性能測(cè)定結(jié)果

3.2.1 復(fù)合型酸化劑抑菌敏感性測(cè)定結(jié)果

表9可知，這5種組合對(duì)3種指示菌均具有不錯(cuò)的抑制效果，在濃度為0.5%時(shí)，8號(hào)組合對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈最大為31.49 mm，其次為0號(hào)組合。就大腸桿菌和沙門氏菌而言，0號(hào)組合較8號(hào)組合更優(yōu)，其次為8號(hào)組合。

3.2.2 復(fù)合型酸化劑最低抑菌濃度測(cè)定結(jié)果

由表10可知：各抑菌組合對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌3種指示菌的MIC。可以發(fā)現(xiàn)，正交優(yōu)化最優(yōu)組合配方0號(hào)和直觀最優(yōu)組合配方8號(hào)，以及11、19、22號(hào)組合，對(duì)3種指示菌的MIC值都明顯高于硫酸新霉素、黃霉素的MIC值。即便如此，該組合仍具有一定的現(xiàn)實(shí)意義，比如0號(hào)組合的抑菌性良好，且由中鏈脂肪酸和植物精油構(gòu)成，在兼具抑菌性能的同時(shí)，對(duì)動(dòng)物可以產(chǎn)生一定的誘食性，且其安全、無(wú)毒。

3.2.3 優(yōu)化組合復(fù)合型酸化劑熱穩(wěn)定性研究結(jié)果

如圖1所示，隨著處理溫度的上升，其對(duì)3種指示菌的抑菌性能均為先上升后下降。具體為，對(duì)于大腸桿菌，在4（60 ℃）其具有最佳抑菌效果；在5（100 ℃）和6（121 ℃）中，隨著處理溫度的升高，其對(duì)大腸桿菌的抑菌效果降低，特別是處理6（121 ℃），相對(duì)于1（陰性對(duì)照），其經(jīng)121℃濕熱處理后，基本失去對(duì)大腸桿菌的抑制作用。對(duì)于沙門氏菌，其經(jīng)3（60 ℃）處理后對(duì)沙門氏菌的抑菌效果增加；在4（80 ℃）、5（100 ℃）、6（121 ℃）中，隨著處理溫度的升高，其對(duì)沙門氏菌的抑菌效果降低。對(duì)金黃色葡萄球菌，最優(yōu)組合配方經(jīng)3（60 ℃）處理后，其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果顯著增加；在4（80 ℃）、5（100 ℃）、6（121 ℃）中，相對(duì)于2（常溫），隨著處理溫度的升高，其對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果降低。特別是最優(yōu)組合配方經(jīng)6（121 ℃）處理后，相對(duì)于陰性對(duì)照，此時(shí)，其對(duì)金黃色葡萄球菌幾乎無(wú)抑制作用。

圖1 溫度對(duì)最優(yōu)復(fù)合型酸化劑抑菌的影響

隨著處理溫度的升高，最優(yōu)組合配方對(duì)指示菌的抑菌效果先增加，這可能與體系構(gòu)成的復(fù)雜度有關(guān)(成分復(fù)雜、微乳化環(huán)境)，適當(dāng)加熱處理后，體系結(jié)構(gòu)可能發(fā)生有利于配方溶液抑制指示菌方向的變化。隨后，隨著處理溫度的繼續(xù)升高，其對(duì)指示菌的抑菌效果降低，甚至是消失，這可能是因?yàn)殡S著進(jìn)一步的高溫處理后，復(fù)配液中抗菌劑成分遭到破壞或者揮發(fā)。綜合最優(yōu)組合配方隨著溫度的變化對(duì)三種指示菌抑菌的變化規(guī)律推測(cè)，其經(jīng)60 ℃密封加熱處理，有利于最優(yōu)組合配方對(duì)3種指示菌同時(shí)發(fā)揮較好的抑菌作用。

3.2.4 最優(yōu)復(fù)合型酸化劑抑菌時(shí)間的測(cè)定

該最優(yōu)組合復(fù)配液對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌圈在長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)中變化不大。分別從24 h測(cè)得的27.36 mm變至25.22 mm，17.45 mm變至14.04 mm，16.12 mm變至14.57 mm。其抑菌效果能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)發(fā)揮作用，指示菌不易回長(zhǎng)。

3.2.5 最優(yōu)復(fù)合型酸化劑在模擬胃、腸液環(huán)境中抑菌效能評(píng)價(jià)

如表11所示，最優(yōu)組合配方在模擬胃液環(huán)境中對(duì)指示菌作用4 h后，仍能將金黃色葡萄球菌和沙門氏菌全部殺死，而其在此環(huán)境中對(duì)大腸桿菌的抑菌效果有所下降，但是其殺菌率仍能達(dá)到95.6%，仍具有較好的抑菌性能。其在人工模擬腸液環(huán)境中對(duì)指示菌作用4 h后，仍能將金黃色葡萄球菌全部殺死，而其在此環(huán)境中對(duì)沙門氏菌、大腸桿菌的抑菌能力有所下降，但是其殺菌率仍分別能達(dá)到93.8%、98.24%，仍具有較好的抑菌性能。

4 結(jié)論

1)通過(guò)對(duì)樣品的篩選，利用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，篩選出抑菌劑的最佳優(yōu)化配比為0號(hào)組合，即辛酸∶香芹酚∶癸酸∶肉桂醛∶丁香酚∶己酸=2∶1∶1∶5∶2∶2，直觀最優(yōu)配比組合為8號(hào)組合，即辛酸∶香芹酚∶癸酸∶肉桂醛∶丁香酚∶己酸=2∶3∶4∶5∶1∶2。

表11 最優(yōu)組合配方在人工模擬胃液、人工模擬腸液環(huán)境中抑菌效能評(píng)價(jià)%

2)0號(hào)和8號(hào)組合對(duì)3種指示菌均有很好的抑制作用。最優(yōu)配方0號(hào)組合，隨著溫度的升高，其抑菌能力先上升后下降。其能在較長(zhǎng)時(shí)間（216 h）內(nèi)發(fā)揮抑菌作用，指示菌不易回長(zhǎng)。其在模擬胃、腸液環(huán)境中仍具有很強(qiáng)的抑菌能力，在模擬胃液環(huán)境中，其可以100%殺滅金黃色葡萄球菌和沙門氏菌，對(duì)大腸桿菌的殺菌率為95.6%；其在模擬腸液環(huán)境中對(duì)三者的殺菌率依次為，100%、93.8%、98.24%等。

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