傅躍青 俞忠明 單云崗

畬藥山里黃根為茜草科植物梔子（Gardenia jasminoides Ellis）的干燥根，具有清熱、涼血、解毒作用[1]，在浙江、福建、廣東、廣西、湖南等地應(yīng)用極廣，主要用于乙型、丙型病毒性肝炎、肝炎等病癥的治療，有較好的開發(fā)利用前景[2-3]。四氯化碳（CCl4）是一種強(qiáng)烈的能夠引起肝細(xì)胞壞死的化合物，一直被研究者用來誘發(fā)各種肝損傷模型，利用肝損傷以后藥物對于肝細(xì)胞的作用以闡明實(shí)驗(yàn)藥物的肝毒性機(jī)制或肝損傷保護(hù)機(jī)制[4-7]。含有山里黃根的中藥制劑在治療肝病方面的療效尤為顯著[8]，對損傷的肝細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。我們通過山里黃根不同極性萃取部位的對水提液CCl4體外誘導(dǎo)L-02肝細(xì)胞損傷模型的保護(hù)作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，采用MTT法[9-11]測定細(xì)胞OD值并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞存活率，作為判斷山里黃根不同極性萃取部位水提液對于CCl4體外誘導(dǎo)L-02肝損傷作用的重要指標(biāo)，從而初步篩選出具有肝保護(hù)作用的藥物有效部位。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及培養(yǎng)條件 實(shí)驗(yàn)用肝細(xì)胞株：L-02人正常肝細(xì)胞，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)研究中心提供，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM中，均在37℃，5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，2～3d傳一代，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物及主要試劑 山里黃根采自浙江麗水市蓮都區(qū)天堂山，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)陳錫林教授鑒定。陽性對照藥：聯(lián)苯雙酯片（浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠，批號150601）。CCl4（中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司，批號：W20150513）；石油醚（杭州石化有限責(zé)任公司，批號20150704）；乙酸乙酯（杭州雙林化工試劑廠，批號20150515）；正丁醇（杭州雙林化工試劑廠，批號20150508）；DMEM培養(yǎng)液（南京凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司，批號20150318）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號20150207）；0.25%胰酶-EDTA溶液（南京凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司，批號 20150210）；二甲基亞砜（DMSO，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，批號20151205）；細(xì)胞級（DMSO，美國 Sigma公司，批號 GNM25200）；DHank’s液（南京凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司，批號20151211）；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT,美國Sigma公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 細(xì)胞培養(yǎng)板（美國Corning Costar公司）；細(xì)胞培養(yǎng)瓶（美國Corning Costar公司）；311型 CO2培養(yǎng)箱（Thermo Electron Corporation，USA）；TD4臺式低速離心機(jī)（鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠）；SO9001電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；Power Wave X340 BIO-TEK酶標(biāo)儀（美國BIO-TEK儀器有限公司）；高壓滅菌鍋（上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司）；HWS24電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器設(shè)備有限公司）；移液槍（德國Eppendorf公司）；Eclipse TS100/100-F倒置顯微鏡（日本Nikon）；Phs-3E Ph計(jì)（上海精科有限公司）；DEF-6050真空干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.4 主要試劑的配制 （1）DMEM培養(yǎng)基：分別將DMEM干粉40.2g、NaHCO311.1g、青霉素G鈉鹽30萬IU、硫酸鏈霉素0.3g溶于3000mL雙蒸水中，置磁力攪拌器上使其全部溶解，用0.22μm濾膜過濾除菌，-20℃保存，用前 37℃融化，置 4℃?zhèn)溆?；?）0.25%胰蛋白酶：將0.25g胰蛋白酶用D-Hank’s液溶解，定容至100mL，置磁力攪拌器上使其全部溶解，用5.6%NaHCO3調(diào)整pH值在7.2～7.6之間，用0.22μm濾膜過濾除菌，分裝成5mL/瓶，-20℃保存，用前室溫融化，置4℃?zhèn)溆茫唬?）PBS：分別精密稱取0.20g KCl，0.24g KH2PO4，8.0g NaCl，3.58g Na2HPO4·12H2O，將以上試劑溶于適量雙蒸水中，置磁力攪拌器上使其全部溶解，定容至1000mL，NaOH調(diào)整pH值為7.2，高壓蒸氣滅菌，放冷后置4℃?zhèn)溆茫唬?）MTT溶液：精密稱取MTT 0.5g，用無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成5mg/ml的溶液，用0.22μm濾膜過濾除菌，放4℃鋁箔紙包住避光保存。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 山里黃根水提液的四個(gè)不同極性部位的提取

（1）工藝路線如下：將山里黃根干燥藥材粉碎成粗粉（過2號篩），稱取，加入蒸餾水，加熱回流提取2次，料液比分別為1:20和1:10，每次1h，過濾，合并濾液，減壓濃縮至黏稠狀。分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取至無色，將萃取物及萃取后剩余水層減壓抽濾回收溶劑，分別放入真空干燥箱中加壓干燥成干膏，分別得到石油醚組、乙酸乙酯組、正丁醇組、剩余部位組。重復(fù)以上步驟，提取濃縮干燥成干膏，得到總提取物組。精密稱量，計(jì)算以上5種干膏得率。（2）細(xì)胞液培養(yǎng)：用胎牛血清配制成含12%胎牛血清的的高糖DMEM培養(yǎng)液溶解，及20%胎牛血清的的高糖DMEM培養(yǎng)液。

2.2 L-02肝細(xì)胞的培養(yǎng) （1）傳代培養(yǎng)：將L-02肝細(xì)胞株凍存管從-80℃超低溫冰箱中取出，立即放入37℃水浴鍋中，持續(xù)搖晃，將冷存液速度融化，馬上加入到10倍體積含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中（已提前于37℃預(yù)溫），顛倒混勻，離心，棄上清，將沉淀細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重新懸浮，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，細(xì)胞長滿后，胰酶消化，傳代備用。（2）鋪板：將處于對數(shù)生長期的L-02肝細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化，然后用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基懸浮，用玻璃管輕輕吹打成單細(xì)胞懸液，倒置顯微鏡下用細(xì)胞計(jì)數(shù)板技數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL。將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔 100μL，置于 5%CO2培養(yǎng)箱（37℃）內(nèi)培養(yǎng)24h。

2.3 CCl4損傷模型的建立 吸取CCl4溶于適量DMEM培養(yǎng)基中，以少量的二甲基亞砜助溶，二甲基亞砜終濃度為0.1%（V/V），配成終濃度分別為0.625、1.25、2.5、5、10、20、40mmol/L 的 CCl4溶液。加入到細(xì)胞貼壁后的96孔板中，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔（需要經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)，通過細(xì)胞抑制率結(jié)果，確定一定的濃度范圍，以確定造模的成功性）。

2.4 MTT檢測 培養(yǎng)24h后，倒掉培養(yǎng)基，PBS洗板1次，每孔加入100μL終濃度為0.5mg/mL的MTT溶液，無血清培養(yǎng)基稀釋。培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h后，倒掉MTT溶液，每孔加入150μL二甲基亞砜，充分震蕩15min，于酶標(biāo)儀570nm處檢測OD值（需要預(yù)實(shí)驗(yàn)，通過實(shí)驗(yàn)確定山里黃根水提液與MTT不反應(yīng)）。

2.5 計(jì)算公式 各平行孔取均值后計(jì)算，公式如下：細(xì)胞相對存活率計(jì)算：（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%；細(xì)胞相對抑制率計(jì)算：1-（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。

2.6 實(shí)驗(yàn)分組 正常對照組，使用時(shí)用無胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液溶解，加入細(xì)胞級DMSO助溶，用0.22μm濾膜過濾除菌，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔加入細(xì)胞液。模型組，終濃度為5mmol/L CCl4，方法參照上文CCl4損傷模型的建立。乙酸乙酯+CCl4造模實(shí)驗(yàn)組，使用時(shí)用無胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液溶解，加入細(xì)胞級DMSO助溶，用0.22μm濾膜過濾除菌，加入到CCl4損傷細(xì)胞液中，使藥液在96孔板中的終濃度為 100、300、600、1200、2400μg/mL。37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。正丁醇+CCl4造模實(shí)驗(yàn)組、剩余部位+CCl4造模實(shí)驗(yàn)組、總提取物+CCl4造模實(shí)驗(yàn)組方法同正丁醇+CCl4造模實(shí)驗(yàn)組陽性對照組（聯(lián)苯雙脂片），用無胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液溶解，加入細(xì)胞級二甲基亞砜助溶，用0.22μm濾膜過濾除菌，加入到CCl4損傷細(xì)胞液中，使藥液在96孔板中的終濃度為 5、10、20、30、40μg/mL。37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24h。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0分析應(yīng)用軟件處理分析數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以（x±s）表示。各組間比較均采用單因素方差分析，組間樣本比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 山里黃根水提液不同萃取部位干膏得率 精密稱取山里黃根干燥根粗粉（過2號篩）200g，按照上文2.1（1）項(xiàng)的方法提取分離干燥后，所得干膏得率如表1所示。由于石油醚萃取部位所得干膏比較少，不足以實(shí)驗(yàn)使用，所以后面的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)把石油醚部位棄去。

3.2 CCl4損傷L-02肝細(xì)胞模型的建立 CCl4濃度在0.5～40.0mmol范圍內(nèi)，隨CCl4濃度增加，L-02肝細(xì)胞存活率降低。擬合細(xì)胞存活抑制率與CCl4劑量的量效關(guān)系曲線（圖1），可以清晰看出濃度越高抑制率越高，即存活率越低。研究表明，細(xì)胞存活率在50%～60%之間，可很好地顯示CCl4肝細(xì)胞的損傷與保護(hù)作用的差異。通過表2我們發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，CCl4濃度為5mmol/L時(shí)，MTT法檢測OD值，得到肝細(xì)胞的抑制率為51.98%，細(xì)胞存活率為48.02%。因此，實(shí)驗(yàn)選取5mmol/L CCl4作用24h作為L-02肝細(xì)胞損傷模型的造模劑量。

表1 山里黃根水提液不同萃取部位干膏得率

圖1 CCl4不同濃度對L-02肝細(xì)胞抑制率的影響

表2 不同濃度CCl4對細(xì)胞增殖的影響（x±s）

3.3 山里黃根水提液不同萃取部位對CCl4造模細(xì)胞增殖的影響及有效部位的確定 根據(jù)上述各部位提取物L(fēng)D1和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)提取物設(shè)定5～6個(gè)劑量，篩選對CCl4損傷L-02肝細(xì)胞具有保護(hù)作用的部位。結(jié)果表明：用MTT法檢測山里黃根水提液不同萃取部位及總提取物對CCl4造模細(xì)胞增殖的作用，不同部位呈現(xiàn)了抑制或者促進(jìn)作用（見表3）。其中對細(xì)胞有促進(jìn)作用的是正丁醇提取部位，在600、1200、2400μg/mL濃度時(shí)對細(xì)胞有明顯的促進(jìn)生長作用且有意義（P＜0.05），即細(xì)胞存活率升高。在1200μg/mL濃度時(shí)總提取部位對細(xì)胞生長也有促進(jìn)作用，可以表明山里黃根水提液對CCl4體外誘導(dǎo)L-02肝損傷有一定的保護(hù)作用，而保護(hù)作用明顯的是正丁醇部位。

表3 各組對CCl4損傷細(xì)胞存活率的影響（x±s）

4 討論

有效部位的篩選是研究藥物作用機(jī)制的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，是研究和開發(fā)新藥的必經(jīng)途徑。山里黃根水提液對損傷的肝細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，因此我們通過CCl4體外誘導(dǎo)L-02肝細(xì)胞損傷，而藥物作用可以使細(xì)胞生長或者凋亡，通過測定細(xì)胞數(shù)量的變化來初步篩選具有肝保護(hù)作用的藥物。目前檢測細(xì)胞數(shù)量變化的方法有很多，如同位素法、摻入法等都具有靈敏度高、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，但是由于步驟復(fù)雜需要特殊設(shè)備等，不能普遍使用。目前最常用的就是MTT法，該法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選以及細(xì)胞毒性試驗(yàn)等。

MTT方法具有靈敏度高、穩(wěn)定性好、操作簡單等特點(diǎn)。MTT法利用96孔板可簡便快捷規(guī)?；暮Y選藥物。其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。DMSO能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長（也可選擇570nm）處測定其光吸收值OD值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。所以缺點(diǎn)就是甲瓚影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。所以實(shí)驗(yàn)過程中，細(xì)胞點(diǎn)板時(shí)一定要吹打均勻，盡量減少誤差，千萬不能把藍(lán)紫色甲瓚結(jié)晶析出，否則會加大結(jié)果誤差。

畬藥山里黃根的干燥根作為新品種被收錄進(jìn)《浙江省中藥炮制規(guī)范》，并注明其功能為清熱、涼血、解毒，臨床上主要用于乙型、丙型病毒性肝炎、肝炎等病癥的治療，表現(xiàn)出較好的開發(fā)利用前景，值得關(guān)注并深入研究。

本研究采用系統(tǒng)溶劑法對山里黃根水提液進(jìn)行了不同極性部位的萃取，一共得到了四個(gè)部位，但是由于石油醚部位的干膏得率過低（0.042%），因此不能用于實(shí)驗(yàn)，考慮到藥物本身對于MTT的影響，實(shí)驗(yàn)前做了MTT法測山里黃根水提液，沒有反應(yīng)，所以實(shí)驗(yàn)中沒有設(shè)置藥物顏色對照組。

本研究以L-02細(xì)胞株建立CCl4損傷模型，測定了山里黃根不同部位提取物的毒性，明確了各提取物的安全劑量范圍，篩選出抗L-02細(xì)胞株CCl4損傷的有效部位——山里黃根水提液中正丁醇萃取部位，計(jì)算出ED50和TI。該提取物可提高CCl4損傷L-02細(xì)胞存活率，是山里黃根中具有保護(hù)肝損傷的有效部位。值得我們關(guān)注的是，正丁醇萃取部位600μg/mL時(shí)保護(hù)作用最好，隨著濃度的增大細(xì)胞存活率下降，所以可以判斷濃度與細(xì)胞存活率沒有依從關(guān)系，因此最適濃度是我們進(jìn)一步研究的問題之一。此外，總提取物組在濃度1200μg/mL時(shí)具有保護(hù)作用，可能由于相同濃度下正丁醇部位的成分含量少，所以細(xì)胞存活率相對較低。因此，在以后的研究中，我們將繼續(xù)考察正丁醇部位在藥物作用的不同時(shí)間，如藥物作用24、48、72h后，細(xì)胞存活率的變化。研究正丁醇部位對受損肝細(xì)胞保護(hù)作用與藥物作用時(shí)間變化的關(guān)系。該有效部位提取物抗CCl4損傷的機(jī)制以及在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮作用的具體機(jī)制仍需更進(jìn)一步的研究。

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