陳大清+鐘育海+李應(yīng)生

摘要：在硒鹽脅迫下通過(guò)根彎曲特性篩選獲得擬南芥（Arabidopsis thaliana）耐硒突變體，并以突變體為母本與野生型（Ler）雜交獲得基因型完全雜合的F1代；自交產(chǎn)生的F2代硒敏感，硒耐受的分離比為3∶1，表明該突變體是隱性單基因遺傳。F2代選出132株具有耐硒特性的植株作為圖位克隆的群體，從應(yīng)用SSLP和In/Del分子標(biāo)記進(jìn)行基因定位，通過(guò)分析目的基因與各分子標(biāo)記之間的連鎖關(guān)系，發(fā)現(xiàn)耐硒突變體基因位于第I號(hào)染色體F12P19和NGA111的分子標(biāo)記之間。

關(guān)鍵詞：擬南芥（Arabidopsis thaliana）；硒鹽脅迫；突變體；基因定位

中圖分類(lèi)號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2018）02-0115-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.02.029

Abstract： A selenate-torlerance arabidopsis mutant was obtained by using the root-bending trait under selenate stress. It was conformed that the selenate resistant characteristics could be steady inheritance. Then this mutant was crossed with the wild-type Ler. and F1 generation were created with heterozygous type completely. The F2 crossed by theirself were expressed the separation ratio of 3∶1 in response of sensitive selenium to resistent selenium，It were suggested that this mutant was a monogenic recessive mutation. Map-based cloning population were composed of the 132 selenate-tolerance seedlings in F2 generation. Using SSLP and In/Del based on PCR to preliminary chromosomal location. Through linkage analysis，it's indicated that this mutant gene was located on the chromosome I，which was mapped between molecular marker F12P19 and NGA111.

Key words： Arabidopsis thaliana； selenate stress； mutant； gene lacation

微量元素硒（Se）不僅是人、動(dòng)物和微生物的必需營(yíng)養(yǎng)元素，也是植物生長(zhǎng)發(fā)育的有益元素[1，2]。植物中的硒含量從每千克干重?cái)?shù)微克到數(shù)克[3]，為研究植物硒代謝提供了潛在的遺傳資源。關(guān)于植物硒代謝與積累已有許多學(xué)者從不同方面進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)述[4-8]。硒耐受關(guān)聯(lián)突變體通過(guò)T-DNA插入法，結(jié)合應(yīng)用擬南芥基因組序列的分析，分離到了mmt突變體[9]，從擬南芥中獲得了由于硫轉(zhuǎn)運(yùn)體基因損害的突變體[10]。Zhang等[11，12]發(fā)現(xiàn)不同生態(tài)型擬南芥之間存在硒的耐受性差異，通過(guò)數(shù)量性狀作圖分析確定了擬南芥中不同染色體上的硒耐受相關(guān)遺傳位點(diǎn)。19種擬南芥材料的硒耐受和積累的變異已經(jīng)鑒定[13]。據(jù)分析，在擬南芥中參與硫的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)的基因家族至少有14個(gè)[14]。Kassis等[15]通過(guò)篩選T-DNA插入突變體庫(kù)獲得了硫轉(zhuǎn)運(yùn)體基因（SULTR1；2）功能缺失但卻耐硒的變異株（sel1-11）。Tamaoki等[16]測(cè)定了Columbia（Col-0）和Wassilewskija（Ws-2）的對(duì)亞硒酸鹽的耐受指數(shù)，依據(jù)芯片和半定量PCR分析比較了二者對(duì)硒耐受的生理和分子響應(yīng)機(jī)理的差異。Zhao等[17]應(yīng)用水稻硅轉(zhuǎn)運(yùn)體突變體材料研究發(fā)現(xiàn)硅的內(nèi)流轉(zhuǎn)運(yùn)體（OsNIP2；1）與亞硒酸鹽的滲透吸收相關(guān)聯(lián)，這是迄今在植物中首次鑒定出的亞硒酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體。植物耐硒相關(guān)的突變體主要是硫轉(zhuǎn)運(yùn)體基因功能缺失（損傷）或某些硒同化代謝關(guān)鍵酶基因的插入失活所致，但涉及亞硒酸鹽耐受突變體仍然少見(jiàn)。由于硒代謝積累的復(fù)雜性，創(chuàng)造和利用新的突變體和芯片分析及基因組學(xué)分析是揭示其機(jī)理的有效途徑。中國(guó)的硒分布不平衡，開(kāi)發(fā)利用富硒資源具有必要性和迫切性，但富硒強(qiáng)化食品開(kāi)發(fā)極需從代謝機(jī)制上進(jìn)行科學(xué)闡釋和規(guī)范，加強(qiáng)對(duì)植物硒代謝積累的研究對(duì)指導(dǎo)食品硒營(yíng)養(yǎng)的分子改良具有重要理論和實(shí)踐意義。此外耐硒功能基因的開(kāi)發(fā)將有助于培育超富集硒的轉(zhuǎn)基因速生植物，為環(huán)境硒污染植物治理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana）Columbia和Landsberg生態(tài)型；突變體通過(guò)EMS誘導(dǎo)，在亞硒酸鹽脅迫下，對(duì)100多萬(wàn)粒誘變種子通過(guò)根彎曲特征鑒定篩選出的耐硒突變株。

1.2 突變體耐受穩(wěn)定性試驗(yàn)

將培養(yǎng)皿中培養(yǎng)5～6 d的幼苗（根長(zhǎng)約1.0～1.5 cm）從培養(yǎng)室中取出，揭開(kāi)皿蓋，用小鈍頭鑷輕輕夾住一片子葉，小心地將生長(zhǎng)于平板上的幼苗抽出，避免傷及下胚軸和根。然后將突變體和野生型的幼苗分別轉(zhuǎn)移至含Na2SeO4選擇培養(yǎng)基中，于培養(yǎng)架上倒置垂直培養(yǎng)。第6天觀察根彎曲程度并測(cè)量根負(fù)向地性生長(zhǎng)量，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算其平均值，評(píng)估突變體的耐硒特性，連續(xù)培養(yǎng)到M5代。endprint

1.3 突變體的遺傳特性

在Na2SeO4選擇培養(yǎng)基上通過(guò)根彎曲試驗(yàn)分別鑒定F1和F2代的根彎曲情況，統(tǒng)計(jì)分析F2代的分離比。

1.4 突變體耐硒基因的定位

采用F1自交產(chǎn)生的F2為作圖群體。F2代于38 mg/L的Na2SeO4選擇培養(yǎng)基篩選，出現(xiàn)性狀分離，將帶有耐硒目的基因純合植株挑選出來(lái)后移植到蛭石中培養(yǎng)；20 d后，用挑選出來(lái)的突變體葉片提取基因組DNA（CTAB法）。參考（www.arabidopsis.org），選擇了20個(gè)SSLP分子標(biāo)記，使其按間距為20-35 cM平均分布于擬南芥5條染色體上，同時(shí)利用數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件設(shè)計(jì)In/Del分子標(biāo)記引物，用于進(jìn)一步連鎖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 M3代根彎曲特性比較

從表1可以看出，以野生型Col-0根負(fù)向地性生長(zhǎng)量指標(biāo)為參照，M3代12個(gè)株系中M3-6、M3-11硒耐受性不明顯；M3-12達(dá)到顯著水平，表現(xiàn)為硒耐受性；M3-5、M3-9、M3-10、M3-4、M3-1、M3-3、M3-2、M3-7、M3-8都達(dá)到了極顯著水平，且根負(fù)向地性生長(zhǎng)量平均值較高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于野生型，耐硒特性十分明顯。其中M3-8株系根負(fù)向地性生長(zhǎng)量最高（7.94 mm），是野生型的2.13倍，同時(shí)，M3-8株系植株的根彎曲均一，選取根彎曲程度最明顯的植株M3-8-4、M3-8-5、M3-8-11、M3-8-14自交繁殖（圖1），至種子成熟后單株收種，作為進(jìn)一步檢驗(yàn)的材料。

在此基礎(chǔ)上連續(xù)進(jìn)行M4、M5代的耐硒穩(wěn)定性比較（結(jié)果未列出），表明M3-8株系是能穩(wěn)定遺傳的耐硒突變體，適合開(kāi)展基因定位工作。

2.2 突變體顯隱性分析

圖2所示為突變體與Landsberg雜交后的F1代，圖3顯示為F1代和Col-0、Ler的基因組DNA經(jīng)特異引物擴(kuò)增后的電泳檢測(cè)結(jié)果，表明基因型為雜合型，說(shuō)明雜交是成功的，可以繼續(xù)用于遺傳規(guī)律分析[2]。

將收獲的F2代種子在含38 mg/L的Na2SeO4選擇培養(yǎng)基上測(cè)試其表現(xiàn)型，在觀察的580株F2代群體中，對(duì)硒耐受的敏感型和不敏感型分離比接近 3∶1。用χ2對(duì)其分離比做適合性測(cè)驗(yàn)見(jiàn)表2，符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，可以初步判斷該突變體是由隱性單基因控制。

從圖4可以看出，在被檢測(cè)的群體中，大部分為C帶型，少數(shù)樣品表現(xiàn)為H帶型和L帶型。由于在突變位點(diǎn)附近，大部分的突變體都沒(méi)有發(fā)生交換，因此突變位點(diǎn)附近的分子標(biāo)記與突變體遺傳背景一致的原始親本Col-0連鎖，PCR電泳的帶型與Col-0一樣，都為C帶型[3]。而其他非突變位點(diǎn)，突變體大部分都發(fā)生了交換，在該位點(diǎn)上表現(xiàn)出既有Ler野生型，又有Col-0野生型的特征，表現(xiàn)為電泳結(jié)果就是C和L兩條帶（雜合帶）。由此推測(cè)該突變基因與NGA280分子標(biāo)記可能存在連鎖關(guān)系。

在NGA280上、下游分別尋找分子標(biāo)記位點(diǎn)，根據(jù)NGA280和NGA111對(duì)132個(gè)作圖群體的擴(kuò)增結(jié)果判斷，發(fā)現(xiàn)NGA111與突變基因之間之緊密連鎖，突變基因的物理位置應(yīng)位于這兩個(gè)分子標(biāo)記之間，且靠近NGA111，檢測(cè)指向NGA280下游的F12P19（位置：94.50 cM），同樣對(duì)132個(gè)作圖群體進(jìn)行了PCR擴(kuò)增檢測(cè)統(tǒng)計(jì)分離比例，其重組率為12.12%。NGA63、NGA280、F12P19和NGA111 4個(gè)分子標(biāo)記在第I號(hào)染色體的位置分別為11.48、83.83、94.50和115.55 cM（表3）。在NGA280、F12P19和NGA111 3個(gè)分子標(biāo)記的擴(kuò)增結(jié)果中，有些個(gè)體表現(xiàn)為雜合型（H），少數(shù)個(gè)體表現(xiàn)非原始親本的型（L），大多數(shù)個(gè)體為原始親本型（C），提示突變基因與這些分子標(biāo)記的連鎖較為緊密。但NGA63的重組率接近50%，與突變位點(diǎn)的遺傳距離相對(duì)較遠(yuǎn)，因此可以初步判斷突變基因位于擬南芥第I號(hào)染色體上，與分子標(biāo)記F12P19和NGA111緊密連鎖（圖5、表3）。

3 討論

突變體（M3-8）繁殖自交后代均表現(xiàn)出硒耐受性，檢測(cè)到M5代也表現(xiàn)穩(wěn)定系耐受特性，表明該突變性狀能夠穩(wěn)定遺傳。突變體和野生型Ler雜交，F(xiàn)1代表現(xiàn)為硒敏感性，F(xiàn)2代野生型和突變體的性狀分離比為3∶1，提示該突變是單基因隱性突變。這樣可以直接從子二代中選出純合的突變體，利用F2中純合的突變體構(gòu)成作圖群體，開(kāi)展基因定位克隆。NCBI和Tair數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋結(jié)果顯示，登錄擬南芥第I號(hào)染色體的硒關(guān)聯(lián)基因分別是SULTR1；2（At1g78000）、AtCpNifS（At1g08490、APR2（At1g62180）、SAT5（At1g

55920）、APS2（At1g19920）和CGS（At1g33320）等。篩選的突變基因位于擬南芥的第I號(hào)染色體的分子標(biāo)記F12P19和NGA111之間（95～115 cM），在此區(qū)間尚未發(fā)現(xiàn)耐硒關(guān)聯(lián)基因的報(bào)道，提示該耐硒突變體可能是一個(gè)新的硒耐受基因，開(kāi)展基因克隆和關(guān)聯(lián)功能分析具有理論和實(shí)踐意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] ELLIS D R，SALT D E.Plants，selenium and human health[J].Current Opinion in Plant Biology，2003，6（3）：273-279.

[2] BIRRINGER M，PILAWA S，F(xiàn)LOHE L.Trends in selenium biochemistry[J].Cheminform，2003，34（14）：693-718.

[3] BROWN T A，SHIFT A.Selenium：Toxicity and tolerance in higher plants[J].Biological Reviews，2010，57（1）：59-84.endprint

[4] 陳大清.植物硒同化的研究進(jìn)展及其耐硒突變體的篩選[J].氨基酸和生物資源，2004，26（2）：65-70.

[5] SHRIFT A.Aspects of selenium metabolism in higher plants[J].Annu Rev Plant Physiol，1969，20（1）：475-494.

[6] TERRY N，ZAYED A M，SOUZA M P D，et al. Selenium in higher plants[J].Annu Rev Plant Physiol，2000，51：401-432.

[7] SORS T G，ELLIS D R，SALT D E. Selenium uptake，translocation，assimilation and metabolic fatein plants[J].Photosynth Res，2005，86（3）：373-389.

[8] WHANGER P D. Selenocompounds in plants and animals and their biological significanc[J].Journal of American College of Nutrition，2002，21（3）：223-232.

[9] TAGMOUNT A，BERKEN A，TERRY N，et al.An essential role of S-Adenosyl-L Methionine：L-Methionine S-Methyltransferase in selenium volatilization by plants. Methylation of Tagmount A，Berken A，Terry N，et al，An essential role of S-Adenosyl-L Methionine：L-Methionine S-Methyltransferase in selenium volatilization by plants. Methylation of selenomethionine to selenium-Methyl-L-Selenium-Methionine，the precursor of volatile selenium[J].Plant Physiol，2002，130（2）：847-856.

[10] SHIBAGAKI N，ROSE A，MCDERMOTT J P，et al. McDermott JP，et al.Selenate-resistant mutants of Arabidopsis thaliana identify sultr1；2，a sulfate transporter required for efficient transport of sulfate into roots[J].Plant J，2002，29（4）：475-486.

[11] ZHANG L H，ABDELGHANY S E，F(xiàn)REEMAN J L，et al. Investigation of selenate tolerance mechanisms in Arabidopsis thaliana[J].Physiol Plant，2006，128（2）：212-223.

[12] ZHANG L，BYRNE P F.Mapping quantitative trait loci associated with selenate tolerance in Arabidopsis thaliana[J].New Phytol，2006，170（1）：33-42.

[13] ZHANG L，ACKLEY A R，PILON-SMITS E A H. Variation in selenium tolerance and accumulation among 19 Arabidopsis thaliana accessions[J].Plant Physiol，2007，164（3）：327-336.

[14] BUCHNER P，TAKAHASHI H，HAWKESFORD M J.Plant sulphate transporters coordination of uptake，intracellular and long-distance transport[J].Journal Experimental Botany，2004， 55（404）：1765-1773.

[15] KASSIS E E，CATHALA N，ROUACHED H，et al.Characterization of a selenate-resistant Arabidopsis mutant.Root Growth as a Potential Target for Selenate Toxicity[J].Plant Physiology，2007，143（3）：1231-1241.

[16] TAMAOKI M，F(xiàn)REEMAN J L，PILON-SMITS E A H. Cooperative ethylene and jasmonic acid signaling regulates selenite resistance in Arabidopsis[J].Plant Physiology，2008，146（3）：1219-1230.

[17] ZHAO X Q，MITANI N，YAMAJI N，et al. Involvement of silicon influx transporter OsNIP2；1in selenite uptake in Rice[J].Plant Physiology，2010，153（4）：1871-1877.endprint