許萍萍+粟寒+王振華

摘要：首次建立了粉紅聚端孢菌（Trichothecium roseum）實時熒光定量PCR檢測方法，該檢測方法擴增效率高、特異性好，靈敏度可達0.1 pg菌絲體DNA量；結(jié)合形態(tài)學觀察及致病性測定，對從機場入境旅客攜帶的蘋果中分離到的1株疑似菌株Tr-1685進行檢測和鑒定。Tr-1685實時熒光PCR檢測結(jié)果為陽性。該菌株在PDA培養(yǎng)基上生長較快，菌落平展，邊緣不規(guī)則，表面形成淡粉紅色的霉層，產(chǎn)孢量豐富。分生孢子梗直立，長短不一，頂端著生分生孢子。分生孢子雙細胞、光滑、棍棒狀，平均大小為17.5 μm×8.7 μm，基部細胞彎曲狀。該病原菌接種蘋果4 d后，出現(xiàn)褐色腐爛，8 d后出現(xiàn)淡粉色霉層及分生孢子。分離獲得的菌株Tr-1685鑒定為粉紅聚端孢菌，與實時熒光PCR結(jié)果一致。

關(guān)鍵詞：粉紅聚端孢菌（Trichothecium roseum）； 入境旅客； 蘋果； 鑒定； 實時熒光定量PCR檢測方法

中圖分類號：S41-32；S436.5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）02-0067-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.02.017

Abstract： The real-time PCR method of Trichothecium roseum was developed for the first time， and the method of T. roseum appeared high amplification efficiency and good specificity. Sensitivity of the method reached to 0.1 pg mycelium DNA amount. The isolate Tr-1685 similar to T. roseum which was obtained from imported apple carried by airport incoming passenger had been detected and identified using real-time PCR along with morphology obersevation and pathogenicity test. The real-time PCR result of the isolate Tr-1685 showed positive. The isolate bacterial strain grew fast on PDA media. The colony was flat and irregular in appearance，covered by light pink mould which produced lots of conidia. Conidiophores of the isolate were erect and different in length，which bore conidia at the tip. Conidia of the isolate was 17.5 μm×8.7 μm on average，which was smooth and clavate. Each conidium was two celled with curved basal cell. The isolate caused brown rot on apple 4 d after inoculation. Pinkish mould and conidia appeared 8 d after inoculation. The isolate Tr-1685 was identified as T. roseum，consistent with the result of the real-time PCR.

Key words： Trichothecium roseum； incoming passengers； apple； identification； real-time PCR

粉紅聚端孢菌（Trichothecium roseum）在分類上屬于子囊菌亞門、肉座菌目（Hypocreales）。該病菌的同物異名包括Trichothecium roseum、Hyphelia rosea、Puccinia rosea、Cephalothecium roseum和Dactylium roseum[1]。該菌在全世界多國廣泛分布，可以在不同的環(huán)境中生長，從落葉到水果上均可以發(fā)生，引起粉紅色腐爛癥狀，給農(nóng)業(yè)造成經(jīng)濟影響。同時，粉紅聚端孢菌可以產(chǎn)生多種次級代謝產(chǎn)物，包括真菌毒素，比如粉紅霉素B（Roseotoxins）和單端孢霉烯族毒素（Trichothecenes），可以侵染并毀壞多種水果，并會對人類健康帶來重要影響[2]。該病原菌在蘋果、葡萄、番茄、西瓜和桃上都有危害的報道[2-7]。引起的病害曾在中國蘋果園引起巨大損失。該病菌既能在果園中引起危害，又能為害儲藏期果實，并可在果實中潛伏侵染，隨病果遠距離傳播。

最近，徐州觀音國際機場口岸從入境旅客攜帶的蘋果中截獲一批病果，對病果進行分離培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)為疑似單端孢屬病原菌。繼續(xù)對該病原菌進行形態(tài)學觀察，首次建立了T. roseum實時熒光PCR分子檢測方法，并根據(jù)柯赫氏法則（Kochs postulates）進行了致病性測定，對該批病蘋果攜帶的病菌進行了檢測和鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 病原菌分離材料為徐州觀音國際機場入境旅客攜帶物中截獲的可疑蘋果病果，將疑似粉紅聚端孢菌的菌株編號為Tr-1685。致病性測定接種材料為健康蘋果。endprint

1.1.2 參試菌株 選擇從蘋果上分離到的不同地理來源的粉紅聚端孢菌12份菌株，以及其他經(jīng)常在蘋果上發(fā)生的、不同已知地理來源的35種重要蘋果病原菌（表1）進行實時熒光定量PCR分子檢測。

1.1.3 主要試劑 HR qPCR Master Mix購自上海輝睿生物科技有限公司；EASY Dilution購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 實時熒光定量PCR分子檢測方法的建立

1.2.1 TaqMan引物與探針的設(shè)計與合成 通過GenBank網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）下載所有粉紅聚端孢菌ITS基因序列，根據(jù)該物種ITS基因的保守序列區(qū)域及其中一個粉紅聚端孢菌菌株（登錄號：EU552162.1），設(shè)計如下一對寡核苷酸引物和TaqMan探針，并對設(shè)計的引物和探針在GenBank網(wǎng)站上進行同源性分析。TR-ITS-FP：5′-GACCACACGAACCCTGTTTAA-3′（194-214）；TR-ITS-RP：5′-ATTTCGCTGCGTTCTTCATC-3′（298-317）；TR-ITS-P：5′FAM-TGAGCGAGCCGAAAGGCAACAAA-BHQ1 3′（232-254）。其預期的擴增產(chǎn)物大小為124 bp。引物與探針由上海輝睿生物科技有限公司合成。

1.2.2 DNA提取 直接采用經(jīng)典的CTAB法大量提取病菌基因組DNA，測定DNA濃度及純度，-20 ℃保存?zhèn)溆?。對已?jīng)培養(yǎng)好的其他參試菌株少量提取菌絲DNA，可以采用Tooley等[8]的堿裂解法快速提取。取少量菌絲塊放入2 mL的離心管中，加入50 μL的0.5 mol/L NaOH和2粒以上直徑3 mm的鋼珠，在球磨儀（Retsch MM400德國）上以30次/s的頻率振蕩5 min。12 000 r/min離心10 min，取上清液以100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）稀釋10倍。DNA提取后直接進行實時熒光PCR檢測。

1.2.3 實時熒光定量PCR反應體系及反應條件 20 μL實時熒光定量PCR反應體系中含以下組分：HR qPCR Master Mix（2×）10 μL、上游引物TR-ITS-FP（10 μmol/L）及下游引物TR-ITS-RP各0.8 μL，TaqMan探針TR-ITS-P（10 μmol/L） 0.2 μL，DNA模板（1～10 ng）1 μL，補ddH2O至20 μL。

實時熒光定量PCR反應條件：50 ℃預變性2 min；95 ℃變性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，40個循環(huán)。實時熒光定量PCR反應在ABI PRISM 7500 FAST實時熒光PCR儀上進行，擴增反應無需設(shè)置ROX校正。

1.2.4 實時熒光定量PCR特異性試驗 選擇從蘋果上分離到的不同地理來源的粉紅聚端孢菌12份菌株及疑似菌株Tr-1685，以及其他經(jīng)常在蘋果上發(fā)生的、不同地理來源的35種重要蘋果病原菌進行實時熒光定量PCR特異性驗證。

1.2.5 實時熒光定量PCR靈敏度試驗 選取粉紅聚端孢菌標準菌株ATCC？誖13412TM，采用經(jīng)典的CTAB法提取菌絲體總DNA，并在超微量分光光度計（OneDrop OD-2000+）測定DNA濃度及純度。對提取的DNA定量為1 μg/μL，采用EASY Dilution對DNA溶液按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8梯度逐級稀釋，各取1 μL進行實時熒光定量PCR靈敏度試驗。此時20 μL PCR反應液中的DNA添加量分別相當于100、10、1 ng和100.00、10.00、1.00、0.10、0.01 pg的菌絲體DNA量。陰性對照為ddH2O。1.3 病原菌的組織分離與培養(yǎng)

先用75%乙醇對果實進行表面消毒，待乙醇揮發(fā)后，從病健交界處切取或用鑷子撕取邊長約為5 mm的樣品，放在馬鈴薯葡萄糖瓊脂PDA培養(yǎng)基上，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)。觀察病菌菌落的生長情況，將長出的菌落及時置于新的PDA平板上進行純化。

1.4 病原菌形態(tài)學觀察與生物學測定

對純化的疑似菌株繼續(xù)在25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，對菌落的形態(tài)、顏色、生長速度、產(chǎn)孢量、分生孢子梗和分生孢子等形態(tài)特征進行觀察和生物學性狀測定。培養(yǎng)3 d后開始測量菌落直徑。在顯微鏡（ZEISS Imager M1）下觀察并拍攝分生孢子形態(tài)，測量其大小，根據(jù)病菌的形態(tài)特征進行鑒定。

1.5 病原菌PCR擴增及序列分析

采用真菌通用引物ITS4/ITS5（ITS4：5′-TCCTCC

GCTTATTGATATGC-3′，ITS5：5′-GGAAGTAAAAGT

CGTAACAAGG-3′）對菌株Tr-1685基因組DNA進行PCR擴增。反應體系為：10×Buffer 5 μL（含Mg2+）、dNTP 1.0 μL（10 mmol/L）、引物各2.0 μL（10 μmol/L）、rTaq 0.4 μL（5 U/μL）模板DNA 2 μL，ddH2O補足至50 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃復性30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)的擴增；72 ℃延伸7 min后，保存于4 ℃。將PCR產(chǎn)物送往南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司進行測序，并進行序列分析。

1.6 致病性測定

采用菌絲塊接種法。用4 mm孔徑的打孔器在菌株Tr-1685的菌落邊緣打孔取樣，作為接種菌絲塊。選用新鮮健康的蘋果果實，先用75%乙醇對要接種的果實表面進行消毒，再用相同的打孔器在接種部位打孔，切取少量果肉留下果皮，將菌絲塊接入果肉孔中后，蓋上果皮。將接種的蘋果放入無菌塑料袋中，25 ℃黑暗條件下保濕培養(yǎng)。同時設(shè)置無菌水接種作為對照。觀察記錄發(fā)病情況，并對果實的發(fā)病部位重新進行病原菌的分離培養(yǎng)，與接種菌株Tr-1685比較形態(tài)特征。endprint

2 結(jié)果與分析

2.1 實時熒光定量PCR檢測方法的建立

2.1.1 實時熒光PCR特異性試驗結(jié)果 實時熒光定量PCR擴增的結(jié)果表明，11份不同地理來源的粉紅聚端孢菌均具有良好的擴增曲線，標準菌株ATCC13412TM Ct為17.36，其他參試菌株序號2～11的Ct分別為17.36、18.34、17.00、17.45、11.36、10.40、17.25、19.71、24.50、14.24和10.39（圖1），疑似菌株Tr-1685 Ct為12.10，均為陽性擴增；而其他經(jīng)常在蘋果上發(fā)生的、不同地理來源的35種重要蘋果病原菌和陰性對照均無擴增曲線，Ct>35。表明所設(shè)計的引物、探針，實時熒光定量PCR反應體系和反應條件均能滿足粉紅聚端孢菌的實時熒光定量PCR的特異性檢測需要。

2.1.2 實時熒光定量PCR靈敏度試驗結(jié)果 實時熒光定量PCR靈敏度試驗的結(jié)果表明，粉紅聚端孢菌菌絲體DNA量從1 μg到0.1 pg范圍內(nèi)，可以得到較好的實時熒光定量檢測結(jié)果（Ct<35）（圖2），Ct從小到大依次為13.19、16.18、19.60、23.27、26.50、29.99、32.75和34.49，表明所建立的實時熒光定量PCR檢測的靈敏度可達0.1 pg。

根據(jù)圖2制作出的粉紅聚端孢菌實時熒光定量PCR的標準曲線見圖3（R2=0.995）。

2.2 病菌生物學特性及形態(tài)特征

2.2.1 菌落特征 取病果病健交界處果皮進行組織分離，對疑似菌落Tr-1685粉紅聚端孢菌進行純化，取直徑4 mm菌絲塊在PDA上25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，菌落生長速度較快，10 d后菌落布滿直徑9 cm培養(yǎng)皿。菌落特征表現(xiàn)為平展、呈顆粒狀和粉狀。菌落邊緣的顏色剛開始為白色，之后變?yōu)榈姆奂t色，至桃紅色。菌落邊緣生長不規(guī)則，產(chǎn)孢量豐富，菌落表面形成粉紅色的分生孢子堆，粉紅色霉層呈不規(guī)則輪紋形（圖4）。

2.2.2 病菌無性階段形態(tài)特征 經(jīng)顯微鏡觀察，疑似菌株Tr-1685菌絲無色，有分枝。分生孢子梗直立，長短不一，在測量的30根分生孢子梗中，最短的為84.5 μm，最長為188.5 μm，單生或簇生，可在頂端產(chǎn)生單生的或成簇的分生孢子。這些分生孢子梗早期與營養(yǎng)生長的菌絲難以區(qū)分，直至產(chǎn)生無性孢子。分生孢子從分生孢子梗頂端上不同方向上逐一脫落。成熟的分生孢子平均大小為17.5 μm×8.7 μm，光滑，棍棒狀（圖5）。分生孢子雙細胞，頂部細胞比彎曲的基部細胞稍大。分生孢子堆呈淡粉紅色，而在顯微鏡下為半透明狀。在培養(yǎng)基或寄主表面大量生長時表現(xiàn)為飽滿的粉紅色。

2.3 ITS序列分析

采用真菌通用引物ITS4/ITS5對菌株Tr-1685基因組DNA進行PCR擴增后，雙向測序及拼接，并在GenBank上進行Blast比對。結(jié)果表明，菌株Tr-1685的核苷酸序列與粉紅聚端孢菌菌株（基因登錄號EU552162和JQ434579）的同源性最高，達到100%。

2.4 致病性測定

采用菌絲塊對新鮮健康的蘋果果實進行接種，經(jīng)保濕培養(yǎng)，蘋果果實3～4 d在接種部位出現(xiàn)褐色病斑，病斑擴展較慢，8 d時在接種部位表面及周圍出現(xiàn)大量粉紅色霉層（圖6A），其上產(chǎn)生淡粉色分生孢子。剖開發(fā)病的病果，可見果肉部分出現(xiàn)褐色病斑，向果核方向擴展（圖6B）。對照無上述癥狀出現(xiàn)，亦無粉紅色霉層產(chǎn)生。從接種發(fā)病的蘋果果實上可重新分離到性狀相同的菌株。致病性測定結(jié)果表明，該菌株可以侵染蘋果果實。

3 小結(jié)與討論

通過對蘋果病果上分離到的菌株Tr-1685進行實時熒光定量PCR分子檢測和致病性測定及形態(tài)學觀察，確定從徐州觀音國際機場入境旅客攜帶的蘋果中分離的病原菌Tr-1685為粉紅聚端孢菌。

單端孢屬（Trichothecium）于1809年首次報道[2]，目前包含73個記錄種，缺乏有性階段[2]。該屬的主要成員包括T. polybrochum、T. cystosporium、T. pravicovi和T. roseum[2]。粉紅聚端孢菌的分生孢子梗和分生孢子在形態(tài)上與其他3個主要種有所差異[2]，因此，近年來對該屬的鑒定重點集中在對這些形態(tài)特征的研究上。另外，在分子檢測方面，目前還是采用常規(guī)PCR檢測方法，針對真菌基因組ITS區(qū)域和β-tubulin（TUB）基因5′端進行PCR擴增[7]，然后對PCR產(chǎn)物進行測序，再進行序列分析和系統(tǒng)進化聚類分析，最終確定其種類。

本研究首次建立了粉紅聚端孢菌實時熒光定量PCR分子檢測方法。在對引物和探針設(shè)計時，對設(shè)計的探針TR-ITS-P在GeneBank網(wǎng)站上進行序列比對，要求與所有粉紅聚端孢菌不同地理的菌株同源性達到100%；并且盡量增大種間差異，如單端孢屬的3個主要成員T. polybrochum、T. cystosporium、T. pravicovi與TR-ITS-P序列的同源性在80%以下，保證設(shè)計的引物和探針具有很好的特異性。同時，在建立實時熒光定量PCR反應體系過程中，不斷優(yōu)化反應體系，降低探針終濃度，調(diào)整引物和探針濃度最佳比例；摸索反應條件，提高退火溫度從56 ℃到60 ℃。在進行特異性驗證時，盡量多選取不同地理來源的粉紅聚端孢菌陽性菌株和其他不同地理來源的重要蘋果病原菌35種進行測試。結(jié)果表明，所建立粉紅聚端孢菌實時熒光定量PCR分子檢測方法具有準確、快速、靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性高等特點，適合對該病原菌開展快速鑒定，尤其是早期診斷。

粉紅聚端孢菌全世界發(fā)現(xiàn)大約有220種不同的植物寄主，在很多水果和蔬菜上引起紅腐癥狀[3]。該病害早期會出現(xiàn)白色粉狀霉層，最后發(fā)展為粉紅色。雖然有報道該病菌通常是次要致病菌[2]，具有一定的腐生性，但是越來越多的證據(jù)表明，該病菌具有較強的致病性。在中國該病菌可引起蘋果心腐病，造成嚴重的經(jīng)濟損失[4]；在韓國，該病菌可以引起葡萄發(fā)病，菌絲布滿果實表面，嚴重降低葡萄的品質(zhì)[5]；在韓國和巴基斯坦，有報道該病菌可以侵染番茄[6，7]；在日本、美國、南美洲、印度和英國有報道該病菌可以侵染厚皮甜瓜和西瓜，引起紅腐病[3]；在香蕉和桃上也有發(fā)生危害的報道[3]。endprint

研究表明粉紅聚端孢菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物粉紅霉素B[9]，可以穿透蘋果果皮，形成病斑。同時，該病菌會產(chǎn)生較高水平的真菌毒素，如T-2毒素是單端孢霉烯族毒素中毒性最強的一種[4]，由于其致癌性，具有神經(jīng)毒性和免疫毒性，對食用感染該病蘋果的人群會造成潛在的威脅。同時，該病菌引起葡萄病害，其產(chǎn)生的單端孢菌素（Trichothecin）和玫瑰菌素（Rosenonolactone）還會出現(xiàn)在葡萄酒中[10]，造成潛在的健康風險。

粉紅聚端孢菌既能在果園和蔬菜基地引起危害，又能為害儲藏期的水果和蔬菜，并可在果實中潛伏侵染，隨病果遠距離傳播。加強對水果和蔬菜上粉紅聚端孢菌的檢測和檢疫，重視該病菌的發(fā)生、傳播和防治，對保障中國水果安全生產(chǎn)和人類健康都具有重要意義。

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