劉貴生+ＭｅｋｘｎａｙSｕｐａｍｉｔ+吳俊靜

摘要：CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)）平臺(tái)是出色的基因組編輯工具，其中新型核酸酶Cas13a（CRISPR-associated protein 13a）既可編輯DNA，也可編輯RNA，這一新平臺(tái)可實(shí)現(xiàn)DNA或RNA的摩爾靈敏度以及單堿基錯(cuò)配的特異性檢測(cè)，同時(shí)拓展用于病毒與細(xì)菌的精細(xì)檢測(cè)（甚至是寨卡與登革熱的近親病毒株）、癌癥早期監(jiān)測(cè)和遺傳性疾病等治療；其需要設(shè)計(jì)少，技術(shù)操作簡(jiǎn)單，具有廣泛的應(yīng)用潛力，是基因組編輯的又一項(xiàng)卓越成果。綜述了Cas13a系統(tǒng)的最新進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：基因組編輯；CRISPR；Cas13a；RNA；基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控

中圖分類號(hào)：S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2018）02-0005-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.02.001

Abstract： The CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats） platform is an excellent genome editing platform， in which， the novel nuclease Cas13a （CRISPR-associated protein 13a） can edit DNA and RNA. This new platform could fulfill DNA or RNA detection with molar sensitivity and single-base mismatch specificity， and meanwhile be extended to fine detect of viruses（even Close relatives of Zika and Dengue strains） and bacteria， monitor early cancer， with the simple technical manipulation and a wide range of application potentials， which could be another excellent tool of genomic editing. Here the current progress about Cas13a system was overviewed.

Key words： Genomic Editing； CRISPR； CRISPR-associated protein 13a； RNA； gene network regulation

CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)）平臺(tái)是出色的基因組編輯工具，其層出不窮的科研進(jìn)展及其應(yīng)用更新給生物學(xué)界帶來(lái)巨大革命。其中，比較熟知的是編輯DNA的Cas9（CRISPR-associated protein 9），而現(xiàn)在另一種新型核酸酶Cas13a正逐漸走進(jìn)人們的視野?；蚪M編輯技術(shù)新平臺(tái)Cas13a主要由該領(lǐng)域的兩個(gè)先驅(qū)團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)，分別是哈佛大學(xué)張鋒教授[1，2]和加州大學(xué)伯克利分校的Jennifer A. Doudna教授[3]。2015年發(fā)現(xiàn)時(shí)稱為C2c2，現(xiàn)在稱為Cas13a，由于文獻(xiàn)原因，本文同時(shí)使用這2個(gè)名稱。

幾乎所有的古菌和約50%的現(xiàn)代細(xì)菌都具有CRISPR-Cas[（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）-associated protein]，是細(xì)菌抵抗病毒和質(zhì)粒侵染的獲得性免疫防御系統(tǒng)，且是人類開(kāi)發(fā)基因工程革新性工具的基礎(chǔ)[4，5]。CRISPR-Cas系統(tǒng)劃分為兩大類，第一大類是由多亞基組成的效應(yīng)復(fù)合物才能發(fā)揮功能；第二大類是由單個(gè)效應(yīng)蛋白（如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2等）發(fā)揮功能。其中Cas9和Cpf1是廣為人知的DNA編輯工具，而最近挖掘出蛋白C2c2則是又一驚喜成果，具有RNA編輯功能?！禢ature Methods》2017年第一期評(píng)出了2016年度革新技術(shù)，其中之一即是C2c2靶向RNA的基因組編輯技術(shù)[6]。

1 結(jié)構(gòu)

最近兩篇文獻(xiàn)揭示了C2c2加工pre-crRNA和切割靶標(biāo) RNA的分子結(jié)構(gòu)，對(duì)認(rèn)識(shí)細(xì)菌抵抗RNA病毒入侵的分子基礎(chǔ)具有十分重要的意義，有助于加速對(duì)病毒感染引發(fā)的疾病的理解、治療和預(yù)防。同時(shí)也為改造CRISPR-C2c2系統(tǒng)，為其在基因編輯領(lǐng)域的運(yùn)用提供了強(qiáng)有力的結(jié)構(gòu)生物學(xué)基礎(chǔ)。

中科院生物物理研究所王艷麗課題組通過(guò)結(jié)構(gòu)和生化解析了Leptotrichia shahii（Lsh）細(xì)菌中C2c2與crRNA（CRISPR-RNA）的二元復(fù)合物3.2？魡的電鏡結(jié)構(gòu)、C2c2與crRNA（CRISPR-RNA）及其target RNA三元復(fù)合物3.08？魡的晶體結(jié)構(gòu)，以及C2c2在自由狀態(tài)下的晶體結(jié)構(gòu)，揭示了LshC2c2通過(guò)兩個(gè)獨(dú)立的活性結(jié)構(gòu)域來(lái)發(fā)揮其兩種不同的RNA酶切活性（圖1）[7]。crRNA的結(jié)合會(huì)引起C2c2蛋白的構(gòu)象變化，這種變化很可能使其更穩(wěn)定地與crRNA的結(jié)合，進(jìn)而對(duì)識(shí)別靶標(biāo)RNA起著重要作用。Knott等[8]報(bào)道了毛螺科菌（Lachnospiraceae bacterium）crRNA結(jié)合Cas13a（LbaCas13a）的2.0？魡晶體結(jié)構(gòu)。研究人員通過(guò)結(jié)構(gòu)分析和生化試驗(yàn)，定義了直接負(fù)責(zé)crRNA突變的Cas13a催化殘基，而且這種蛋白上外源靶向RNA特異性序列的發(fā)現(xiàn)也解釋了Cas13a核酸酶活化的構(gòu)象門(mén)控（圖2）。endprint

2 Cas13a與Cas9功能機(jī)制特點(diǎn)比較

與Cas9一樣，Cas13a也能容忍crRNA與目標(biāo)序列之間的單個(gè)錯(cuò)配，不過(guò)若存在2個(gè)錯(cuò)配，切割效率就大大降低。它的PFS序列（相當(dāng)于PAM序列）位于間隔區(qū)的3端，由A、U或C堿基組成（圖3）。

綜合Cas13a特點(diǎn)見(jiàn)表1，二者的區(qū)別在于Cas13a切割對(duì)象是RNA，而Cas9靶向切割DNA；Cas13a是一種雙組件系統(tǒng)，只需要一條crRNA介導(dǎo)，而Cas9需要crRNA和tracrRNA；Cas13a對(duì)crRNA的加工并非必須，尤其是Cas13a靶標(biāo)單鏈RNA時(shí)[9]；從結(jié)構(gòu)上來(lái)看，Cas13a含有兩個(gè)HEPN結(jié)構(gòu)域，而Cas9用HNH和RuvC結(jié)構(gòu)域來(lái)切割DNA目標(biāo)。HEPN結(jié)構(gòu)域?qū)as13a切割RNA目標(biāo)是必需的；Cas13a遺傳上可編碼，這意味著可將必要元件合成為DNA傳遞到組織和細(xì)胞中。Cas13a還有一個(gè)特別之處，那就是Cas13a一旦識(shí)別并切割由crRNA序列指定的靶標(biāo)RNA，它就轉(zhuǎn)入了一種酶促“激活”狀態(tài)，這時(shí)它將結(jié)合并切割其他的非靶標(biāo)RNA，而不管它們是否與crRNA同源，或是否存在PFS，與Cas9截然不同。Cas13a蛋白實(shí)質(zhì)上是細(xì)菌自我武裝的哨兵，在檢測(cè)到其靶標(biāo)后攻擊所有RNA。對(duì)于細(xì)菌而言，這種特性是有意義的。若細(xì)菌被噬菌體感染，它能夠激活程序性細(xì)胞死亡或休眠狀態(tài)，以限制感染在整個(gè)群體中的傳播。作者將這稱為附屬活性，這種特性可被用作一個(gè)自動(dòng)放大檢測(cè)器，開(kāi)發(fā)成為一種低成本的診斷法[10]。

3 應(yīng)用

3.1 用于檢測(cè)濃度極低的單RNA分子和單DNA分子

利用附屬活性，Gootenberg等[10]在這套系統(tǒng)里塞入了一種帶有RNA的熒光標(biāo)志物，平時(shí)它不會(huì)發(fā)出熒光，一旦Cas13a到處剪切，被熒光標(biāo)記的RNA就會(huì)被切開(kāi)，讓它發(fā)出明亮的光芒。也就是說(shuō)，只要設(shè)計(jì)好合適的向?qū)NA，并提供Cas13a與熒光標(biāo)志物，那么一旦這套系統(tǒng)識(shí)別到匹配的RNA序列，就會(huì)發(fā)出熒光，告訴研究人員找到靶標(biāo)了。這套系統(tǒng)的靈敏度達(dá)到了50 fM（1 fM=10-15 mol/L）。盡管這樣，研究人員依然沒(méi)有滿足，想要把靈敏度進(jìn)一步提高到阿摩爾級(jí)（aM，10-18 mol/L）。為了達(dá)到這一目標(biāo)，引入James Collins教授的技術(shù)“等溫?cái)U(kuò)增”，進(jìn)一步降低了對(duì)初始核酸濃度的需求，增加放大步驟有助于檢測(cè)靈敏度提高到百萬(wàn)分之一。將這兩種技術(shù)結(jié)合起來(lái)的新系統(tǒng)能夠檢測(cè)極低濃度的單RNA分子和單DNA分子，并能進(jìn)一步引入冷凍干燥等應(yīng)用程序，從而真正構(gòu)建出一種強(qiáng)大的工具。利用這一技術(shù)，可在短短1 h內(nèi)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，還可將其凍存并重構(gòu)，成本也很低。

3.2 用于區(qū)分細(xì)微差異的病原

多個(gè)結(jié)果都佐證了Cas13a工具能夠識(shí)別人血清、尿液和唾液中的寨卡病毒RNA，并且還可將寨卡病毒與登革熱這兩種關(guān)系相近的病毒區(qū)分開(kāi)，甚至能分辨具有不同耐藥突變的肺炎菌株，這些對(duì)于準(zhǔn)確診斷病情、有效預(yù)防疫情暴發(fā)而言，有著現(xiàn)實(shí)的應(yīng)用價(jià)值[10]。

3.3 用于癌癥早期監(jiān)測(cè)

在癌癥的早期診斷領(lǐng)域，科學(xué)家們希望從血液中分離出專屬于癌細(xì)胞的突變，從而得知癌癥是否開(kāi)始發(fā)作。然而，由于血液中有著大量的非癌細(xì)胞DNA，這一檢測(cè)過(guò)程困難無(wú)比。Gootenberg等[10]試驗(yàn)表明，該平臺(tái)同樣能以阿摩爾級(jí)的靈敏度，識(shí)別出腫瘤特有的突變。研究人員應(yīng)用這套系統(tǒng)，成功地鑒定出了人類基因組中的多個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP），并能分析出每一個(gè)人的特定SNP是純合還是雜合。這項(xiàng)工具能在患者的血液中尋找到極少量的腫瘤DNA，幫助研究人員理解腫瘤的突變?nèi)绾坞S著時(shí)間推移發(fā)生改變。由于達(dá)到如此非同尋常的靈敏度，研究人員想到了福爾摩斯（Sherlock Holmes），于是把這套系統(tǒng)稱為SHERLOCK（Specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking）。

3.4 用于治療遺傳性疾病

雖然人體很多疾病是來(lái)自于DNA，但是由于基因承載著生命最根源的信息，直接對(duì)DNA進(jìn)行編輯會(huì)出現(xiàn)安全和倫理上的問(wèn)題。而RNA編輯卻不同，通過(guò)編輯RNA能暫時(shí)性地糾正DNA翻譯的信息，讓蛋白質(zhì)接收到正確的信息，達(dá)到治療的效果，這可能是更加有效的一種臨床應(yīng)用方式，尤其對(duì)于需要基因表達(dá)短期變化的疾病來(lái)說(shuō)，無(wú)需修改基因組就能修復(fù)突變，而且RNA會(huì)自動(dòng)降解，因此RNA編輯可能更有效[11]。

3.5 潛在應(yīng)用

與Cas9類似，Cas13a分子中關(guān)鍵殘基的突變可以形成核酸酶活性缺失的Cas13a（dCas13a），它能夠結(jié)合RNA目標(biāo)但無(wú)法切割。人們可利用dCas13a來(lái)分離群體中的特定RNA序列，或利用熒光標(biāo)記的dCas13a來(lái)研究活細(xì)胞中的RNA加工。Cas13a有望繼續(xù)擴(kuò)大CRISPR的應(yīng)用范圍有：添加一些模塊到特定RNA序列中改變它們的功能（翻譯成蛋白質(zhì)的方式），這將使得它們成為用于大規(guī)模篩查及構(gòu)建合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的有價(jià)值工具；利用C2c2熒光標(biāo)記RNAs來(lái)研究RNA的運(yùn)輸和亞細(xì)胞定位。

此外，Cas13a并不是惟一的一種RNA靶向CRISPR系統(tǒng)，張鋒研究組還發(fā)現(xiàn)了Cas13b[11]。像Cas13a一樣，Cas13b僅需要單個(gè)向?qū)NA就能找到靶標(biāo)，并且從遺傳學(xué)的角度是可編碼的。此外，Cas13b能夠同時(shí)靶向多個(gè)RNA轉(zhuǎn)錄本。這些特性使得Cas13b更適用于微調(diào)基因功能研究[12]。

4 Cas13a 與RNAi比較

在CRISPR出現(xiàn)之前，RNAi是調(diào)節(jié)基因表達(dá)的理想方法。但Cas13a一大優(yōu)勢(shì)就在于其具有更強(qiáng)的特異性，而且這種本身來(lái)自細(xì)菌的系統(tǒng)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)說(shuō)并不是內(nèi)源性的，因此不太可能干擾細(xì)胞中天然的轉(zhuǎn)錄。相反，RNAi利用內(nèi)源性機(jī)制進(jìn)行基因敲除，對(duì)本身的影響較大。Abudayyeh等[13]分離得到了Cas13a酶，構(gòu)建出了一種雙質(zhì)粒RNA靶向CRISPR系統(tǒng)，這一系統(tǒng)能在不同的質(zhì)粒上表達(dá)導(dǎo)向RNA（gRNA）和Cas13a基因，其中Cas13a基因含有一種經(jīng)過(guò)改造的核定位序列，證實(shí)了切割RNA的Cas13a酶能夠特異性地降低哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的內(nèi)源性RNA和報(bào)告RNA水平。并指出這種方法比RNA干擾（RNAi）的效率更高，能被用于抑制細(xì)胞RNA靶標(biāo)，結(jié)合和富集感興趣的RNA，以及通過(guò)序列特異結(jié)合對(duì)細(xì)胞內(nèi)的RNA進(jìn)行成像。endprint

5 結(jié)論

與編輯DNA的Cas9相比較，Cas13a既可編輯DNA，也可編輯RNA，這一平臺(tái)實(shí)現(xiàn)了單分子檢測(cè)靈敏度和單堿基對(duì)特異性檢測(cè)，同時(shí)拓展于病毒與細(xì)菌的精細(xì)檢測(cè)、癌癥早期監(jiān)測(cè)和遺傳性疾病治療等，且技術(shù)操作簡(jiǎn)單，具有可靠應(yīng)用潛力，是基因組編輯的又一項(xiàng)卓越成果。之后還需要進(jìn)行大規(guī)模臨床研究，并對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)方法進(jìn)行基準(zhǔn)測(cè)試。

參考文獻(xiàn)：

[1] SHMAKOV S，ABUDAYYEH O O，MAKAROVA K S，et al. Discovery and functional characterization of diverse class 2 CRISPR-Cas systems[J].Mol Cell，2015，60（3）：385-397.

[2] ABUDAYYEH O O，GOOTENBERG J S，KONERMANN S，et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector[J].Science，2016，353（6299）：5573.

[3] EAST-SELETSKY A，OConnell M R，Knight S C，et al. Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection[J].Nature，2016，538（7624）：270-273.

[4] MURUGAN K，BABU K，SUNDARESAN R，et al. The Revolution continues：Newly discovered systems expand the CRISPR-Cas toolkit[J].Mol Cell，2017，68（1）：15-25.

[5] SHMAKOV S，SMARGON A，SCOTT D，et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems[J].Nat Rev Microbiol，2017，15（3）：169-182.

[6] RUSK N.CRISPR targets RNA[J].Nature Methods，2017，14（1）：33.

[7] LIU L，LI X，WANG J，et al. Two distant catalytic sites are responsible for C2c2 RNase activities[J].Cell，2017，168（1-2）：121-134.e12.

[8] KNOTT G J，EAST-SELETSKY A，COFSKY J C，et al. Guide-bound structures of an RNA-targeting A-cleaving CRISPR-Cas13a enzyme[J].Nat Struct Mol Biol，2017，24（10）：825-833.

[9] EAST-SELETSKY A，OCONNELL M R，BURSTEIN D，et al. RNA targeting by functionally orthogonal type VI-A CRISPR-Cas enzymes[J].Mol Cell，2017，66（3）：373-383.e3.

[10] GOOTENBERG J S，ABUDAYYEH O O，LEE J W，et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2[J].Science，2017，356（6336）：438-442.

[11] COX D B T，GOOTENBERG J S，ABUDAYYEH O O，et al. RNA editing with CRISPR-Cas13a[J].Science，2017，358（6366）：1019-1027.

[12] SMARGON A，COX D B T，PYZOCHA N K，et al. Cas13b Is a type VI-B CRISPR-Associated RNA-guided RNase differentially regulated by accessory proteins Csx27 and Csx28[J].Mol Cell，2017，65（4）：618-630.e7.

[13] ABUDAYYEH O O，GOOTENBERG J S，ESSLETZBICHLER P，et al. RNA targeting with CRISPR-Cas13[J].Nature，2017， 550（7675）：280-284.endprint