李永凱，張鳳枰，廖利民，羅國(guó)強(qiáng)，蘇艷秋，，曾娟，楊建英，曹毅

（1.通威股份有限公司，四川成都610000；2.河南科技大學(xué)，河南洛陽(yáng)471000；3.四川大學(xué)，四川成都610000）

俗稱(chēng)“腦黃金”的二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA），不僅是人體的必需脂肪酸[1-3]，而且對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育和免疫有著特別重要的生理作用[4-7]。海洋產(chǎn)品中的魚(yú)油是DHA的主要傳統(tǒng)來(lái)源，隨著海洋漁業(yè)資源日漸減少，新的DHA來(lái)源開(kāi)發(fā)已成為迫切需求。裂殖壺菌（Schizochytrium sp.）可發(fā)酵產(chǎn)DHA，其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)成為研究熱點(diǎn)[8-10]。發(fā)酵產(chǎn)品中DHA含量的準(zhǔn)確測(cè)定是生產(chǎn)質(zhì)控和科研中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，不但要求檢測(cè)方法方便快捷，而且還需要檢測(cè)方法具有較高的準(zhǔn)確度。測(cè)量不確定度是國(guó)際上通用的衡量測(cè)量結(jié)果可靠性的指標(biāo)，表征測(cè)量值的分散性[11]。它的正確評(píng)定在測(cè)量結(jié)果的客觀分析中具有重要意義，能夠量化測(cè)量結(jié)果的可信程度，使數(shù)據(jù)可以共享和比對(duì)。本研究采用氣相色譜內(nèi)標(biāo)法檢測(cè)裂殖壺菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物中DHA的含量，按照GUM等指南[11-13]，根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理和方法建立數(shù)學(xué)模型，結(jié)合實(shí)驗(yàn)，分析檢測(cè)過(guò)程中各分量不確定度來(lái)源并量化后，使用統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算合成，得到樣品DHA檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度和擴(kuò)展測(cè)量不確定度，旨在為發(fā)酵產(chǎn)品中DHA含量的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Sartorius-CP225D電子分析天平：梅特勒-托利多國(guó)際有限公司；安捷倫7890A氣相色譜儀（配FID檢測(cè)器）：安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；DKZ-2恒溫震蕩水槽、HWS-26電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

十三烷酸、二十二碳六烯酸、三十七種脂肪酸甲酯混標(biāo)（10 mg/mL）、14%三氟化硼-甲醇溶液等：均購(gòu)自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；鹽酸、三氯甲烷、正己烷、甲醇、石油醚（60℃～90℃）、氫氧化鈉、氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉等：購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠；雙蒸水：通威股份有限公司水產(chǎn)科技園實(shí)驗(yàn)室自制。

裂殖壺菌培養(yǎng)物樣品：由成都通威水產(chǎn)科技有限公司提供。

1.2 檢測(cè)方法

采用張鳳枰等方法[14]，參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.168-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪酸的測(cè)定》[15]進(jìn)行。

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

十三烷酸內(nèi)標(biāo)溶液制備方法：準(zhǔn)確稱(chēng)取500 mg十三烷酸標(biāo)準(zhǔn)品（準(zhǔn)確至0.1 mg），用甲醇溶解并定容至50 mL，得到10.0 mg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，儲(chǔ)存于4℃冰箱備用。

1.2.2 樣品前處理

1.2.2.1 酸水解提取

裂殖壺菌培養(yǎng)物樣品粉碎，混合均勻，稱(chēng)取0.5 g（精確至0.000 1 g），置于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入10 mg/mL十三烷酸內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，然后加入6 mol/L的鹽酸溶液10 mL，混勻后置于60℃的恒溫震蕩水槽，震蕩頻度100次/min，時(shí)間30 min，取出后沸水浴5 min后，立即放入-20℃冰箱中冷凍8 h。冷凍消融后加入20 mL 三氯甲烷-甲醇（1∶1，體積比）混合溶劑，漩渦混勻2 min，然后8 000 r/min離心5 min，取氯仿層，加入等體積的0.1%氯化鈉溶液，混勻，再次離心，將氯仿層移至干燥的250 mL磨口三角瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得到油脂提取物。

1.2.2.2 油脂的皂化甲酯化

在所得油脂提取物的250 mL磨口三角瓶中加入0.5 mol/L的NaOH-CH3OH溶液10 mL，置于100℃水浴上回流20 min后立即加入7 mL 13%～15%的BF3-CH3OH于沸騰的溶液中，繼續(xù)煮沸，回流10 min。加入20 mL正己烷于沸騰的混合溶液中，停止加熱，然后加入10 mL飽和氯化鈉溶液，漩渦混合1 min，靜置分層，移取3 mL上清液于潔凈試管中，加入適量無(wú)水硫酸鈉脫水，移取1 mL上層脫水溶液于樣品瓶中待測(cè)備用。

1.2.3 氣相色譜條件

色譜柱型號(hào)：Supelco SPTM-2560石英毛細(xì)管柱，100 m×0.25 mm×0.20 μm；汽化室溫度設(shè)置：250℃；檢測(cè)器溫度設(shè)置：260℃；色譜柱初始溫度設(shè)置60℃，然后以每分鐘4℃升溫到160℃，再以每分鐘2℃升溫到240℃；載氣：高純度氮?dú)?；分流比設(shè)置10∶1；色譜柱流速每分鐘1.0 mL；尾吹流速每分鐘40 mL；氫氣流的速設(shè)置每分鐘35 mL；空氣的流速設(shè)置每分鐘350 mL；進(jìn)樣量為 1 μL。

1.2.4 測(cè)定

氣相色譜設(shè)備按上述條件設(shè)置，待氣相色譜基線穩(wěn)定后，分別進(jìn)樣檢測(cè)標(biāo)樣、試樣溶液，進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)分析。以峰的保留時(shí)間定性，內(nèi)標(biāo)法計(jì)算DHA的含量。

1.3 測(cè)量模型

式中：X為裂殖壺菌培養(yǎng)物中DHA的含量，mg/100 g；Fi為DHA校正因子；Ai為DHA氣相色譜的出峰面積積分；AC13為十三烷酸甲酯的氣相色譜出峰面積積分；CC13為十三烷酸內(nèi)標(biāo)溶液濃度，mg/mL；VC13為加入的十三烷酸內(nèi)標(biāo)溶液量，mL；m為裂殖壺菌培養(yǎng)物質(zhì)量，g；1.065 6為十三烷酸的甲酯化的轉(zhuǎn)化系數(shù)；0.959 0為DHA甲酯變成DHA的轉(zhuǎn)化系數(shù)。

2 結(jié)果與討論

裂殖壺菌培養(yǎng)物DHA含量的氣相色譜內(nèi)標(biāo)法檢測(cè)過(guò)程有6個(gè)環(huán)節(jié)引入了不確定度，分述如下：

2.1 校正因子測(cè)定環(huán)節(jié)

以脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，用氣相色譜做六次平行檢測(cè)，用1.3模型公式計(jì)算校正因子，6次測(cè)定數(shù)值分別為 1.046 1、1.041 3、1.050 7、1.044 6、1.042 9、1.043 3。

標(biāo)準(zhǔn)不確定度采用平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差：

十三烷酸甲酯和二十二碳酸六烯酸甲酯的純度均為99.9%，最大允差為0.1%。計(jì)算它們引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（IS1）和urel（ISP）：

重復(fù)測(cè)定過(guò)程中產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.2 裂殖壺菌培養(yǎng)物樣品稱(chēng)量環(huán)節(jié)

試驗(yàn)所用萬(wàn)分之一電子分析天平的不確定度為0.05 mg，按測(cè)量不確定度B類(lèi)評(píng)定，均勻分布，K=計(jì)算由裂殖壺菌培養(yǎng)物樣品稱(chēng)量環(huán)節(jié)產(chǎn)生的不確定度：

校正因子測(cè)定環(huán)節(jié)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.3 十三烷酸內(nèi)標(biāo)溶液配制環(huán)節(jié)

試驗(yàn)所用的十三烷酸的純度為99.0%，最大允差為1.0%，按照均勻分布計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

十三烷酸稱(chēng)量所用分析天平與2.2相同，因此十三烷酸標(biāo)準(zhǔn)品稱(chēng)量產(chǎn)生的不確定度：

十三烷酸內(nèi)標(biāo)配制過(guò)程中器量校準(zhǔn)引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（ISV）：體積校準(zhǔn)、定容操作、溫度變化等分別引入 3 個(gè)分量 urel1（V）、urel2（V）和 urel3（V），3個(gè)分量的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（V）計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1[16，17]。

表1 單標(biāo)線吸量管、單標(biāo)線容量瓶的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Table 1 The relative standard uncertainty of suction pipet and volumetric flask

試驗(yàn)中使用50 mL容量瓶引起的體積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

綜上，計(jì)算十三烷酸內(nèi)標(biāo)溶液配制環(huán)節(jié)引入的相對(duì)不確定度：

2.4 內(nèi)標(biāo)使用環(huán)節(jié)

使用1 mL吸量管加入十三烷酸內(nèi)標(biāo)環(huán)節(jié)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.5 重復(fù)檢測(cè)環(huán)節(jié)

裂殖壺菌培養(yǎng)物平行檢測(cè)6次，結(jié)果是每百克樣品中含 DHA 的毫克數(shù)分別是 719.0、684.0、693.0、702.5、715.3、669.0，平均值為697.1，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.6 加標(biāo)回收試驗(yàn)環(huán)節(jié)

加標(biāo)回收試驗(yàn)按3個(gè)水平，每個(gè)水平做2個(gè)重復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

重復(fù)檢測(cè)環(huán)節(jié)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

表2 樣品回收率測(cè)定值Table 2 The result of spike recovery

計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

加標(biāo)回收試驗(yàn)環(huán)節(jié)引入相對(duì)測(cè)量不確定度：

2.7 合成總不確定度

由以上6個(gè)環(huán)節(jié)的不確定度計(jì)算合成不確定度

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc（X）：

uc（X）=ucrel（X）×X=9.8 mg/100 g

各分量不確定度按正態(tài)分布分析處理，根據(jù)正態(tài)分布，包含因子k=2，對(duì)應(yīng)包含概率p=95%，擴(kuò)展不確定度U計(jì)算結(jié)果如下：

U=k×uc（X）=19.6 mg/100 g

2.8 測(cè)量不確定度報(bào)告

裂殖壺菌培養(yǎng)物中的DHA含量：X=（697.1±19.6）mg/100 g，k=2

2.9 討論

以各不確定度分量值做圖進(jìn)行直觀分析，如圖1所示。

圖1 測(cè)量不確定度分量示意圖Fig.1 Distribution diagram of each component of uncertainty

試驗(yàn)過(guò)程中重復(fù)測(cè)定環(huán)節(jié)所引入的不確定度分量（1.12%）最大，稱(chēng)量操作環(huán)節(jié)引入的不確定度分量（0.005 8%）最小。前者是后者的193倍。十三烷酸內(nèi)標(biāo)溶液配制、內(nèi)標(biāo)添加量、回收率、校正因子等分量不確定度介于0.15%和0.58%之間，各分量數(shù)值相差不大，但也不容忽視。本試驗(yàn)結(jié)果與張鳳枰[14]研究結(jié)果相一致。通過(guò)以上分析，可以看出實(shí)驗(yàn)手工操作部分帶來(lái)的不確定度相對(duì)較大，提示我們操作人員在檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)注意提高實(shí)驗(yàn)操作技能，降低相關(guān)不確定度分量。

3 結(jié)論

根據(jù)氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定裂殖壺菌培養(yǎng)物中DHA含量的檢測(cè)方法和原理，建立數(shù)學(xué)模型，通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)評(píng)定得出：裂殖壺菌培養(yǎng)物DHA含量的重復(fù)測(cè)定環(huán)節(jié)所引入的不確定度分量最大，稱(chēng)量操作環(huán)節(jié)最小，前者是后者的193倍；樣品中DHA含量檢測(cè)值697.1 mg/100 g，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度9.8 mg/100 g，擴(kuò)展不確定度19.6 mg/100 g。

[1]Judge M P,Cong X,Harel O,et al.Maternal consumption of a DHA-containing functional food benefits infant sleep patterning：An early neurodevelopmental measure[J].Early Human Development,2012,88(7):531-537

[2]Minns L M,Kerling E H,Neely M R,et al.Toddler formula supplemented with docosahexaenoic acid(DHA）improves DHA status and respiratory health in a randomized,double-blind,controlled trial of US children less than 3 years of age[J].Prostaglandins Leukotrienes and Essential Fatty Acids,2010,82(4/6):287-293

[3]Swanson D,Block R,Mousa S A.Omega-3 fatty acids EPA and DHA：health benefits throughout life[J].Advances in Nutrition(Bethesda,Md.）,2012,3(1):1-7

[4]Hamazaki T,Itomura M,Sawazaki S,et al.Anti-stress effects of DHA[J].BioFactors(Oxford,England),2000,13(1/4):41-45

[5]Olsen Y,Evjemo J O,Kj?rsvik E,et al.DHA content in dietary phospholipids affects DHA content in phospholipids of cod larvae and larval performance[J].Aquaculture,2014,428/429:203-214

[6]Villalta M,Estévez A,Bransden M P,et al.The effect of graded concentrations of dietary DHA on growth,survival and tissue fatty acid profile of Senegal sole(Solea senegalensis)larvae during the Artemia feeding period[J].Aquaculture,2005,249(1/4):353-365

[7]Wu A,Ying Z,Gomez-Pinilla F.The salutary effects of DHA dietary supplementation on cognition,neuroplasticity,and membrane homeostasis after brain trauma[J].Journal of Neurotrauma,2011,28(10):2113-2122

[8]Yang H L,Lu C K,Chen S F,et al.Isolation and characterization of Taiwanese heterotrophic microalgae：Screening of strains for docosahexaenoic acid(DHA)production[J].Marine Biotechnology,2010,12(2):173-185

[9]Fedorova-Dahms I,Marone P A,Bauter M,et al.Safety evaluation of DHA-rich Algal Oil from Schizochytrium sp.[J].Food and Chemical Toxicology,2011,49(12）：3310-3318

[10]Tang S,Qin C,Wang H,et al.Study on supercritical extraction of lipids and enrichment of DHA from oil-rich microalgae[J].Journal of Supercritical Fluids,2011,57(1):44-49

[11]ISO/IEC.Guide 98-3-2008 Guide to the expression of uncertainty in measurement[S].日內(nèi)瓦：國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織標(biāo)準(zhǔn)ISO,2008

[12]中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì).CNAS-GL05：2011測(cè)量不確定度要求的實(shí)施指南 [S].北京：中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì),2011

[13]中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員.CNAS-GL06：2006化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南[S].北京:中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員,2006

[14]張鳳枰,曹靜,杜雪莉,等.魚(yú)丸中DHA含量測(cè)量不確定度評(píng)定.[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2015(11):234-239

[15]中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì),國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局．GB 5009.168-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪酸的測(cè)定[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2016

[16]杜雪莉,饒瑾瑜,張鳳枰,等,氣相色譜法測(cè)定水產(chǎn)預(yù)混合飼料中肌醇含量的不確定度評(píng)定[J].中國(guó)漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn),2015(5):61-66

[17]國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局．JJG 196—2006常用玻璃量器檢定規(guī)程[S].北京:中國(guó)計(jì)量出版社,2006